譚曉舒，吳建文，梨貴卿，湯星月，陸順忠，李秋庭*

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530006）

食用植物油脂中含有的油脂伴隨物如植物酚類、維生素E、植物甾醇、礦物質(zhì)、角鯊烯等物質(zhì)對油脂的營養(yǎng)、保健、食療等功能價值有重要影響。油脂伴隨物含量成為評價油脂品質(zhì)和加工方法優(yōu)劣的重要指標。油脂中的植物多酚具有抗氧化、抗炎、抗血栓形成、抗動脈粥樣硬化及舒張血管等功效[1]，亦對油脂本身的氧化穩(wěn)定性起積極作用[2-4]，因此植物多酚是一些功能性、療效性油脂常檢測的成分。

目前廣泛采用的植物油總酚含量的測定方法是1927年Folin等[5]提出的福林酚比色法，其原理為酚類物質(zhì)與福林酚試劑（磷鉬酸-磷鎢酸）在堿性環(huán)境下發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成藍色的還原態(tài)鉬[6]，最大吸收波長在760 nm附近，且吸光值與酚羥基濃度成正比。與高效液相色譜法[7-8]和高效毛細管電泳法[9]相比，福林酚法具有快速、簡單、廉價的優(yōu)點。甲醇、乙醇溶液常作為多酚提取溶劑，一些文獻[10-12]或先用正己烷溶解油樣脫脂再用醇溶液提取酚類。Francesco等[13]在測定火麻油總酚時選用沒食子酸和咖啡酸為標準品，國內(nèi)文獻多用沒食子酸作為標準品[14]，而高麥瑞等[9]以簕菜茶為樣品進行總酚測定時認為單寧酸是福林酚法測總酚的最佳標準品。由于樣品極性的不同，標準品的選擇對測定結(jié)果有影響[15]，因結(jié)果表達的不同，測定結(jié)果可比性低。此外，由于不同來源的植物油脂總酚含量及酚類組成差異較大[6]，容易因加入的碳酸鈉和福林酚試劑的用量及比例不當產(chǎn)生白色的鎢酸鈉沉淀而影響后續(xù)的測定，因此，在福林酚法測定植物油總酚含量的過程中，需要對測定方法進行優(yōu)化。

為充分開發(fā)廣西長壽之鄉(xiāng)的巴馬火麻仁食品，本文以巴馬火麻仁為原料，采用福林酚測定法開展了火麻仁油總酚含量的測定研究，對火麻仁油的多酚提取條件和測定過程進行了優(yōu)化，該測定方法重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，為火麻仁油的酚類油脂伴隨物的進一步研究提供可靠的分析方法，也為其他油脂中的酚類油脂伴隨物的分析測定提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廣西巴馬火麻仁：雙益養(yǎng)生膳品公司，液壓冷榨過濾后存于4℃冰箱內(nèi)并盡快分析；福林酚試劑（生化試劑）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸、單寧酸、咖啡酸（＞98%）均為分析純：羅恩試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外可見分光光度計：日本島津公司；80-2離心機：金壇市儀器廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州市朗博儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多酚提取液的制備

精確移取火麻仁油0.25 mL于10 mL離心管中，分別加入0.5 mL乙醇溶液、甲醇溶液或先加入0.25 mL正己烷溶解脫脂，再加入0.5 mL甲醇溶液，充分振蕩，以4 000 r/min離心15 min，收集上清液，用上述提取溶劑定容至1.5 mL，即得多酚提取液。

1.3.2 對照品儲備液的配制

精確稱取咖啡酸、沒食子酸和單寧酸各10 mg，分別用乙醇溶液溶解后用蒸餾水定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL的對照品儲備液。

1.3.3 Folin-Ciocalteu分光光度測定法

參照申元福[16]的方法并做適當改動，分別取對照品儲備液及樣品溶液各0.5 mL于10 mL比色管中，先后加入2.5 mL稀釋10倍的福林酚試劑（0.1 mol/L）、2.0 mL7.5%的碳酸鈉溶液，充分混勻，黑暗處反應(yīng)1 h，用紫外可見分光光度計在765 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)，根據(jù)標準曲線計算樣品中的總酚的含量，結(jié)果表示為沒食子酸（gallic acid equivalents，GAE）當量濃度，即μg GAE/mL。

1.3.4 火麻仁油總酚提取條件的優(yōu)化

1.3.4.1 提取溶劑的研究

準確移取火麻仁油0.25 mL，分別用0.5 mL 80%甲醇、乙醇與油樣混勻2 min，或加入0.25 mL正己烷振蕩溶解油樣1 min，再加入0.5 mL 80%甲醇混勻2 min，以4 000 r/min離心15 min，重復(fù)提取兩次后合并水相，分別定容至1.5 mL，按照1.3.3方法進行測定；以上步驟平行3次，根據(jù)測定結(jié)果確定提取溶劑。

