李偉，李雙霞，孟元華，李鳳玉，張奇芳，黃勇，牛曉東，朱利利

(1.陸軍第八十一集團(tuán)軍醫(yī)院 a.病理科，b.檢驗(yàn)科，c.腫瘤科，d.麻醉科，河北 張家口 075000； 2.張家口市第一人民醫(yī)院超聲科，河北 張家口 075000； 3.解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心婦科，北京 100700)

乳腺惡性葉狀腫瘤是源自小葉內(nèi)或?qū)Ч苤車(chē)g質(zhì)的惡性改變，發(fā)生率雖然低于乳腺癌，但卻是乳腺惡性間葉性腫瘤中最常見(jiàn)的腫瘤。目前，乳腺惡性葉狀腫瘤的具體病因尚不明確，有資料顯示其發(fā)病不僅與種族、年齡以及地域等因素有關(guān)，可能還與生育哺乳、內(nèi)分泌變化及多基因變異等有關(guān)[1-2]。Piwil2(P-element-induced wimpy testis like 2)蛋白正常僅表達(dá)于胚胎干細(xì)胞和生殖干細(xì)胞，在各種腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系也可見(jiàn)Piwil2的表達(dá)，其已被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞的分子標(biāo)志物[3]，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)。細(xì)胞增生離不開(kāi)細(xì)胞周期的調(diào)控，而細(xì)胞周期調(diào)控的失衡或紊亂則會(huì)引起細(xì)胞的異常增生甚至瘤變。目前，細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1蛋白)被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞周期的重要蛋白之一，其主要功能是調(diào)控細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖[4]，而其持續(xù)異常表達(dá)常與細(xì)胞的異常增殖及腫瘤形成有關(guān)[5]。查閱資料未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白與乳腺惡性葉狀腫瘤相關(guān)的報(bào)道。鑒于此，本研究主要探討Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白在乳腺惡性葉狀腫瘤組織中的表達(dá)及其與臨床病理因素之間的關(guān)系，并分析兩種蛋白之間的相關(guān)性，為闡述乳腺惡性葉狀腫瘤發(fā)生機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集1990年1月至2015年2月在陸軍第八十一集團(tuán)軍醫(yī)院病理科和解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心病理科存檔的60例女性乳腺惡性葉狀腫瘤患者的資料，納入標(biāo)準(zhǔn)：①均為手術(shù)標(biāo)本，且病理診斷明確；②均為首次治療，未進(jìn)行過(guò)放化療等；③均未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非首次手術(shù)患者(復(fù)發(fā))；②病理診斷不明確者。患者年齡32～76歲，平均(52±4)歲；腫瘤直徑7～15 cm，平均(9±1) cm；Ki-67≥25%者49例，<25%者11例；瘤細(xì)胞異型性顯著者48例，不顯著者12例；術(shù)后復(fù)發(fā)10例，無(wú)復(fù)發(fā)50例；核分裂象≥15個(gè)/10個(gè)高倍鏡視野者29例，<15個(gè)/10個(gè)高倍鏡視野者31例；所有患者均未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，均為首次接受根治性手術(shù)治療。同期選取60例正常乳腺組織為對(duì)照組，患者年齡25～38歲，平均(30±2)歲。兩組研究對(duì)象年齡等一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)陸軍第八十一集團(tuán)軍醫(yī)院和解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑和方法 濃縮型鼠抗人單克隆抗體Piwil2購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，按1∶200稀釋濃度滴加標(biāo)本；即用型兔抗人單克隆抗體CyclinD1蛋白購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司；采用羅氏全自動(dòng)免疫組化機(jī)(美國(guó))及配套試劑進(jìn)行染色操作。具體操作步驟如下：石蠟防脫片切片(4 μm)，組織漂烘儀(湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司)65 ℃烤片1 h，雀巢全脂牛奶浸泡15 min，放入羅氏全自動(dòng)免疫組化機(jī)，99 ℃修復(fù)1 h，再將預(yù)先配置好的Piwil2(1∶200)、CyclinD1 一抗滴入標(biāo)本，30 min，加標(biāo)記過(guò)的二抗，9 min，顯色 8 min，洗潔精洗片，梯度乙醇脫水，中性樹(shù)膠封片。采用朗珈圖像分析系統(tǒng)分析(Ver1.0)，奧林巴斯BX53顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)下觀察和分析免疫組織化學(xué)(En VisionTM)染色結(jié)果。

