黃昊，哈祖德，顧京賽，楊興華，王兆基，陳雙*，徐巖

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫,214122)2(釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫,214122)3(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫,214122)4(西藏天佑德青稞酒業(yè)有限責(zé)任公司，西藏 拉薩，850000)

西藏傳統(tǒng)青稞酒，藏語叫做“穹chong”，[1]是藏族人民最主要的酒精飲料，至今已有1 000多年的歷史[2]。西藏傳統(tǒng)青稞酒以青藏高原特有的青稞為原料，以藏曲為糖化發(fā)酵劑釀造而成。它的釀造方法是將青稞浸泡后加水煮熟，待其冷卻后加入藏曲，保溫發(fā)酵3 d左右，加水充分浸泡后過濾釀成新鮮可口的傳統(tǒng)青稞酒[3]。該酒酒味酸甜，酒香濃郁，飲后不上頭，不口渴，風(fēng)格獨特，深受青藏高原人民的喜愛，被視作西藏傳統(tǒng)文化的一部分。

藏曲是西藏傳統(tǒng)青稞酒的核心，藏曲是西藏人民按照傳統(tǒng)接種方式以及自己的理解制作而成的西藏傳統(tǒng)青稞酒糖化發(fā)酵劑的統(tǒng)稱[4]。因此藏曲種類豐富，并直接影響青稞酒的風(fēng)味與品質(zhì)，而藏曲中的菌種更是產(chǎn)生西藏傳統(tǒng)青稞酒獨特風(fēng)味的主要因素之一。藏曲中微生物種類復(fù)雜，袁亦舟等[5]用高通量測序鑒定了藏曲中主要的微生物有霉菌，酵母與細菌3類，霉菌主要起糖化作用，而酵母主要起產(chǎn)酒作用。如其他發(fā)酵酒一樣，西藏傳統(tǒng)釀造青稞酒生產(chǎn)中酵母的發(fā)酵作用，貫穿了整個釀造過程[6]。杜木英[7]分離鑒定了藏曲中含有釀酒酵母，扣囊復(fù)膜孢酵母，漢遜德巴利酵母等，他還分別分離篩選了糖化力較強和酒化力較強的酵母。劉清斌等[8]研究不同菌種和不同菌種接種量對青稞酒發(fā)酵的影響時，發(fā)現(xiàn)在青稞酒中釀酒酵母產(chǎn)酒能力最強。酵母菌作為釀酒的一類主要微生物，其作用不僅限于酒精代謝，也發(fā)揮著重要的風(fēng)味代謝功能[9]，然而現(xiàn)在對于傳統(tǒng)釀造青稞酒中酵母風(fēng)味代謝的研究較少，而在其他發(fā)酵酒中研究發(fā)現(xiàn)酵母菌以及混菌發(fā)酵的風(fēng)味代謝對釀酒的品質(zhì)具有重要的影響。唐潔等[10]發(fā)現(xiàn)在清香型白酒中將釀酒酵母與異常畢赤酵母混合發(fā)酵，在保證酵母發(fā)酵性能的前提下，能夠形成更多的酯類物質(zhì)，總酸和高級醇含量卻相對較低，能有效提升發(fā)酵液的風(fēng)味特征。邱并生[11]基于2種酵母混菌發(fā)酵能提升發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味特性這一特點，在小曲白酒的生產(chǎn)上采用了功能酵母純種制曲，提升了白酒的品質(zhì)。陳景樺、許維娜等[12-13]研究了多種酵母以及多種釀酒酵母的混菌發(fā)酵，都能提升葡萄酒的品質(zhì)，使得葡萄酒表現(xiàn)出更復(fù)雜馥郁的特征。張文文等[14]發(fā)現(xiàn)采用東方伊薩酵母和釀酒酵母發(fā)酵楊梅酒能提升發(fā)酵效率，減少澀味，提升品質(zhì)。因此多種酵母混菌發(fā)酵能有效提升酒的品質(zhì)，研究西藏傳統(tǒng)青稞酒中酵母的風(fēng)味代謝功能十分必要。基于現(xiàn)在對于西藏傳統(tǒng)青稞酒釀酒酵母類型以及風(fēng)味代謝功能研究的不足，本文通過可培養(yǎng)方法分離鑒定了不同地域藏曲中的酵母菌，找到了藏曲中的主要酵母菌，并通過模擬發(fā)酵實驗，從產(chǎn)酒和產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)兩個層面全面分析了藏曲中主要酵母菌的釀造功能。這對西藏傳統(tǒng)青稞酒品質(zhì)的科學(xué)控制提供了依據(jù)，也為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藏曲，分別采購生產(chǎn)于拉薩、林芝、日喀則及山南地區(qū)的5種不同形態(tài)藏曲樣品；青稞，由西藏天佑德青稞酒業(yè)有限責(zé)任公司提供。

