馮 濤，孫嘉卿，張 燦，張康逸?

（1. 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002）

青豆又稱豌豆、荷蘭豆、雪豆，青綠色，干后變?yōu)辄S色。富含鈣、維生素 A、胡蘿卜素、鉀以及人體需要的多種氨基酸，對增強人體新陳代謝功能有十分重要的作用[1]。青豆還有益脾健胃、生津止渴、和中下氣等作用，經(jīng)常食用，對脾胃虛弱、小腹?jié)M脹、煩熱口渴等癥狀均有療效，且一般人群均可食用[2]。由于青豆原料豐富、價格低廉、易于加工、貯藏和運輸，因此在國內(nèi)外市場十分暢銷[3]。除了本幫特色菜中的青豆、青豆醬罐頭、花椒青果粥[4]等產(chǎn)品，隨著人民生活水平的不斷提高以及人們的膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化，人們對鮮食青豆的需求逐漸從單一型向多元型轉(zhuǎn)變[5]。傳統(tǒng)發(fā)酵[6]、混菌發(fā)酵[7]等開始進入人們視線。目前青豆加工業(yè)開發(fā)深度還不夠，對青豆的研究較為單一，主要是營養(yǎng)[8]及品質(zhì)分析[9]，針對不同的處理方式產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)的對比分析研究較少。主要瓶頸被認為是豆類產(chǎn)品加工中所產(chǎn)生的青豆腥味[10]。從理論上闡明不同加工方式對青豆風(fēng)味的影響和主要風(fēng)味物質(zhì)的組成和變化規(guī)律對指導(dǎo)青豆產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

氣相色譜-離子遷移譜法（GC-IMS）是近年來在新興技術(shù)領(lǐng)域興起的熱度較高的氣相分離檢測技術(shù)[11]，該技術(shù)結(jié)合了氣相色譜的高分離能力和離子遷移率光譜（IMS）的快速響應(yīng)、高靈敏度、大氣壓下室溫下即可進行、無需進行預(yù)處理即可提供快速分析，和可變體積進樣的優(yōu)點，又彌補了氣相色譜的低鑒別能力[12]。在食品檢測、鑒別[13]、溯源、分級[14]等各個領(lǐng)域發(fā)展迅速。但是將GC-IMS技術(shù)用來表征不同處理方式下的青豆揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜的研究尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用的青豆采摘時間、采摘成熟度相似，保存方法為冷藏。其不同處理方式見下表1。

1.2 儀器與設(shè)備

FlavourSpec?風(fēng)味分析儀、GC-MS(5975C-7890 A)氣質(zhì)聯(lián)用儀、G4513A16位自動進樣塔：美國安捷倫科技有限公司；50/20 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：美國色譜科公司；MP5002電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；2-辛醇：上海源葉生物科技有限公司。

表1 青豆樣品Table 1 Green bean sample

1.3 實驗方法

1.3.1 GC-IMS測定條件

頂空進樣條件：頂空孵化溫度：40 ℃；孵化時間：15 min；頂空進樣針溫度：45 ℃；進樣量：500 μL；孵化轉(zhuǎn)速：500 rpm。

GC-IMS條件：色譜柱類型：FS-SE-54-CB-1 15 m ID:0.53 mm；柱溫：60 ℃；漂移氣（高純N2，純度≥99.999%）；流速：150 mL/min；IMS探測器溫度：45 ℃。

樣品前處理：稱取2 g樣品，置于20 mL頂空瓶中，40 ℃孵育15 min后進樣。

1.3.2 GC-MS測定條件

樣品前處理：稱取不同處理的青豆樣品各6 g，置于30 mL棕色螺口固相微萃取樣品瓶中，放入80 ℃恒溫水浴鍋中平衡20 min；同時，將固相微萃取頭插入GC-MS儀的進樣口中，在250 ℃條件下老化20 min。然后再將萃取頭插入平衡好的樣品瓶中，在80 ℃恒溫水浴條件下吸附50 min后取出，插入氣相色譜進樣口，解吸6 min。

1.3.3 GC-MS分析條件

色譜條件：色譜毛細管柱為DB-5MS(60 mm×0.32 mm，1 μm)；色譜柱起始溫度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的升溫速率升至180 ℃，再以10 ℃/min的升溫速率升至250 ℃，并保持10 min。載氣為氦氣，載氣流量為0.8 mL/min，壓力為3.29×104Pa，進樣口溫度為250 ℃，運行時間47 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊(electron impact，IE)離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，質(zhì)量掃描范圍為35～450 m/z，溶劑延遲3 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用功能軟件 Laboratory Analytical Viewer和分析軟件和三款插件 Reporter、Gallery Plot、Dynamic PCA以及GC×IMS Library Search對圖譜進行差異分析，通過內(nèi)置的NIST 2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與G.A.S的IMS遷移時間數(shù)據(jù)庫二維定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-IMS檢測下不同處理方式青豆樣品中的風(fēng)味差異