1.3.4.2 提取溶劑濃度的研究

準確移取火麻仁油0.25 mL，分別用0.5 mL 65%、70%、75%、80%、85%溶劑（1.3.4.1中確定）提取多酚，離心及后續(xù)步驟同1.3.4.1，平行3次，確定提取溶劑濃度。

1.3.4.3 提取溫度的研究

準確移取火麻仁油0.25 mL，用0.5 mL確定濃度的溶劑（1.3.4.2）在一定溫度的水浴中進行提取，基于文獻[17]及已有試驗基礎(chǔ)，提取時水浴溫度分別設(shè)定為25、50、75℃，冷卻后離心及后續(xù)步驟同1.3.4.1，平行3次，確定提取溫度。

1.3.5 火麻仁油總酚測定條件的優(yōu)化

1.3.5.1 檢測波長的研究

分別移取0.5 mL多酚對照品儲備液和火麻仁油多酚提取液，按照1.3.3方法進行反應(yīng)，在665 nm～865 nm范圍處測定吸光值（采樣間距50 nm），平行3次，以確定最佳檢測波長[16]。

1.3.5.2 福林酚試劑用量的研究

移取0.5 mL對照品儲備液和多酚提取溶液，分別加入 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 福林酚試劑（0.1 mol/L）及2.0 mL質(zhì)量濃度為7.5%的Na2CO3溶液，充分混勻，于暗處反應(yīng)1 h，在檢測波長處（1.3.5.1）測定吸光度，平行3次，確定福林酚試劑的用量。

1.3.5.3 Na2CO3溶液用量的研究

移取0.5 mL對照品儲備液和多酚提取溶液，分別加入確定用量的福林酚試劑（1.3.5.2），再加入1.5、2.0、2.5、3.0 mL 7.5% Na2CO3溶液，其余操作同 1.3.5.2，平行3次，確定7.5% Na2CO3溶液的用量。

1.3.5.4 試劑加入間隔時間的研究

移取0.5 mL對照品儲備液和多酚提取溶液，加入選定用量的福林酚試劑（1.3.5.2），分別放置 0、3、5、10、15 min后，再加入確定用量的Na2CO3溶液（1.3.5.3），其余操作同1.3.5.2，平行3次，確定試劑加入的間隔時間。

1.3.5.5 暗反應(yīng)時間的研究

移取0.5 mL對照品儲備液和多酚提取溶液，在以上確定的條件下，將暗反應(yīng)時間設(shè)為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，其余操作同1.3.5.2，平行3次，確定暗反應(yīng)時間。

1.3.6 方法學(xué)評價

以沒食子酸為標準品，繪制標準曲線，計算樣品總酚含量，評價此優(yōu)化方法的線性關(guān)系、準確性等。

1.3.6.1 標準曲線繪制

準確移取沒食子酸儲備液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，用乙醇溶液稀釋成質(zhì)量濃度為 10、20、30、40、50、60、70、80 μg/mL 的溶液。按照“1.3.5”優(yōu)化的測定法操作，以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.6.2 加標回收率計算

配制10 mg/mL的沒食子酸溶液，準確移取0.25 mL多酚質(zhì)量濃度已知的火麻仁油3份，通過加入沒食子酸溶液分別向已知油樣中加入沒食子酸300、400、500 μg，用0.5 mL 80%的乙醇提取3次，合并提取液定容至1.5 mL，按優(yōu)化后的條件測定吸光度，計算總酚含量，根據(jù)總檢出量減去樣液含量再除以加標量計算回收率，再計算RSD（%），試驗平行3次。

1.3.6.3 重復(fù)性

準確移取0.25 mL火麻仁油6份，按照已優(yōu)化的多酚提取和測定條件操作，測定并計算火麻仁油總酚含量，考察測定方法的重復(fù)性。

1.3.6.4 穩(wěn)定性

準確移取0.25 mL火麻仁油，按照已優(yōu)化的多酚提取和測定條件操作，避光放置0～3 h，每隔0.5 h測定一次吸光度，計算RSD，分析該方法在一定時間內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 25.0統(tǒng)計分析，通過Origin 2017繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 火麻仁油總酚提取方法的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的研究