苯酚、氯仿、KH2PO4、溴甲酚綠、曲拉通、氨芐青霉素(分析純)，國藥集團；酵母膏、蛋白胨(分析純)，Oxiod公司；瓊脂(分析純)，BioSHARP公司；實驗用水均為煮沸5 min后冷卻至室溫的超純水。

1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(質(zhì)量分數(shù))：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂粉2%(固體培養(yǎng)基)。WL培養(yǎng)基[15](g/L)：酵母粉4.0，蛋白胨5.0，葡萄糖50，瓊脂20.0，KH2PO40.55，KCl 0.425，MgSO40.125，F(xiàn)eCl30.002 5，MnSO40.002 5，溴甲酚綠22.0，曲拉通X-1002，氨芐青霉素0.1。青稞汁培養(yǎng)基：取脫殼青稞1 500 g洗凈后加水浸泡3 h，蒸煮1 h后加入1%(質(zhì)量分數(shù))的糖化酶、液化酶、蛋白酶，加入礦泉水3 000 mL，放入45 ℃烘箱中糖化6 h，測得糖度17 °Bx。紗布過濾后離心機6 000 r/min離心10 min后裝瓶，放-20 ℃冰箱冷凍保藏。

1.3 儀器與設(shè)備

3K15冷凍離心機，美國 Sigma-Aldrich公司；GC 6890 N-MSD5975氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、GC6890 N氣相色譜儀，美國Agilent公司；BSP-250生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備；AS2060B超聲波清洗器，德國Elma公司；超高效液相色譜儀，美國Waters公司。

1.4 酵母菌分離與純化

根據(jù)所需平板量準(zhǔn)確配制WL培養(yǎng)基篩選酵母菌；取粉碎好的青稞酒曲5 g，10倍逐級稀釋；采用10-5，10-6，10-7三個梯度，每個梯度2個平行；將平板置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d；配制YPD平板；根據(jù)WL平板上酵母菌落形態(tài)有選擇地挑選數(shù)株菌轉(zhuǎn)移到Y(jié)PD平板上，劃線培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 酵母菌鑒定

采用試劑盒提取法提取分離菌種基因組，進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增，PCR體系為超純水10.5 μL，Mix酶12.5 μL，引物1(NL1)0.5 μL，引物2(NL4)0.5 μL，模板1.0 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%(質(zhì)量分數(shù))凝膠電泳檢測。

1.6 酵母形態(tài)的電鏡分析

將菌體用磷酸緩沖液洗去培養(yǎng)基，加入3%(體積分數(shù))戊二醛固定5 h以上;用磷酸緩沖液浸泡洗滌6次,每次20 min；用體積分數(shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇,逐級脫水,每級15 min。用叔丁醇置換2次,1次20 min，最后將樣品置于電子顯微鏡下觀察[16]。

1.7 不同種類酵母菌發(fā)酵性能與風(fēng)味代謝分析

1.7.1 不同種類酵母菌發(fā)酵性能分析

每類酵母挑選3株菌株接種到裝有青稞汁培養(yǎng)基的15 mm×150 mm試管中，搖床30 ℃培養(yǎng)24 h；將種子液接種到裝有115 ℃滅菌30 min的150 mL青稞汁的三角瓶中，接種量為5%，加上發(fā)酵栓，用5 mol/L的硫酸液封；30 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵5 d左右。參照韓德權(quán)等[17]采用二硝基水楊酸法，測量發(fā)酵液中殘余還原糖含量。參照林艷等[18]通過安捷倫1200液相儀檢測乙醇含量。參照徐勇等[19]通過超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)檢測有機酸含量，色譜條件如下，色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3(i.d 2.12.1 UPL，1.8 2.)；流動相20.00 mmol/L的NaH2PO4溶液(pH 2.7)；檢測波長210 nm，柱溫30 ℃，流速0.25 mL/min，進樣1 μL。

