黃子彧，劉昭偉，周 毅，劉 勝，羅 亮，胡博尊，羅 柱，戴林建

（1.株洲煙草公司茶陵分公司，湖南 茶陵 412400；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

自1967 年，Bourgin 和Nitsch 成功利用煙草花藥得到單倍體植株以來(lái)，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了許多對(duì)煙草花藥培養(yǎng)的研究工作，不斷優(yōu)化培養(yǎng)過(guò)程[1-2]?；ㄋ幣囵B(yǎng)的誘導(dǎo)頻率受多個(gè)因素的影響，如基因型、培養(yǎng)條件、花粉發(fā)育時(shí)期、培養(yǎng)基等[3-6]。陳春艷等[7]認(rèn)為4℃低溫預(yù)處理48 h 能顯著提高花藥胚狀體的誘導(dǎo)率。賈永炯[8]的研究發(fā)現(xiàn)在含0.4～0.8 mg/L 2,4-D 的Nitsch培養(yǎng)基上胚狀體發(fā)生頻率有所提高。李春玲等[9]與王立浩等[10]考察了不同碳源及其濃度對(duì)花藥胚狀體誘導(dǎo)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3%的蔗糖對(duì)花藥的誘導(dǎo)率最高。劉仁祥等[11]對(duì)活性炭、大量元素與微量元素之間的關(guān)系做了研究，發(fā)現(xiàn)活性炭能平衡大量元素和微量元素之間的關(guān)系，從而促進(jìn)胚狀體的形成。

響應(yīng)面法（Response surface methodology，RSM）是一種優(yōu)化反應(yīng)條件的有效方法，RSM 是數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計(jì)方法結(jié)合的產(chǎn)物，用于對(duì)受多個(gè)變量影響的問(wèn)題進(jìn)行建模和分析，其最終目的是優(yōu)化響應(yīng)值。RSM 最先應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)領(lǐng)域，后來(lái)隨著研究的深入和擴(kuò)展，逐漸應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)以及食品學(xué)領(lǐng)域[12-14]。響應(yīng)面法能系統(tǒng)地優(yōu)化反應(yīng)條件，分析各因素間的互作效應(yīng)。前人的試驗(yàn)多是研究某單一因素對(duì)花藥誘導(dǎo)頻率的影響，并且關(guān)于采用響應(yīng)面法優(yōu)化煙草花藥培養(yǎng)的報(bào)道尚不多見(jiàn)。因此，筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，以IAA、6-BA 以及大量元素濃度為考察對(duì)象，采用響應(yīng)面法，試圖找到誘導(dǎo)煙草花藥胚狀體的最佳條件，為優(yōu)化煙草花藥培養(yǎng)體系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試煙草品種為雜交品種♂凈葉黃×♀HKDN-5，其中HKDN-5 是由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院煙草專業(yè)戴林建副教授自育的高鉀烤煙材料。雜交組合于2019年3 月移栽至湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園基地，采用常規(guī)田間管理方法，2019 年5 月下旬開(kāi)始現(xiàn)蕾。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌材料獲得 晴天摘取花冠與花萼等長(zhǎng)或花冠微微露出的花蕾（此時(shí)花藥中的小孢子處于單核靠邊期），4℃冰箱中預(yù)處理一定天數(shù)后，將花蕾放入超凈臺(tái)進(jìn)行消毒。消毒步驟：無(wú)菌水沖洗2 次；75%酒精漂洗30 s，無(wú)菌水沖洗3 次；20%次氯酸鈉和少量吐溫20 浸泡15 min，無(wú)菌水漂洗4 次；置于無(wú)菌濾紙上除濕。用已消毒的鑷子撥開(kāi)花冠，小心取出花藥，接種于培養(yǎng)皿中。

1.2.2 大量元素濃度與外源激素添加量對(duì)花藥胚狀體誘導(dǎo)的影響 為了優(yōu)化煙草花藥胚狀體誘導(dǎo)的培養(yǎng)基體系，在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)對(duì)IAA 濃度（A）、6-BA 濃度（B）、大量元素濃度（C）各取3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。大量元素的濃度以MS 培養(yǎng)基的濃度來(lái)體現(xiàn)，設(shè)1/4MS，1/2MS和MS這3種基本培養(yǎng)基，外源激素IAA與6-BA分別設(shè)0.1、0.5、1 mg/L 這3 個(gè)濃度梯度；共有17 個(gè)組合（表1），每個(gè)組合重復(fù)3 次取平均值，若產(chǎn)生污染，則重新接種以保持每個(gè)組合均有3 個(gè)重復(fù)。在基本培養(yǎng)基中加入3%的蔗糖、0.7%瓊脂，pH 值調(diào)至5.8。暗培養(yǎng)一周后移入光照條件下培養(yǎng)，在上述條件下培養(yǎng)45 d 后統(tǒng)計(jì)花藥胚狀體及愈傷組織的誘導(dǎo)率。