不同溶劑提取火麻仁油中的總酚的結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，80%乙醇溶液對火麻仁油多酚的提取效果較為理想，以沒食子酸當量來計為2 971.89 μg GAE/mL火麻仁油。試驗過程中用正己烷溶解油樣后油樣的顏色變淺，再用甲醇溶液提取多酚時，多酚提取液與油樣顏色接近，且較為渾濁，液體分層不明顯，除雜除脂作用不佳，此結(jié)果與申元福[16]的研究結(jié)論相似。而用80%甲醇提取火麻仁油中的多酚，約為80%乙醇提取的總酚的1/3。Antonella等[18]用反向高效液相色譜-二極管陣列-熒光檢測法對火麻仁油中的酚類物質(zhì)進行定性，發(fā)現(xiàn)其中含41.74%的4′，5，7-三羥基黃酮（柚皮素），柚皮素是一種疏水性黃酮類化合物[19-20]，幾乎不溶于水，可溶于乙醇[21]，甲醇比乙醇的極性大，可知乙醇對柚皮素等疏水性黃酮化合物的提取效果較好，與本試驗結(jié)果一致，故選擇乙醇為火麻仁油多酚類物質(zhì)的提取溶劑。

圖1 不同溶劑對火麻仁油總酚的提取效果Fig.1 Extraction effects of different solvents on total phenols of hemp seed oil

2.1.2 溶劑濃度的研究

不同溶劑濃度對火麻仁油進行多酚提取的結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同濃度乙醇對火麻仁油總酚的提取效果Fig.2 Extraction effects of different concentrations of ethanol on total phenols in hemp seed oil

由于濃度為85%的乙醇溶液對火麻仁油進行多酚提取時，按步驟加入福林酚試劑后體系變渾濁，未達到測定吸光值需澄清透明的要求，考慮為福林酚試劑的醇溶性隨乙醇濃度的增加而降低，故舍棄85%這一濃度提取結(jié)果。

由圖2可知，隨著乙醇濃度的增加，酚類物質(zhì)的提取效果越好，而用80%乙醇提取時，多酚含量顯著升高，測定結(jié)果為3 110.21 μg GAE/mL火麻仁油，是用65%乙醇溶液提取的總酚含量的兩倍，且反應(yīng)后的溶液仍澄清透明，符合測定吸光值的要求，故選取80%作為乙醇提取濃度。

2.1.3 提取溫度的研究

不同溫度提取火麻仁油中的總酚的結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取溫度對火麻仁油總酚含量的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on total phenol content of hemp seed oil

由圖3可知，在75℃下，提取的總酚含量僅為2 201.13 μg GAE/mL火麻仁油，考慮為在75℃附近，火麻仁油的酚類物質(zhì)部分進行熱分解，使得總酚含量降低。25℃下和50℃下，多酚提取效果相近，約為3 168.19 μg GAE/mL火麻仁油。在相近的提取效果下，出于經(jīng)濟和便捷的考慮，選擇25℃作為火麻仁油的總酚提取溫度。

2.2 火麻仁油總酚測定條件的優(yōu)化

2.2.1 測定波長研究

沒食子酸、單寧酸、咖啡酸對照品儲備液及火麻仁油多酚提取液在665 nm～765 nm范圍內(nèi)以50 nm為采樣間距進行吸光度測定，不同波長下的測定結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，對照品儲備液的吸光值在665 nm～765 nm范圍內(nèi)緩慢上升，765 nm后吸光值緩慢下降，變化幅度較?。ā鰽≤0.1），而火麻仁油多酚提取液的吸光度值隨波長的變化較為明顯（△A≤0.4），可見，單體酚與多酚混合物對波長的變化敏感度不同，這一結(jié)果與申元福等[16]的結(jié)論類似。由圖4可知，沒食子酸、單寧酸、咖啡酸對照品儲備液及火麻仁油多酚提取液均在765 nm處有最大吸收值，故選取765 nm作為檢測波長。

圖4 樣品與對照品溶液福林酚反應(yīng)后不同波長下的掃描結(jié)果Fig.4 Scanning results of sample and reference solutions at different wavelengths after reacting with Foin-Ciocalteu reagent

2.2.2 福林酚試劑用量研究

把未經(jīng)稀釋的福林酚加入火麻仁油多酚提取液后易產(chǎn)生白色沉淀，且該沉淀加酸未產(chǎn)生氣泡，考慮該沉淀為福林酚試劑中的鎢酸鈉，因其在乙醇中的溶解度較低，根據(jù)前期試驗經(jīng)驗，將福林酚試劑稀釋10倍使用。0.5 mL多酚提取液及對照品儲備液內(nèi)分別加入1.5 mL～4.0 mL的福林酚試劑，顯色反應(yīng)后的吸光度測定結(jié)果如圖5所示。

圖5 福林酚試劑用量對吸光度的影響Fig.5 Effects of the amount of Folin reagent on the absorbance

由圖5可知，3.5 mL福林酚試劑分別與火麻仁油多酚提取液及單寧酸儲備液反應(yīng)，吸光度最大。而對于單體酚，1.5 mL福林酚試劑已能將儲備液中的咖啡酸及沒食子酸反應(yīng)完全。Antonella等[18]、許春芳等[11]測定的火麻仁油的多酚提取物中含有柚皮素、染料木素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、表兒茶素、柚皮苷-7-O-葡萄糖苷等多種類型酚物質(zhì)，考慮對種類豐富的多酚進行福林酚反應(yīng)需要較多的福林酚試劑，3.5 mL福林酚試劑已與火麻仁油多酚提取液反應(yīng)完全，繼續(xù)增大福林酚試劑的用量反而稀釋了反應(yīng)生成的藍色絡(luò)合物，吸光度降低，故選取3.5 mL稀釋10倍的福林酚試劑作為福林酚用量。

2.2.3 碳酸鈉用量研究

在對照品儲備液和火麻仁油多酚提取液中分別加入一定量的碳酸鈉溶液，其吸光度的測定結(jié)果如圖6所示。

圖6 7.5%碳酸鈉溶液用量對吸光度的影響Fig.6 Effects of 7.5% Na2CO3on absorbance

由圖6可知，對照品儲備液吸光度的測定值隨碳酸鈉的增加而減少，考慮1.5 mL 7.5%碳酸鈉已能保證3種對照品體系的堿性環(huán)境，繼續(xù)增加碳酸鈉的用量時稀釋了體系中藍色絡(luò)合物，故吸光值下降。而碳酸鈉對火麻仁油的多酚提取液的影響不同，由圖6可知，其他條件固定的情況下加入7.5%碳酸鈉溶液的量為2.5 mL時，火麻仁油多酚提取液有最大吸光值，故確定7.5%碳酸鈉溶液的最佳用量為2.5 mL。

2.2.4 試劑加入間隔時間研究

福林酚試劑與碳酸鈉溶液加入間隔不同時間對吸光度的影響如圖7所示。

圖7 試劑加入間隔時間對吸光度的影響Fig.7 Effects of reagent addition interval on absorbance

由圖7可知，福林酚試劑與碳酸鈉溶液滴加的間隔時間為0 min時，沒食子酸儲備液反應(yīng)后吸光度測定值最大；對咖啡酸儲備液，間隔時間為15 min時，測得的吸光度最大；隨試劑加入間隔時間的延長，單寧酸儲備液的吸光值緩慢增大；對于火麻仁油多酚提取液，試劑加入間隔10 min時反應(yīng)后樣液的吸光度達到最大值，考慮復(fù)雜多酚及其混合物與福林酚試劑需要較長時間才能到達反應(yīng)終點，而碳酸鈉的作用是為絡(luò)合物的形成提供堿性環(huán)境，到達反應(yīng)終點后碳酸鈉溶液加入越遲，吸光度越小，根據(jù)結(jié)果選擇10 min作為試劑加入的間隔時間。

2.2.5 暗反應(yīng)時間研究

試樣及對照品顯色反應(yīng)避光處理不同的時間，吸光度的測定結(jié)果如圖8所示。

圖8 暗反應(yīng)時間對吸光度的影響Fig.8 Effects of dark reaction time on absorbance

由圖8可知，樣品的多酚提取液與咖啡酸和沒食子酸儲備液均在暗反應(yīng)1.0 h時有最大吸光值，而后吸光值達到平衡，單寧酸儲備液最大吸光值出現(xiàn)在暗反應(yīng)1.5 h時?？紤]暗反應(yīng)時間與酚類分子的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，單寧酸不是單體酚的簡單堆疊，縮合單寧酸分子中黃烷醇的2位通過碳-碳鍵與兒茶酚或苯三酚結(jié)合，整體有類似于網(wǎng)狀的空間結(jié)構(gòu)，使酚羥基暴露較為緩慢?？Х人岷蜎]食子酸均僅有一個苯環(huán)平面和一個羧基碳鏈，空間結(jié)構(gòu)較為簡單，易于酚羥基的暴露和進一步反應(yīng)。許春芳等[11]研究結(jié)果指出，巴馬火麻仁油中含有 238 μg/100 g 4′，5，7-三羥基異黃酮（染料木素）；Antonella等[18]亦指出火麻仁油中含有41.74%的 4′，5，7-三羥基黃酮（柚皮素），這兩者分子結(jié)構(gòu)上均有3個距離較近的酚羥基，與沒食子酸相似，故樣液暗反應(yīng)達到終點的時間與沒食子酸儲備液相近。計算時吸光度的微小差距可導(dǎo)致總酚含量數(shù)值差異較大，因此確定本試驗中火麻仁油多酚提取液暗反應(yīng)時間為1.0 h。