1.7.2 青稞汁發(fā)酵液揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

參照陳雙[20]報告的香氣物質(zhì)提取和分離方法。頂空固相微萃取(head space-solid phase microextraction，HS-SPME)及進樣過程由Gerstel公司復(fù)合自動進樣系統(tǒng)(MPS 2)完成，萃取頭為2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS三相萃取頭。萃取溫度50 ℃，樣品平衡時間5 min，萃取時間50 min，孵化器轉(zhuǎn)速500 r/min。樣品前處理流程：頂空瓶中稱取2.5 g的NaCl，加入4 mL樣品，4 mL去離子水，再加內(nèi)標(biāo)(81 mg/L 2-辛醇)10 μL，用帶PTFE/藍色硅膠隔墊的空心磁性金屬蓋密封后進行由MPS 2進行HS-SPME操作，完成萃取過程后萃取頭于GC進樣口250 ℃解吸附5 min后，用于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)定性和定量分析。

GC條件：高純氮氣為載氣，流速2 mL/min。不分流進樣。色譜柱為DB-FFAP(60 m×0.32 mm×0.25 μm，Agilent)。起始溫度為40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升溫至230 ℃，保持10 min。

MS條件：電離方式為EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描范圍35.00～350.00 amu。未知化合物通過保留指數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖進行比對鑒定。化合物的定量采用內(nèi)標(biāo)半定量的方式進行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 西藏傳統(tǒng)青稞酒釀造用藏曲中主要酵母的分離鑒定

選擇來自西藏傳統(tǒng)青稞酒主產(chǎn)地的拉薩、林芝、日喀則及山南地區(qū)的5種不同形態(tài)的藏曲樣品，用WL鑒別培養(yǎng)基對5種藏曲分別進行分離培養(yǎng)，在培養(yǎng)中可以從酵母形態(tài)上觀察藏曲中主要的酵母種類，根據(jù)它們的形態(tài)差異有選擇的挑選主要酵母分離純化：其中共分離出山南①號11株，山南②號11株，日喀則11株，林芝7株，拉薩8株。分別記為山南①號(S1)、山南②號(S2)、日喀則(R)、林芝(LN)和拉薩(LA)。提取上述分離出的菌株的基因組進行測序分析，測序結(jié)果與NCBI比對，比對結(jié)果如下，分離的酵母菌株中鑒定到種后主要分為3類：釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，S.cerevisiae)31株，扣囊復(fù)膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuliger，S.fibuligera)9株，Saccharomycopsismalanga(S.malanga) 3株。為進一步鑒定酵母采用了電鏡觀察，3種酵母的電鏡照片如圖1所示。其中釀酒酵母普遍存在于各種酒曲之中，產(chǎn)酒產(chǎn)香能力突出?？勰覐?fù)膜孢酵母曾被杜木英[7]在西藏傳統(tǒng)釀造青稞酒中初步檢測到并篩選了糖化力強的菌株，它在釀酒中起糖化、發(fā)酵、生香的作用。國內(nèi)釀酒行業(yè)對扣囊復(fù)膜孢酵母研究主要集中于米酒、黃酒與清香型白酒[21]，應(yīng)玲云等[22]發(fā)現(xiàn)燒酒曲中存在扣囊復(fù)膜孢酵母，但它在清香、醬香、濃香3種大曲中也常被發(fā)現(xiàn)。郝文軍等[23]發(fā)現(xiàn)牛欄山酒中含扣囊復(fù)膜孢酵母。THAKUR等[24]在印度的傳統(tǒng)青稞酒飲料中發(fā)現(xiàn)釀酒酵母，扣囊復(fù)膜孢酵母。同時NAOKO等[25]發(fā)現(xiàn)扣囊復(fù)膜孢酵母能分泌胞外淀粉酶，對青稞淀粉的液化水解起到一定作用。而S.malanga在國內(nèi)青稞酒中未見報道，此次為首次發(fā)現(xiàn)其為藏曲中的主要菌。BHARDWAJ等[26]在位于喜馬拉雅山脈的印度青稞酒飲料中發(fā)現(xiàn)了S.malanga。

A- S.cerevisiae；B-S.fibuligera；C-S.malanga

2.2 藏曲中主要酵母菌的釀造性能分析

酵母菌作為青稞酒釀造的一類主要功能微生物，為了解析不同酵母在青稞酒釀造中的功能，研究從分離的3類酵母中分別選擇了3株酵母進行青稞汁模擬發(fā)酵實驗，對不同酵母產(chǎn)酒、產(chǎn)酸和產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的代謝能力進行了系統(tǒng)分析。