1.3結(jié)果判斷 Piwil2蛋白表達(dá)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍鏡視野，并依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。①胞膜和胞質(zhì)染色呈棕黃色或棕褐色，按基本不著色、著色淡、著色適中、著色深分別為記為0、1、2、3分；②染色細(xì)胞百分率評(píng)分按著色細(xì)胞計(jì)數(shù)≤5%為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、≥51%為3分；③上述兩項(xiàng)得分相乘為其最后得分，即：0～1分為陰性，≥2分為陽(yáng)性。CyclinD1蛋白表達(dá)結(jié)果判斷：胞核染色為棕黃色或褐色為陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞≥10%為陽(yáng)性，無(wú)染色細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞<10%為陰性[7]。

1.4觀察指標(biāo) ①Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白在乳腺惡性葉狀腫瘤組織及正常乳腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)情況；②Piwil2蛋白、CyclinD1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與乳腺惡性葉狀腫瘤臨床病理因素的關(guān)系；③乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2蛋白的表達(dá)與CyclinD1蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPPS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白在乳腺惡性葉狀腫瘤組織和正常乳腺組織中的表達(dá)情況 染色結(jié)果顯示，Piwil2蛋白著色于細(xì)胞質(zhì)。在60例乳腺惡性葉狀腫瘤組織中有53例Piwil2蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為88.33%；在正常乳腺組織中不表達(dá)Piwil2蛋白，見(jiàn)圖1。CyclinD1蛋白著色于細(xì)胞核。在60例乳腺惡性葉狀腫瘤組織中46例CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為76.67%；在正常乳腺組織中不表達(dá)CyclinD1蛋白，見(jiàn)圖2。

2.2Piwil2蛋白、CyclinD1蛋白表達(dá)與乳腺惡性葉狀腫瘤臨床病理因素的關(guān)系 腫瘤直徑≥9 cm、Ki-67≥25%、瘤細(xì)胞異型顯著以及核分裂象≥15個(gè)/10個(gè)高倍鏡視野的患者Piwil2蛋白的表達(dá)水平高于腫瘤直徑<9 cm、Ki-67<25%、瘤細(xì)胞異型不顯著以及核分裂象<15個(gè)/10個(gè)高倍鏡視野者(P<0.05)，不同年齡、術(shù)后是否復(fù)發(fā)患者的Piwil2蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Ki-67≥25%、瘤細(xì)胞異型性顯著及核分裂象≥15個(gè)/10個(gè)高倍鏡視野者CyclinD1蛋白的表達(dá)水平高于Ki-67<25%、瘤細(xì)胞異型不顯著以及核分裂象<15個(gè)/10個(gè)高倍鏡視野者(P<0.05)，不同年齡、腫瘤直徑及術(shù)后是否復(fù)發(fā)患者的CyclinD1蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2蛋白的表達(dá)與CyclinD1蛋白的表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Spearman分析顯示，在乳腺惡性葉狀腫瘤組織中，Piwil2蛋白的表達(dá)與CyclinD1蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r= 0.413，P<0.01)。

3 討 論

乳腺惡性葉狀腫瘤是由良性的上皮成分和惡性的間質(zhì)成分構(gòu)成，其診斷標(biāo)準(zhǔn)包括細(xì)胞浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，細(xì)胞密集增生、異型性，核分裂象≥10個(gè)/10個(gè)高倍鏡視野，可有壞死或出血[8]。目前，部分學(xué)者認(rèn)為乳腺惡性葉狀腫瘤來(lái)自原始間葉細(xì)胞，但也有學(xué)者認(rèn)為是成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞[9]。乳腺惡性葉狀腫瘤的組織病理學(xué)通常表現(xiàn)為纖維肉瘤改變，但也可有異源性分化，如脂肪肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤等，提示瘤細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞多向分化的潛能。

1a:乳腺惡性葉狀腫瘤組織，陽(yáng)性表達(dá)；1b：正常乳腺組織，陰性表達(dá)

2a:乳腺惡性葉狀腫瘤組織，陽(yáng)性表達(dá)；2b：正常乳腺組織，陰性表達(dá)

表1 Piwil2蛋白、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與乳腺惡性葉狀腫瘤臨床病理因素的關(guān)系 [例(%)]