2.3 方法學(xué)評價

從單因素試驗結(jié)果可以看出，火麻仁油多酚提取液與單寧酸儲備液出現(xiàn)吸光度最大值時福林酚試劑的使用量相同（3.5 mL）；與沒食子酸和咖啡酸儲備液吸光度最大值時暗反應(yīng)的時間相同（1.0 h），故3種標準品僅在特定單因素下與樣液顯色情況相近?？紤]咖啡酸溶液和單寧酸溶液均呈淺棕色，沒食子酸溶液為無色，且前期試驗中發(fā)現(xiàn)單寧酸和咖啡酸溶液的穩(wěn)定性較差，久置后有少量晶體析出，故選擇沒食子酸為標準品進行所優(yōu)化方法的評價。

2.3.1 標準品與吸光度線性關(guān)系

以沒食子酸為標準品，根據(jù)已優(yōu)化的測定條件繪制濃度為 10、20、30、40、50、60 、70、80 μg/mL 的標準曲線，得到線性回歸方程：y=0.009 2x（r2=0.998 6），其中y為吸光度，x為沒食子酸濃度（μg/mL）?？梢?，沒食子酸濃度在10 μg/mL～80 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好。

2.3.2 加標回收率

以沒食子酸為標準品，按低、中、高劑量向已知總酚含量的0.25 mL火麻仁油樣品中加入一定量的沒食子酸溶液（10 mg/mL），再對加標后樣品進行總酚含量測定，與未加標樣品進行對照，加標回收率/%=（加標后油樣測定值-油樣測定值）/加標量×100，結(jié)果如表1所示。

表1 加標回收率試驗Table 1 Results of recovery experiments with spiked samples

由表1可知，平均加標回收率為104.41%，RSD為1.98%，說明該優(yōu)化方法用于測定火麻仁油總酚含量較準確。

2.3.3 重復(fù)性

同一火麻仁油樣品取樣6次，對其進行多酚提取和總酚含量測定，結(jié)果表示為沒食子酸當量濃度，即μg GAE/mL，該優(yōu)化方法的重復(fù)性結(jié)果見表2。

由表2可知，重復(fù)測定同一火麻仁油樣品的總酚含量，其平均值為3 432.12 μg/mL，測定值的RSD為2.20%，故該方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性試驗Table 2 Results of repeatability experiments

2.3.4 穩(wěn)定性

該方法的穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗Table 3 Results of stability experiments

由表3可知，同一火麻仁油樣品測定總酚含量后的0～3 h內(nèi)，其吸光度平均值為0.536，RSD為0.92%，可見此方法穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

本文對火麻仁油的總酚提取和福林酚法測總酚的條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明：對比了甲醇、乙醇及文獻報道的先用正己烷溶解油脂除雜再加甲醇的酚類物質(zhì)提取效果，探究了溶劑濃度和提取溫度對酚類提取的影響，結(jié)果表明在室溫（25℃）下用80%乙醇進行3次提取火麻仁油中總酚的提取效果最好。以火麻仁油多酚提取液及3種常用標準品（咖啡酸、單寧酸、沒食子酸）為考察對象，對福林酚反應(yīng)的檢測波長、福林酚試劑用量、7.5%質(zhì)量濃度的碳酸鈉溶液用量、試劑加入間隔時間和暗反應(yīng)時間進行了優(yōu)化，得到優(yōu)化后的測定條件是：檢測波長765 nm，0.1 mol/L福林酚試劑3.5 mL，7.5%碳酸鈉2.5 mL，試劑加入間隔時間10 min，暗反應(yīng)時間1 h。對優(yōu)化方法以沒食子酸為標準品進行評價，結(jié)果表明沒食子酸在 10 μg/mL～80 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好：y=0.009 2x+0.0000（r2=0.9986），該方法測得加標回收率為（104.41±1.98）%；同一樣品重復(fù)測定6次的RSD為2.20%，重復(fù)性良好；0～3 h內(nèi)測定吸光度RSD為0.92%，穩(wěn)定性良好，該方法可作為火麻仁油總酚含量測定的有效方法。優(yōu)化后的福林酚法測得巴馬火麻仁油的總酚含量為（3 432.28±2.21）μg GAE/mL，為火麻仁油開發(fā)提供有效的數(shù)據(jù)支撐。