9株酵母發(fā)酵性能如表1所示，在無氧條件下，酵母通過發(fā)酵作用轉(zhuǎn)化青稞汁中的還原糖為CO2與乙醇，發(fā)酵后發(fā)酵液中的還原糖含量越少，發(fā)酵反應(yīng)越徹底，乙醇含量越高。接種了釀酒酵母發(fā)酵液的乙醇濃度最高，扣囊復(fù)膜孢酵母次之，S.malanga最低。同時接種釀酒酵母的青稞汁發(fā)酵后殘余的還原糖含量遠低于接種扣囊復(fù)膜孢酵母與接種S.Malanga的。說明接種了釀酒酵母的青稞汁發(fā)酵最為徹底，3種酵母中釀酒酵母發(fā)酵能力最強，扣囊復(fù)膜孢酵母次之。接種3株不同菌株釀酒酵母的青稞汁殘余的還原糖含量較為接近，說明其發(fā)酵能力較為穩(wěn)定。而接種不同菌株的扣囊復(fù)膜孢酵母與接種S.Malanga的青稞汁還原糖含量有較大波動，不同菌株的扣囊復(fù)膜孢酵母與S.Malanga的發(fā)酵能力有較大差異。

表1 西藏傳統(tǒng)釀造青稞酒釀造用藏曲中主要酵母發(fā)酵性能分析 單位：g/L

2.3 產(chǎn)酸能力的檢測與分析

對不同酵母菌青稞汁發(fā)酵液有機酸含量的測量結(jié)果如表2所示。青稞汁發(fā)酵液中乙酸、琥珀酸和檸檬酸是主要的有機酸，而酒石酸、蘋果酸和乳酸含量相對較低。乙酸有一種特有的味道，會對人的舌后部產(chǎn)生較強的刺激。而乳酸較澀感銳利。琥珀酸口味很復(fù)雜，除了有酸味外，還有一種咸味、苦味，在酒的風(fēng)味形成過程中有助于形成豐富的酯類物質(zhì)，是富于味覺反應(yīng)的一種酸[27]。而蘋果酸酸味較檸檬酸強，刺激爽口，略有苦澀感，呈味時間較長[28]；檸檬酸給人一種清新宜人的口感，酸味圓潤、清爽，后苦時間短[27]。在3種酵母中，產(chǎn)乙酸和乳酸含量相似，S.malanga產(chǎn)乙酸較弱而產(chǎn)乳酸較強。S.malanga產(chǎn)草酸含量高于扣囊復(fù)膜孢酵母，而釀酒酵母最低且與前兩者有著數(shù)倍的差距。3種酵母中S.malanga產(chǎn)琥珀酸能力較強。蘋果酸和檸檬酸是3種酵母模擬發(fā)酵液中含量差異較大的2種有機酸，扣囊復(fù)膜孢酵母基本不產(chǎn)蘋果酸而S.malanga產(chǎn)蘋果酸與檸檬酸量遠高于其他2種酵母菌。同時在3種酵母中S.malanga產(chǎn)酸含量最高，扣囊復(fù)膜孢酵母其次，釀酒酵母最低。

表2 青稞汁發(fā)酵液有機酸分析 單位：g/L

2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測與分析

采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)分析了不同酵母青稞汁發(fā)酵液中揮發(fā)性組分種類和含量差異，結(jié)果如表3所示。在青稞汁發(fā)酵液中檢測出的風(fēng)味物質(zhì)共26種，包含4種揮發(fā)性有機酸，13種酯類化合物，3種醇類化合物，4種醛酮類化合物和2種揮發(fā)性酚類化合物。

比較不同種類酵母菌風(fēng)味代謝特征可知，3種酵母發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)成分相差不大但風(fēng)味物質(zhì)含量卻存在著顯著差異，S.malanga產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)較少，除醇類化合物外，其他風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)量極低。3種酵母中，釀酒酵母產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)最多，各類風(fēng)味物質(zhì)總含量均高于其他2種酵母，其中少量物質(zhì)含量低于扣囊復(fù)膜孢酵母。