Piwil蛋白在多種細(xì)胞進(jìn)程中起重要作用，如干細(xì)胞自我更新、RNA沉默、精子發(fā)生、翻譯調(diào)節(jié)、染色質(zhì)重塑等。到目前為止，人類(lèi)Piwil家族中4個(gè)成員已被識(shí)別，分別為Piwil1、Piwil2、Piwil3、Piwil4[10]，其中Piwil2僅表達(dá)于正常人體的睪丸和造血干細(xì)胞[11]。何朝輝等[6]研究發(fā)現(xiàn)，膀胱尿路上皮癌組織中Piwil2蛋白的表達(dá)明顯高于正常組織，與臨床分期相關(guān)，并影響膀胱尿路上皮癌的生物學(xué)行為，且有可能成為高風(fēng)險(xiǎn)膀胱癌患者的預(yù)后指標(biāo)[12]。也有研究顯示，Piwil2蛋白參與了乳腺癌、肝癌、前列腺癌等多種腫瘤的形成、發(fā)展[13-15]，其通過(guò)激活內(nèi)源性RNA干擾，活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3/Bcl-XL和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3/CyclinD1蛋白兩個(gè)重要的細(xì)胞信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡及誘導(dǎo)擴(kuò)增[16]。

瘤細(xì)胞的分裂、增殖離不開(kāi)細(xì)胞周期的調(diào)控，作為G1期細(xì)胞增殖信號(hào)的關(guān)鍵蛋白——CyclinD1蛋白，通過(guò)與周期素依賴(lài)蛋白激酶4/6形成復(fù)合物，磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白，然后后者釋放轉(zhuǎn)錄因子E2Fs，從而縮短由G1期進(jìn)入S期的時(shí)間，參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、促進(jìn)細(xì)胞增殖[17]。如果CyclinD1蛋白過(guò)表達(dá)，細(xì)胞增殖異常則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞失控性增殖，進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生[18]。在胃癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌等[19-21]組織中均發(fā)現(xiàn)CyclinD1蛋白的表達(dá)高于相應(yīng)的正常黏膜組織。吳曉明等[22]研究發(fā)現(xiàn)，CyclinD1蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于正常組織，且表達(dá)與病理學(xué)分級(jí)有關(guān)，分化越低表達(dá)越高，但與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。本研究結(jié)果顯示，Piwil2蛋白、CyclinD1蛋白在乳腺惡性葉狀腫瘤組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，而在正常乳腺組織無(wú)表達(dá)，這表明Piwil2蛋白、CyclinD1蛋白在乳腺惡性葉狀腫瘤組織存在異常表達(dá)，可能參與了乳腺惡性葉狀腫瘤的形成。

Ki-67是一種較為肯定的細(xì)胞增殖相關(guān)核抗原，其功能與細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞增殖有關(guān)，其高表達(dá)提示細(xì)胞分裂和增殖能力強(qiáng)。權(quán)明吉等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)與Borrmann分型、組織分化、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，其表達(dá)水平有助于判斷胃癌的惡性程度及侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在非小細(xì)胞肺癌中，Ki-67表達(dá)越低，患者的中位生存期越高[23]。本研究結(jié)果顯示，乳腺惡性葉狀腫瘤中Ki-67≥25%、瘤細(xì)胞異型顯著以及核分裂象≥15個(gè)/10個(gè)高倍鏡視野的患者Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高，提示Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)的瘤細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的分裂、增殖能力，更有利于瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲。乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2蛋白的表達(dá)與CyclinD1蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，提示Piwil2蛋白的表達(dá)可能通過(guò)激活某種信號(hào)通路，進(jìn)而活化CyclinD1蛋白，共同實(shí)現(xiàn)了瘤細(xì)胞的增殖。

綜上所述，Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白的過(guò)表達(dá)參與了乳腺惡性葉狀腫瘤的形成，其表達(dá)水平可作為評(píng)判瘤細(xì)胞分裂、增殖的參考指標(biāo)。有研究顯示，通過(guò)沉默Piwil2的表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞的增殖和集落形成能力均降低，細(xì)胞衰老數(shù)量也明顯增多[24]。沉默CyclinD1蛋白的表達(dá)后，肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，凋亡率上升[25]。推測(cè)Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白有可能成為乳腺惡性葉狀腫瘤靶向治療的潛在靶點(diǎn)，待今后需進(jìn)一步深入研究。