1.2.3 誘導(dǎo)力的測(cè)定 花藥接種后3 d 觀察其污染情況，及時(shí)清除污染的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)45 d 調(diào)查花藥胚狀體與愈傷組織的誘導(dǎo)率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

以IAA（A）、6-BA（B）、MS 濃度（C）3 個(gè)因素作為變量，以胚狀體誘導(dǎo)率（Y1）、愈傷組織誘導(dǎo)率（Y2）作為響應(yīng)量，數(shù)據(jù)通過(guò)design-expert 8.0.6.1軟件處理分析并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草花藥胚狀體誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.1.1 試驗(yàn)結(jié)果回歸分析 對(duì)表1 的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到花藥胚狀體誘導(dǎo)率（Y1）對(duì) IAA濃度（A）、6-BA 濃度（B）和大量元素濃度（C）的二次多項(xiàng)回歸方程模型：Y1=-6.633 72+88.919 79 A1+46.261 79 B1+50.376 26 C1-18.604 15 A1B1+26.264 18 A1C1-2.252 19 B1C1-95.993 52 A12-37.075 73 B12-55.719 37。愈傷組織誘導(dǎo)率（Y2）對(duì)A、B 和C 的二次多項(xiàng)回歸方程模型：Y2=-31.531 47+35.988 44 A1+59.713 87 B1+78.585 74 C1+42.389 21 A1B1+27.745 66 A1C1-7.013 49 B1C1-46.429 03 A12-59.566 47 B12-67.576 11 C12。

由表2 和表3 可知，無(wú)論是以Y1還是Y2作為響應(yīng)量，模型都呈極顯著（P ＜0.01），僅有0.1%與0.29%的可能性是由未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成干擾。這說(shuō)明模型與實(shí)際情況擬合較好，可用于分析花藥胚狀體和愈傷組織的誘導(dǎo)情況。由表2 可知，一次項(xiàng)A、B 和C 均達(dá)顯著水平（P ＜0.05），二次項(xiàng) A2、B2和 C2均達(dá)極顯著水平，說(shuō)明IAA 與6-BA 及大量元素的濃度對(duì)煙草花藥胚狀體的誘導(dǎo)均有顯著影響；2 種激素濃度交互項(xiàng)差異顯著，說(shuō)明這2 個(gè)因素的交互作用亦會(huì)對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著影響。除此之外，IAA 與大量元素濃度間也存在互作效應(yīng)，二者的交互項(xiàng)差異也達(dá)顯著水平。分析表3 可得，對(duì)煙草花藥愈傷組織誘導(dǎo)而言，IAA 與6-BA 的濃度對(duì)其有顯著影響；而大量元素濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響則沒(méi)有前二者顯著，IAA 與6-BA 交互項(xiàng)差異顯著，說(shuō)明這2 個(gè)因素的交互作用亦對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)有顯著影響。

表2 胚狀體誘導(dǎo)（Y1）回歸方程模型的方差分析結(jié)果

2.1.2 響應(yīng)面分析 由多元回歸方程所作響應(yīng)面曲線圖及等高線圖可以直觀地反映IAA、6-BA 和大量元素的濃度（MS 濃度）對(duì)煙草花藥胚狀體與愈傷組織誘導(dǎo)的影響。由圖1～6 可知，IAA 的濃度對(duì)胚狀體和愈傷組織誘導(dǎo)的影響最顯著，曲線面最陡；6-BA 濃度和大量元素濃度對(duì)胚狀體和愈傷組織誘導(dǎo)的影響較小，曲線面趨于平緩；在以胚狀體誘導(dǎo)率為響應(yīng)量的分析中，各因素所選范圍內(nèi)均存在極值點(diǎn)；在愈傷 組織誘導(dǎo)率為響應(yīng)量的分析中，IAA 的濃度仍有上升空間。