在發(fā)酵培養(yǎng)基中，2,4二己烯酸乙酯，丁酸乙酯和3-己烯酸乙酯的含量扣囊復(fù)膜孢酵母略高于釀酒酵母。其他酯類物質(zhì)含量釀酒酵母均高于扣囊復(fù)膜孢酵母與S.malanga。其中S.malanga酯類物質(zhì)含量極低，顯示其在酯類風(fēng)味上的貢獻較??；扣囊復(fù)膜孢酵母所產(chǎn)分子質(zhì)量較小的酯類物質(zhì)較多而產(chǎn)分子質(zhì)量較大的酯類物質(zhì)較少；釀酒酵母產(chǎn)乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯與乙酸-2-苯乙酯含量較高，它們在釀酒酵母所產(chǎn)酯類物質(zhì)含量占比達95%以上。酯類物質(zhì)中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯和乙酸-2-苯乙酯都是重要的風(fēng)味物質(zhì)。乙酸乙酯、乙酸異戊酯與己酸乙酯均在接種釀酒酵母的發(fā)酵液中產(chǎn)量最高，略高于在接種了扣囊復(fù)膜孢酵母的發(fā)酵液中的產(chǎn)量。其中乙酸乙酯具有果香、酒香，乙酸異戊酯呈香蕉香，己酸乙酯似菠蘿、香蕉水果香。因為釀酒酵母所產(chǎn)的酯類風(fēng)味物質(zhì)含量最高，而扣囊復(fù)膜孢酵母與釀酒酵母所產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)有著顯著差異，因此在青稞酒曲中適量的釀酒酵母與扣囊復(fù)膜孢酵母有助于青稞酒風(fēng)味的提升。孫思佳等[29]發(fā)現(xiàn)扣囊復(fù)膜孢酵母強化高溫大曲能有效提升芝麻香型白酒的品質(zhì)使其香氣濃郁。王曉丹等[30]發(fā)現(xiàn)在醬香型白酒大曲中存在扣囊復(fù)膜孢酵母，其發(fā)酵物以乙酸乙酯、乙酸異戊酯、苯乙醇、乙酸苯乙酯、棕櫚酸乙酯含量較高，與本文基本對應(yīng)。

同時比較其他風(fēng)味物質(zhì)我們可以看出，釀酒酵母所產(chǎn)的3種醇類風(fēng)味物質(zhì)都遠高于另2種酵母，S.malanga最低。苯乙醇平均含量高于其他檢測出的風(fēng)味組分。苯乙醇為玫瑰花香，月季花香，花粉香味，能對酒提供較好的風(fēng)味[31]，是一個很重要的天然香味物質(zhì)。釀酒酵母發(fā)酵液中的4-乙烯基愈創(chuàng)木酚含量最高，十倍于S.malanga，百倍于扣囊復(fù)膜孢酵母。4-乙烯基愈創(chuàng)木酚有甜香，花香，水果香，香瓜香，是白酒、啤酒(特別是小麥啤酒)、葡萄酒、醬油等產(chǎn)品的重要呈香物質(zhì)。正是不同的菌所產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的含量與種類不同，藏曲中種類繁多微生物的配合作用產(chǎn)出了如此獨特風(fēng)味的西藏傳統(tǒng)釀造青稞酒。

表3 不同酵母菌青稞汁發(fā)酵液揮發(fā)性風(fēng)味組分含量差異分析 單位：μg/L

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)青稞酒中的主要酵母可能為釀酒酵母、扣囊復(fù)膜孢酵母與S.malanga，其中釀酒酵母的發(fā)酵能力最為優(yōu)秀也能產(chǎn)出最多風(fēng)味物質(zhì)，S.malanga產(chǎn)酸能力最強，扣囊復(fù)膜孢酵母則居于兩者中間，藏曲中含適量釀酒酵母，扣囊復(fù)膜孢酵母與S.malanga就極為重要，釀酒酵母過少將導(dǎo)致發(fā)酵能力下降，成品酒酒精度不高且風(fēng)味物質(zhì)較少，扣囊復(fù)膜孢酵母有分泌胞外淀粉酶的能力，對淀粉液化水解起一定作用，如果S.malanga過少將導(dǎo)致酸度不足，影響成品酒風(fēng)格形成，合理配置藏曲中微生物成分與含量可有效提升酒的品質(zhì)，對青稞酒發(fā)酵產(chǎn)生不可替代的影響。

青稞酒是我國獨有的發(fā)酵酒，本次研究揭示了釀酒酵母，扣囊復(fù)膜孢酵母與S.malanga為青稞酒中主要酵母，也對比了三者的發(fā)酵能力、產(chǎn)酸和風(fēng)味物質(zhì)的能力，但是對青稞酒曲的微生物成分與含量的研究工作仍需繼續(xù)進行，尤其是如何配比能提升酒的口感與風(fēng)味，使青稞酒生產(chǎn)規(guī)范化。