黃瑩瑩 徐琴 姜宇

1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺，杭州 310058；2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，杭州 310016；3浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，杭州 310058

近年來，流式細(xì)胞術(shù)作為臨床檢驗(yàn)中無可替代的重要技術(shù)之一［1］，已普遍應(yīng)用于免疫學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、造血干細(xì)胞移植等研究領(lǐng)域［2-5］，甚至也是農(nóng)業(yè)學(xué)科的有效檢測方法［6］，使用廣泛。流式細(xì)胞儀是應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的有效工具，分選型流式細(xì)胞儀一般還有篩分的作用，可以根據(jù)所檢測顆粒的某種性質(zhì)進(jìn)行分選和回收，用于后續(xù)功能試驗(yàn)。并且，如果整個分選的過程是在無菌條件下進(jìn)行的，分選下來的細(xì)胞還可以用來繼續(xù)培養(yǎng)。但分選之前儀器的條件設(shè)置和調(diào)試都比較繁瑣、費(fèi)時［7］，在實(shí)際運(yùn)行中受到多種因素的制約［8］。其中，分選的3 大要素，分選純度、速度、得率是呈三角制衡關(guān)系的［9］。高效地獲得高得率、高純度的靶生物顆粒，是完成一個完美分選及下游試驗(yàn)的需要。然而分選速率、分選模式及不同尺寸的噴嘴均是影響分選得率的較大因素。如何優(yōu)化流式細(xì)胞分選儀的關(guān)鍵要素，探索高效的分選條件，提高分選得率和純度的研究，國內(nèi)外并不多見。

BD FACS Sorp Aria II 是BD 公司推出的定制型高端流式細(xì)胞分選儀，與傳統(tǒng)Aria II 相比，該儀器在激光器功率、光路設(shè)計方面都做了優(yōu)化。本研究以該Sorp 機(jī)型為例，通過比較不同分選速率、分選模式及噴嘴條件下分選得率及純度的高低，探索優(yōu)化試驗(yàn)條件，并將優(yōu)化后的條件應(yīng)用于原代na?ve T 細(xì)胞（初始T 細(xì)胞）的高效分選，以期達(dá)到最佳分選效果，從而為相關(guān)研究提供技術(shù)支撐與參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、細(xì)胞與主要試劑 流式細(xì)胞分選儀（FACS Sorp Aria II）、Rainbow 熒光微球（貨號：556291）及Accudrop微球（貨號：345249）均購自美國Becton Dickinson 公司。CytoFLEX LX 流式細(xì)胞分析儀購自美國Beckman Coulter 公司。5 ml 無菌流式管（貨號352003）購自美國BD-FALCON公司。PBS 片劑（貨號252122）購自瑞典Medicago 公司。ddH2O 源自平臺自有的Millipore 純水儀（美國Millipore 公司）。6～8 周齡B6 品系小鼠由合作實(shí)驗(yàn)室提供；流式抗體購自BioLegend公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本制備 光路校準(zhǔn)微球：500 μl ddH2O 加1 滴Rainbow 熒光微球；液滴延遲校準(zhǔn)試劑：500 μl ddH2O 加1滴Accudrop 微球。上樣樣品：500 μl ddH2O 中加 3 滴 Rainbow熒光微球和2滴Accudrop微球，充分混勻后備用。

1.2.2 分選儀常規(guī)校準(zhǔn) 本儀器以無菌PBS 為鞘液。啟動FACS Sorp Aria II 流式細(xì)胞分選儀，打開Diva 8.0.1 軟件。開啟“Fluidics Startup”程序，完成后，選擇合適的噴嘴及鞘液壓力，再打開主液流。待液流穩(wěn)定后，微調(diào)液滴頻率和振幅，使衛(wèi)星滴在6 滴之內(nèi)與主液滴融合，點(diǎn)擊主液流框的“sweet spot”鍵，儀器會自動調(diào)節(jié)液滴頻率、振幅，使液流穩(wěn)定在設(shè)定狀態(tài)［10］。ddH2O 上樣 30 min 清洗儀器管路，同時使激光器預(yù)熱穩(wěn)定。打開質(zhì)控程序，用上述配好的光路校準(zhǔn)微球手動進(jìn)行激光延遲的校準(zhǔn)等，質(zhì)控通過后可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。每更換1 次噴嘴須重新按照上述步驟調(diào)節(jié)儀器。

1.2.3 側(cè)液流調(diào)校及液滴延遲計算 打開側(cè)液流窗口的偏轉(zhuǎn)電壓板電壓，然后打開分選測試（test sort）和waste drawer，校準(zhǔn)收集管位置，再調(diào)節(jié)主液流振幅，并逐步調(diào)整2nddrop、3rddrop 和4thdrop 3 個指標(biāo)，使液流分束清楚且光斑聚集明亮。上樣上述配制的液滴延遲校準(zhