徐珒昭，湯夢琪，徐境含，滕國新，許曉曦*

1(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150030)2(內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特，011500)

隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展，居民飲食結(jié)構(gòu)隨之改變，由高鹽飲食因素引起的高血壓與相關(guān)心血管疾病在我國發(fā)病率極高[1]。腸道菌群作為人體生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其對于維持人體生理功能方面具有非常重要的作用[2]。高鹽飲食會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)鈉潴留，顯著提升高血壓、心腦血管病和胃癌等疾病發(fā)病率，同時(shí)還對腸道菌群存在一定不良影響[3-4]。大量研究報(bào)道在臨床與動(dòng)物模型中，高鹽飲食會(huì)造成機(jī)體炎癥水平增加、腸道免疫屏障破壞和上調(diào)高血壓特征菌群等有害菌豐度等不良影響[5-6]。

焦谷氨酸廣泛存在于動(dòng)植物界[7]，在腦脊液、血液、組織液和多種器官中以游離形式存在，參與合成神經(jīng)降壓素、促甲狀腺素釋放激素等物質(zhì)[8]，對神經(jīng)功能改變、腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移具有預(yù)防作用，并且是體內(nèi)許多生物活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)核心[9]。研究表明膳食中攝入一定量焦谷氨酸可以顯著增加乙酰膽堿受體數(shù)量、增強(qiáng)大腦記憶力和認(rèn)知能力[10]，還可以通過控制胰島素抵抗起到抗糖尿病作用[11]。腸道菌群與人類健康關(guān)系的研究越來越深入，但目前國內(nèi)外研究學(xué)者對焦谷氨酸對腸道菌群的作用仍少有探究。因此本實(shí)驗(yàn)通過探究焦谷氨酸對高鹽飲食小鼠腸道健康和腸道微生物菌群的影響，豐富對焦谷氨酸潛在功能的了解認(rèn)知，為焦谷氨酸這一原料在功能性食品領(lǐng)域的應(yīng)用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BALB/c健康雄性SPF級小鼠45只，4周齡，體重17.4～20.8 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK(京)2016—0006。實(shí)驗(yàn)中對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置均遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》規(guī)定。

標(biāo)準(zhǔn)飼料(D12450B)，中國北京科奧協(xié)力飼料有限公司；L-焦谷氨酸、NaCl(均為分析純)，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；IL-1、IL-6、TNF-α、ELISA試劑盒，南京建成生物工程研究所。

BX60光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯公司；3K15高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma 公司；XS105電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Varioskan Flash全波長多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠分組

選擇4周齡健康雄性BALB/c小鼠45只，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房環(huán)境[室內(nèi)溫度(22±2)℃，相對濕度(30±2)%]，循環(huán)光照條件12 h光照/12 h黑暗)下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，適應(yīng)性飼養(yǎng)期間自由進(jìn)食飲水，第8天早晨停食，5 h后稱體重，按體重隨機(jī)分為3組，每組15只：Con組(空白對照組，正常飲食)，NaCl組(高鹽對照組，灌胃NaCl 100 mg/(kg BW·d)，PCA-Na組(焦谷氨酸組，灌胃焦谷氨酸21 mg/(kg BW·d)[9,11]，灌胃NaCl 100 mg/(kg BW·d)，各組間小鼠體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。連續(xù)喂養(yǎng)5周，試驗(yàn)期間動(dòng)物自由攝食、飲水。

1.2.2 樣品采集

乙醚麻醉后，75%(體積分?jǐn)?shù))酒精處理小鼠身體并轉(zhuǎn)移至超凈工作臺內(nèi)解剖，酒精棉球擦凈小鼠腹部消毒后打開腹腔完整分離腸道，取小鼠空腸2.5 cm置于2 mL 離心管中，保存于-80 ℃冰箱，取盲腸、直腸內(nèi)容物于滅菌后的凍存管中，液氮速凍保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 小腸蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色

取出用10%(體積分?jǐn)?shù))中性福爾馬林固定的空腸樣品制成石蠟切片，隨后進(jìn)行HE染色，置于顯微鏡下進(jìn)行圖像采集，100倍下測量空腸絨毛高度(villus height，VH)和隱窩深度(crypt depth,CD)，進(jìn)行病理學(xué)分析。

1.2.4 直腸糞便中白蛋白含量

取小鼠直腸中已成型糞便，稱重后加入9倍PBS溶液，3 000 r/min條件下離心20 min后分離上清液，采用小鼠白蛋白酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定小鼠糞便中白蛋白的含量。

1.2.5 小腸細(xì)胞因子檢測

取小鼠空腸組織稱重后加入9倍PBS溶液，3 000 r/min條件下離心20 min后分離上清液，參考ELISA試劑盒說明書，檢測小腸IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

1.2.6 小鼠盲腸內(nèi)容物菌群16S rDNA高通量測序

小鼠盲腸內(nèi)容物樣品從-80 ℃冰箱取出后放入干冰內(nèi)寄送到奧維森基因科技有限公司，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)過程：首先利用糞便DNA基因組提取試劑盒從小鼠盲腸內(nèi)容物中提取總基因組DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，選擇16S rDNA基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收目標(biāo)片段擴(kuò)增產(chǎn)物。參照瓊脂糖凝膠電泳定量結(jié)果，將PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個(gè)樣本的測序量需求，對各樣本按相應(yīng)比例進(jìn)行混合。構(gòu)建MiSeq PE測序文庫后采用Illumina MiSeq平臺測序。通過QIIME軟件在0.97相似度下對樣本進(jìn)行運(yùn)算分類單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類和物種注釋。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示各個(gè)組數(shù)據(jù)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 HE染色觀察焦谷氨酸對高鹽飲食小鼠小腸形態(tài)的影響

本研究中各組小鼠小腸病理學(xué)染色結(jié)果如圖1所示?？瞻讓φ战M小鼠小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見水腫、壞死、炎性細(xì)胞浸潤等病理變化，腸絨毛上皮完整，小腸腺腺體排列整齊。高鹽對照組小鼠小腸組織黏膜層內(nèi)部分血管擴(kuò)張，腸絨毛上皮細(xì)胞少量水腫、細(xì)胞腫脹。焦谷氨酸組小鼠小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，腸絨毛上皮完整，小腸腺腺體排列整齊。小腸是動(dòng)物體消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所之一，絨毛上皮細(xì)胞可以將腸腔中的糖類、氨基酸、無機(jī)鹽等物質(zhì)吸收進(jìn)入體液循環(huán)，供動(dòng)物體利用[12]。各組小鼠小腸絨毛長度及隱窩深度如表1所示。高鹽對照組小鼠小腸絨毛高度下降(P<0.05)，表明過多的Na+攝入會(huì)在一定程度上損害小腸結(jié)構(gòu)，而焦谷氨酸可以改善高鈉攝入引起的腸道絨毛損傷，維持腸道結(jié)構(gòu)形態(tài)。

a-對照組；b-高鹽對照組；c-焦谷氨酸組

表1 焦谷氨酸對高鹽飲食小鼠小腸絨毛高度和隱窩深度的影響 單位：μm

2.2 高鹽飲食小鼠糞便中白蛋白含量的影響

白蛋白是血漿內(nèi)最主要的蛋白質(zhì)，參與營養(yǎng)和維持機(jī)體滲透壓功能。通過測定白蛋白從血液滲漏到腸黏膜上皮間質(zhì)或腸腔的水平，可以從側(cè)面評價(jià)腸黏膜通透性，腸腔中白蛋白滲漏量可以作為一種十分便捷的方法表征腸道屏障通透性功能的改變。本研究中各組小鼠小腸糞便中白蛋白的含量如圖2所示。

圖2 高鹽飲食小鼠糞便中白蛋白含量的影響

與空白對照組相比，高鹽對照組小鼠糞便中白蛋白含量顯著升高(P<0.05)，焦谷氨酸組與空白對照組無顯著差異(P>0.05)。腸道免疫系統(tǒng)的紊亂基本都伴有腸道屏障通透性功能的變化，本研究表明，高鹽飲食可會(huì)引起腸道通透性功能損傷，焦谷氨酸可以抵抗大量Na+攝入引起的腸道功能性改變，維持機(jī)體健康。

2.3 焦谷氨酸對高鹽飲食小鼠小腸中IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影響

本研究中焦谷氨酸對高鹽對照組小鼠小腸中IL-1β、IL-6和TNF-α含量影響測定結(jié)果如圖3所示。與空白對照組相比，高鹽對照組小鼠小腸組織中IL-1β、IL-6和TNF-α含量(P<0.05)；焦谷氨酸組小鼠小腸組織中IL-1β、IL-6和TNF-α含量與空白對照組無顯著差異(P>0.05)。

圖3 焦谷氨酸對高鹽飲食小鼠小腸中IL-1、IL-6和TNF-α含量的影響

結(jié)果表明，單獨(dú)攝入大量Na+時(shí)會(huì)損傷腸黏膜屏障功能，腸組織受病原微生物入侵，激活炎癥反應(yīng)，使IL-1β、IL-6及TNF-α 3種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)增加。焦谷氨酸對腸免疫功能具有顯著影響，抑制高鹽飲食引起的小鼠小腸中炎癥介質(zhì)的表達(dá)[13]，這與GANG等[9]研究結(jié)果一致，焦谷氨酸可以一定程度的抑制腸道炎癥反應(yīng)，改善高鹽飲食小鼠腸道健康。

2.4 焦谷氨酸對高鹽飲食小鼠盲腸中腸道菌群α-多樣性的影響

α-多樣性是指通過對單個(gè)樣品的多樣性分析反映微生物群落的豐富度和均勻度[14]。本研究中采用物種飽和度曲線和α-多樣性指數(shù)(Observed species、Chao1、Shannon和Simpson指數(shù))評估各樣本的α-多樣性。物種飽和度曲線如圖4所示。

圖4 物種飽和度曲線

物種飽和度曲線是分析微生物多樣性的一種常見方法，可以從物種豐富度和物種均勻度兩方面體現(xiàn)α-多樣性[15]。由圖4可知，在水平方向上，曲線寬度正向反映物種豐富度；在曲線形狀上，曲線越平滑表示物種均勻度越好，空白對照組豐富度相對較高，各樣品曲線平緩，物種分布均勻。具體數(shù)值如表2所示。

表2 小鼠腸道菌群 α-多樣性指數(shù)

Observed species與Chao1指數(shù)衡量物種豐度，數(shù)值越大越豐富；Shannon與Simpson指數(shù)可從豐富度和均勻度兩方面評價(jià)腸道菌群多樣性，數(shù)值越大說明該樣品中物種越豐富、分配越均勻。如表2所示，高鹽飲食會(huì)使小鼠腸道菌群豐富度和均勻度略有降低，焦谷氨酸則可緩解高鹽飲食對小鼠腸道菌群豐富度和均勻度的影響。

2.5 小鼠盲腸中腸道菌群β-多樣性Unifrac weighted分析

Unifrac分析是利用各樣品間的進(jìn)化信息來比較在特定的進(jìn)化譜系中是否有顯著的微生物群落差異[15]。UniFrac分析中，只考慮序列是否在群落中出現(xiàn)，不考慮序列的豐度。Unifrac weighted分析方法，就是在UniFrac分析的基礎(chǔ)上，將序列的豐度納入考慮，區(qū)分物種豐度的差別，更進(jìn)一步的探究樣品間不同譜系上發(fā)生的變異。如圖5所示，本研究各組小鼠腸道菌群物種及豐度與空白組發(fā)生差異，相同Na+濃度條件下，焦谷氨酸組的腸道菌群結(jié)構(gòu)有向空白對照組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)模式調(diào)整的趨勢。

圖5 聚類樹狀分析圖

綜合α-多樣性和聚類樹狀分析可知，本研究測序數(shù)據(jù)量足夠，可反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息。本試驗(yàn)結(jié)果說明Na+對小鼠腸道菌群物種及豐度均有一定影響，而且焦谷氨酸可以緩解Na+對腸道菌群結(jié)構(gòu)的干擾，使小鼠腸道菌群趨向正常小鼠發(fā)展，焦谷氨酸對小鼠腸道菌群并無顯著不良影響。

2.6 試驗(yàn)小鼠腸道菌群門水平組成分析

如圖6所示，基于門分類水平上各組小鼠腸道菌群物種組成和差異性分析。小鼠腸道菌群于門水平主要由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和脫鐵桿菌門(Deferribacteres)組成。與空白對照組相比，高鹽對照組厚壁菌門豐度顯著降低和擬桿菌門豐度顯著增加(P<0.05)，而焦谷氨酸組中厚壁菌門和擬桿菌門含量幾乎無變化；焦谷氨酸組和高鹽對照組中脫鐵桿菌門豐度呈較低水平；高鹽對照組放線菌門豐度降低，而焦谷氨酸組放線菌門豐度升高。3組比較，發(fā)現(xiàn)焦谷氨酸干預(yù)后，高鹽飲食小鼠腸道菌群有向正常小鼠發(fā)展的趨勢，說明焦谷氨酸對小鼠腸道菌群有良性作用。如圖7所示，擬桿菌門與厚壁菌門比值(B/F)發(fā)生變化，其中高鹽對照組較空白對照組B/F值顯著升高(P<0.05)，而焦谷氨酸組較空白對照組B/F值無明顯差異。此外，各組均能保持變形菌門、軟壁菌門(Tenericutes)和藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)的相對豐度。

圖6 小鼠腸道菌群門水平物種組成分析

圖7 擬桿菌門與厚壁菌門比值(B/F)

2.7 試驗(yàn)小鼠腸道菌群屬水平組成分析

如圖8所示，在屬水平上，選取前40個(gè)優(yōu)勢菌群構(gòu)建柱形圖。由聚類結(jié)果可知，與空白組比較，焦谷氨酸、NaCl組均能維持Family XIII中(AD3011group、UCG-001、brachygroup、nodatumgroup)成員、毛螺旋菌科中(Blautia、GCA-900066575、Lachnoclostridium、LachnospiraceaeNK4A136group)成員的相對豐度恒定。

圖8 小鼠腸道菌群屬水平物種組成分析

如表3所示,與空白組相比，高鹽飲食小鼠腸道組中分節(jié)絲狀菌(CandidatusArthromitus)、毛球菌科中A2、Roseburia和瘤胃球菌科中RuminococcaceaeNK4A214group、Anaerotruncus等相對豐度水平降低且差異顯著(P<0.05)，擬桿菌屬(Bacteroides)、另枝菌屬(Alistipes)和鏈球菌屬(Streptococcus)等相對豐度顯著提高(P<0.05)；焦谷氨酸組中分節(jié)絲狀菌、短桿菌屬(Brevibacterium)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)等益生菌的相對豐度顯著提高(P<0.05)，另枝菌屬等有害菌的相對豐度降低(P<0.05)。同時(shí)焦谷氨酸組其中普雷沃氏菌科UCG-001屬和鏈球菌屬保持穩(wěn)定與空白組豐度接近無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