不同處理方式的青豆樣品揮發(fā)性物質(zhì)GC-IMS圖譜見圖1，縱坐標代表氣相色譜的保留時間，橫坐標代表離子遷移時間，橫坐標 1.0處豎線為 RIP峰（反應(yīng)離子峰，經(jīng)歸一化處理）。RIP峰兩側(cè)的每一個點代表一種揮發(fā)性有機物，顏色越深表示濃度越大[15]。結(jié)合以上說明及GC-IMS二維俯視圖可以對不同樣品之間的揮發(fā)性物質(zhì)組成進行直觀比較。與對照青豆相比，預(yù)冷青豆樣品的風(fēng)味譜圖和其較為相似，風(fēng)味物質(zhì)濃度相差不大；譜圖較為相似的漂燙、清洗、速凍三種處理方式下的青豆樣品有了變化，少數(shù)風(fēng)味物質(zhì)濃度有所增加，但對風(fēng)味的影響相對較小，蒸、煮、凍干處理后的青豆風(fēng)味物質(zhì)明顯減少，變化較為明顯；炒制樣品的譜圖中，揮發(fā)性物質(zhì)種類最為豐富、與其他處理方式的青豆差異最大，最為明顯。

圖1 不同處理方式的青豆樣品揮發(fā)性物質(zhì)成分二維譜圖（俯視圖）Fig.1 Two dimensional spectrum of volatile compounds in green beans samples with different treatment methods (top view)

2.2 GC-IMS檢測下不同處理方式青豆樣品風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜對比

為了更具體直觀表現(xiàn)不同樣品、不同過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律和相對含量的比較，我們借助 Gallery Plot插件來繪制揮發(fā)性物質(zhì)的指紋譜圖，直觀且定量地比較不同樣品之間的揮發(fā)性有機物差異。

圖 2中每一行代表一個樣品中選取的全部信號峰，圖中每一列代表同一揮發(fā)性有機物在不同樣品中的信號峰。從圖中可以看出每種樣品的完整揮發(fā)性有機物信息以及樣品之間揮發(fā)性有機物的差異。不同樣品的風(fēng)味物質(zhì)變化在Gallery Plot指紋譜圖更加明顯，每一列是不同樣品中的一種風(fēng)味物質(zhì)，顏色深淺代表濃度高低，通過縱向的比較，不同風(fēng)味物質(zhì)濃度呈現(xiàn)一定的規(guī)律，非常直觀。青豆中部分風(fēng)味物質(zhì)未準確定性，我們以阿拉伯數(shù)字順序編號并放于最后。主要對已準確定性的40種揮發(fā)性成分進行分析，我們把這些物質(zhì)按照醇、醛、酮等進行分類，相同種類的物質(zhì)放在一起，以便分析不同加工過程中，樣品中的風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律。

如圖2A框可以看到，在不同處理方式下青豆中醇類物質(zhì)含量較多，如1-辛烯-3-醇、2-丙醇、戊醇等，在對照、速凍、清洗、漂燙、預(yù)冷的操作工藝下含量最多，尤其是清洗工藝下，在炒制和凍干的處理工藝下醇類物質(zhì)明顯減少。如圖2B框所示，醛類物質(zhì)如壬醛、反-2-己烯醛、辛醛等物質(zhì)在速凍青豆樣品中濃度最高，其次是蒸煮的處理方式。如圖2C框所示，酮類物質(zhì)如2-庚酮、3-羥基-2-丁酮等在經(jīng)炒制凍干處理后含量有較大的提高。如圖2D框所示，乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異戊酯等酯類物質(zhì)在速凍處理中含量最多，經(jīng)蒸、煮、炒制、凍干處理后較少。

2.3 GC-MS 和GC-IMS兩種不同檢測方式下不同處理方式青豆樣品風(fēng)味物質(zhì)對比

表2，3分別為GC-IMS和GC-MS所分析出的9種不同處理方式下的青豆的主要風(fēng)味物質(zhì)。

圖2 不同處理方式的青豆樣品Gallery Plot指紋譜圖Fig.2 Gallery plot fingerprint of green beans samples with different treatment methods

表2 G C-IMS分析顯示9種不同處理方式下的青豆揮發(fā)性物質(zhì)峰面積Table 2 Peak area of volatile compounds of green beans under 9 different treating methods via GC-IMS

續(xù)表2

表3 G C-MS分析顯示不同處理方式下的青豆主要風(fēng)味物質(zhì)的相對含量（相對內(nèi)標物2-辛醇的濃度）Table 3 GC-MS analysis shows the relative content of main flavor compounds(relative internal standard n-octanol concentration) in different treatment methods %