表3 愈傷組織誘導(dǎo)（Y2）回歸方程模型的方差分析結(jié)果

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該模型及測(cè)定結(jié)果的可靠性，設(shè)定胚狀體誘導(dǎo)率盡可能大，對(duì)方程篩選出的最優(yōu)條件（0.49 mg/L IAA+0.48 mg/L 6-BA+0.56 MS，此條件下胚狀體誘導(dǎo)率的預(yù)測(cè)值為40.52%）進(jìn)行10 次試驗(yàn)，煙草花藥胚狀體誘導(dǎo)率的平均值為36.80%，與預(yù)測(cè)值僅相差3.72 個(gè)百分點(diǎn)，說(shuō)明該模型較為可靠。

圖1 IAA 濃度和6-BA 濃度對(duì)胚狀體誘導(dǎo)影響的響應(yīng)面圖與等高線

圖2 IAA 濃度和MS 濃度對(duì)胚狀體誘導(dǎo)影響的響應(yīng)面圖與等高線

圖3 6-BA 濃度和MS 濃度對(duì)胚狀體誘導(dǎo)影響的響應(yīng)面圖與等高線

圖4 IAA 濃度和6-BA 濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響的響應(yīng)面圖與等高線

圖5 IAA 濃度和MS 濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響的響應(yīng)面圖與等高線

圖6 6-BA 濃度和MS 濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響的響應(yīng)面圖與等高線

3 討 論

對(duì)于培養(yǎng)條件的優(yōu)化，傳統(tǒng)常用的方法有單因素試驗(yàn)法與正交試驗(yàn)法。單因素試驗(yàn)常用于確定某個(gè)因素的使用范圍，方法簡(jiǎn)單，結(jié)果明了，也是其他試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)，但采用此種試驗(yàn)方式容易忽略組分間的交互作用，導(dǎo)致最適宜條件丟失[15]。正交試驗(yàn)法雖研究多因素、多水平的組合，但只能對(duì)一個(gè)個(gè)孤立的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析，并不能在給出的整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式。而該研究采用的響應(yīng)面法在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)多元二次回歸模型擬合各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，具有試驗(yàn)次數(shù)少、回歸方程精度高等特點(diǎn)，同時(shí)能克服正交試驗(yàn)只能處理離散水平值，而無(wú)法找出最佳組合和響應(yīng)值的缺陷[16-17]。

利用響應(yīng)面法能精確分析幾個(gè)因素之間是否對(duì)花藥胚狀體的誘導(dǎo)具有互作效應(yīng)。該研究結(jié)果表明，試驗(yàn)選取的3 個(gè)因素的確對(duì)煙草花藥胚狀體誘導(dǎo)有顯著影響。其中，IAA 和6-BA 這2 種激素的濃度對(duì)胚狀體誘導(dǎo)的影響尤為顯著，且2 種激素間存在互作關(guān)系，同時(shí)互作關(guān)系對(duì)胚狀體與愈傷組織誘導(dǎo)的影響也能達(dá)到顯著水平。

關(guān)于胚狀體誘導(dǎo)率預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間相差3.72個(gè)百分點(diǎn)的情況，可能是由于煙草為無(wú)限花序，采集的花藥小孢子處于單核靠邊期，但不同開(kāi)花時(shí)期（如現(xiàn)蕾期和盛花期）花藥小孢子的活力可能有所差別[18]，導(dǎo)致驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果低于預(yù)測(cè)值。不過(guò)，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間的差異并不大，且誘導(dǎo)率水平均較高，因此總的來(lái)講該模型可用于煙草花藥胚狀體誘導(dǎo)進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面法得到IAA 濃度、6-BA 濃度、大量元素濃度三者對(duì)煙草花藥胚狀體誘導(dǎo)率與愈傷組織誘導(dǎo)率的二次多項(xiàng)回歸方程模型，方差分析結(jié)果顯示該方程能很好地解釋花藥胚狀體誘導(dǎo)率隨各參數(shù)變化的規(guī)律。

優(yōu)化后的最佳條件為0.49 mg/L IAA+0.48 mg/L 6-BA+0.56 MS，胚狀體的誘導(dǎo)率為36.80%。為了便于實(shí)際操作，可采取0.50 mg/LIAA+0.50 mg/L 6-BA+1/2 MS 的條件進(jìn)行試驗(yàn)。