長期高鹽飲食會(huì)引起機(jī)體腸道滲透壓紊亂，同時(shí)誘導(dǎo)腸細(xì)胞激活p38/cFos和Erk1/2/STAT6等信號通路[16]，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子升高，抗炎因子與細(xì)胞內(nèi)噬相關(guān)因子降低，最終表現(xiàn)為腸道損傷和腸道炎癥[17]。高鹽飲食還會(huì)造成與消化酶及胰腺分泌相關(guān)蛋白的豐度降低，影響小鼠消化吸收功能，使小鼠生長發(fā)育遲緩[18]。焦谷氨酸已被證明可以預(yù)防神經(jīng)性病變、抑制炎癥反應(yīng)和腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，焦谷氨酸干預(yù)可顯著降低高鹽飲食小鼠模型的腸道組織損傷和腸黏膜屏障損傷，顯著提高腸道抗炎癥能力。高鹽飲食小鼠腸道在焦谷氨酸干預(yù)下，健康狀況得到明顯改善，有研究表明，焦谷氨酸可以阻斷葡萄糖受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)離子超載及其引起的聯(lián)級反應(yīng)[19]。本研究結(jié)果顯示焦谷氨酸對小鼠腸道具有一定保護(hù)作用，可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群來發(fā)揮作用。

表3 小鼠腸道菌群屬水平物種組成相對豐度

目前研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群微生態(tài)與代謝性疾病、免疫性疾病和精神性疾病等多種疾病都存在一定聯(lián)系[20]。焦谷氨酸及其類似物俱被證明具有殺蟲、抗菌和抑菌等作用，具有抗HIV-1、HCV活性，能抑制大腸桿菌等革蘭氏陰性菌生長[21]，但目前研究主要針對與焦谷氨酸生產(chǎn)條件優(yōu)化及其復(fù)雜化合物的合成。用使小鼠腸道中擬桿菌門與厚壁菌門比值降低[22]，本研究中高鹽飲食小鼠腸道中擬桿菌門與厚壁菌門比值顯著降低，經(jīng)過焦谷氨酸干預(yù)后比值顯著上升，小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)受到一定調(diào)節(jié)作用。擬桿菌門和厚壁菌門與機(jī)體的營養(yǎng)代謝有著密切關(guān)系，能促進(jìn)宿主體內(nèi)多糖代謝，加快能量的吸收、轉(zhuǎn)化和儲存[23]。有研究表明，高鹽飲食會(huì)使革蘭氏陰性菌等致病菌相對含量增加，其代謝產(chǎn)生的脂多糖會(huì)堆積在腸道中，破壞腸道上皮細(xì)胞之間緊密連接蛋白，隨后進(jìn)入血液循環(huán)對肝臟等器官造成二次傷害[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，高鹽模型小鼠的腸道中擬桿菌屬等革蘭氏陰性菌水平顯著升高，焦谷氨酸可以維持腸道中大多數(shù)革蘭氏陰性菌及其他致病菌豐度與正常小鼠基本一致，一定程度緩解高鹽飲食對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)造成的不良影響。分節(jié)絲狀菌是一種革蘭氏陽性菌，主要定殖在回腸末端上皮細(xì)胞表面，與腸道黏膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性密切相關(guān)[25]，在防御病原微生物感染和誘發(fā)自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮重要作用[26]。本研究結(jié)果表明，高鹽飲食會(huì)降低小鼠腸道內(nèi)分節(jié)絲狀菌數(shù)量，而焦谷氨酸的攝入可以顯著提高其豐度，降低腸道炎癥反應(yīng)，維持黏膜健康。此外，益生菌在腸道內(nèi)具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的修復(fù)和再生和抗過敏等功能[27]。在本研究中，焦谷氨酸攝入后可以顯著提高雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌相對豐度，抵抗高鹽飲食導(dǎo)致的益生菌豐度下降，改善宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)。

總之，本研究不僅驗(yàn)證了高鹽飲食對小鼠健康存在一定危害，同時(shí)證明了焦谷氨酸能夠抵抗和緩解由攝入過量Na+對小鼠腸道健康的影響，同時(shí)對腸道菌群豐度和結(jié)構(gòu)有一定調(diào)整作用，可提高有益菌相對豐度，降低高血壓特征菌群及有害菌豐度等影響，促進(jìn)腸道菌群良性發(fā)展。為焦谷氨酸或作為益生物質(zhì)用以調(diào)控腸穩(wěn)態(tài)提供了一些科學(xué)依據(jù)。