續(xù)表3

通過對比分析不同處理方式下青豆的共有風(fēng)味物質(zhì)，由圖3韋恩圖發(fā)現(xiàn)，GC-MS和GC-IMS共同檢測出的風(fēng)味物質(zhì)一般為5～7種，多為壬醛、1-辛烯-3-醇、正己醛、苯甲醛、甲基庚烯酮、反-2-辛烯醛、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪、苯乙烯等化合物，推測其為青豆的主要風(fēng)味物質(zhì)。具體的：正己醛、苯甲醛、壬醛、1-辛烯-3-醇為九種不同處理方式下兩種不同檢測方法均共有的風(fēng)味物質(zhì)；預(yù)冷和凍干青豆中兩種檢測方法共同檢出的風(fēng)味物質(zhì)還有苯乙烯；對照、清洗、預(yù)冷青豆在兩種檢測方法下均檢測到甲基庚烯酮，與GC-IMS單獨檢測結(jié)果中經(jīng)凍干處理后酮類物質(zhì)含量增加的結(jié)果較為一致，除對照、清洗青豆外，其他處理方式在兩種不同檢測方式下得共有化合物還有反-2-辛烯醛，與本研究GC-IMS單獨檢測中對照青豆醛類物質(zhì)含量最低結(jié)果一致，說明在經(jīng)過加工處理后的青豆醛類物質(zhì)和種類的含量都會增加。而炒制后的青豆在兩種檢測方式下的獨有化合物為烘烤風(fēng)味較重的 2-乙基-3，5-二甲基吡嗪，也表明其為炒制青豆的特征風(fēng)味，作為典型的油脂氧化產(chǎn)物，其香氣特征為豆香和蔬菜樣[16]。在GC-MS檢測結(jié)果中，2-甲基-6-乙烯基吡嗪、3-乙基-2，5-甲基吡嗪等雜環(huán)化合物產(chǎn)生，且 3-乙基-2，5-甲基吡嗪、2，5-二甲基-3-(3-甲基丁基)吡嗪的百分含量較高?？芍?，雜環(huán)類化合物對炒制青豆風(fēng)味的影響較大。

圖3 不同處理方式下GC-MS和GC-IMS的風(fēng)味韋恩圖Fig.3 Venn diagram of flavor of GC-MS and gc-ims under different treatment methods

在 GC-MS分析出的風(fēng)味物質(zhì)中，結(jié)合表 4的OAV值，得出以下結(jié)論。

醛類中，速凍青豆的醛類化合物種類最多且每種OAV值較高，其次是預(yù)冷和蒸煮。以在兩種檢測方式檢測重合性較高的正己醛、苯甲醛為例，除速凍、預(yù)冷和蒸煮之外的工藝處理下其醛類物質(zhì)種類及含量都明顯較少，這與本研究指紋圖譜中的結(jié)論基本一致。在對玉米不同處理方式對風(fēng)味影響的研究中，我們發(fā)現(xiàn)醛類物質(zhì)主要在蒸煮過程中大量生成，而對于青豆，其在溫度較低的速凍以及預(yù)冷的處理方式下醛類物質(zhì)含量和種類也較多，該類成分被認為主要是不飽和脂肪酸的自動氧化和水解的產(chǎn)物[17]。

酮類一般被認為呈脂香和焦香香氣，并且隨著碳鏈增長呈現(xiàn)出增強的花香氣息。在凍干處理下較明顯的產(chǎn)生了 3，5-辛二烯酮、beta-紫羅蘭酮等酮類物質(zhì)。該酮類物質(zhì)是由于類胡蘿卜素（植物烯或植物氟烯）發(fā)生氧化反應(yīng)和縮合反應(yīng)而生成的[18]。

醇類中，以1-辛烯-3-醇為例，很明顯經(jīng)過蒸煮以及炒制處理后，青豆中醇類物質(zhì)的含量驟減。這可能來源于脂氧合酶對部分脂肪酸的氧化作用、醇脫氫酶對部分醛類物質(zhì)的還原作用、酯類物質(zhì)水解反應(yīng)的結(jié)果。酯類物質(zhì)是脂肪氧化產(chǎn)生的游離脂肪酸和醇相互作用形成的，由于對香氣貢獻不大，OAV值較小且差異不明顯，己酸甲酯、苯甲酸甲酯、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸甲酯、棕櫚酸乙酯等雖然相對含量較少，但在不同種處理方式中均有發(fā)現(xiàn)，后續(xù)可考慮香氣重組缺失實驗對其香氣貢獻值進行更細致的評估，故未在表中列出。

表4 G C-MS檢測下9中不同處理方式的青豆OAV值大于3的風(fēng)味物質(zhì)Table 4 Flavor compounds with OAV value greater than 3 detected by GC-MS

綜上，可以根據(jù)不同種化合物的總體含量初步對青豆的處理方式進行判斷。

2.4 不同處理方式下青豆樣品的香氣輪廓圖

對9種不同處理方式下的青豆中OAV值大于100的風(fēng)味化合物結(jié)合其風(fēng)味特征，采用八個感官描述詞來評價其香氣：綠色脂肪、苦杏仁樣、玫瑰甜香、蠟狀醛香、蘑菇干草香、柑橘果香、蔬菜青香、辛辣干柏油，在OAV值相差不大的情況下按照相對含量建立表5，并繪制香氣輪廓圖。

從圖4中可以看出，經(jīng)不同方式處理的青豆在蠟狀醛香的香氣方向比較接近，且均以蠟狀醛香和脂肪青香為主。蠟狀醛香主要由3，5-辛二烯酮、反-2-癸烯醛、壬醛、癸醛、反-2-己烯醛等醛酮類化合物貢獻，脂肪青香主要是因為正己醛、(E)-2-庚烯醛、庚醛、(E，E)-2，4-壬二烯醛、反-2-辛烯醛等所帶來。其中正己醛被認為是豆腥味的典型代表，是亞油酸在脂肪氧合酶作用下發(fā)生酶促反應(yīng)裂解后產(chǎn)生的[19]。

表5 九種青豆八個香氣描述詞的相對含量Table 5 Relative contents of eight aroma descriptors of nine Maize Species %

其中，對照、漂燙、清洗青豆的風(fēng)味輪廓圖較為相似，依舊以蠟狀醛香為主，且含量有所增加，考慮到是加工過程中醛類物質(zhì)增加所致；綠色脂肪、蘑菇干草、以及蔬菜的青香有所增加，貢獻相當，考慮到主要是2-正戊基呋喃等化合物含量增加所致，而2-正戊基呋喃是食品熱加工中美拉德反應(yīng)的典型產(chǎn)物[20]。與上文 OAV值的變化趨勢一致。也有相關(guān)研究將2-戊基呋喃定義為青豆味[21]，可見其對青豆特征風(fēng)味的貢獻較大。速凍和預(yù)冷的青豆風(fēng)味輪廓較為相似，但經(jīng)預(yù)冷處理后風(fēng)味物質(zhì)含量較高，依舊是蠟狀醛香為主。經(jīng)蒸煮工藝后蘑菇干草香有減少的趨勢，考慮到是1-辛烯-3-醇等醇類物質(zhì)較少所致。經(jīng)凍干處理后青豆中的柑橘果香風(fēng)味有所增加，主要是受甲苯、己酸甲酯、(+)-檸檬烯、2-十一烯醛等化合物的影響。炒玉米中由苯甲醛帶來的苦杏仁、堅果香的香氣較明顯[22]，且蠟狀醛香有明顯的減少，與本研究炒制工藝導(dǎo)致醛類物質(zhì)減少的結(jié)論一致。

圖4 9 種青豆樣品的香氣輪廓圖Fig.4 Aroma profile of 9 green beans samples

3 結(jié)論

在對速凍、清洗、漂染、預(yù)冷、蒸、煮、炒、凍干以及對照青豆通過GC-MS分析，共得到207種風(fēng)味物質(zhì)，其中不同處理方式下OAV＞100的關(guān)鍵呈香物質(zhì)主要以正己醛、(E)-2-庚烯醛、苯甲醛、壬醛、癸醛、BETA-環(huán)檸檬醛等五種醛類為主。GC-IMS共檢測出60種物質(zhì)，其中32種在庫中能檢索到對應(yīng)的化合物名稱?？傮w看來，在不同處理方式下青豆所含主要風(fēng)味物質(zhì)是固定的，如，正己醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、正己醛、苯甲醛、甲基庚烯酮、反-2-辛烯醛、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪等在采用兩種分析時均被證明是不同處理方式下青豆的主要風(fēng)味物質(zhì)。但對于不同處理方式的特征風(fēng)味還是有對應(yīng)的變化。初步認為，清洗、漂燙工藝與對照青豆的風(fēng)味差異不大。經(jīng)預(yù)冷、速凍等工藝的處理后，總體青豆香氣輪廓不變，醛、酯類物質(zhì)含量有所增加；在凍干、炒制處理后，醛類物質(zhì)有明顯的降低，且在炒制后吡嗪等雜環(huán)類化合物含量增加。根據(jù)本研究中不同處理方式下關(guān)鍵呈香物質(zhì)的差異，下一階段可結(jié)合相關(guān)加工產(chǎn)生特異性風(fēng)味的工藝進一步進行精細化研究，以尋找最佳的青豆加工方式。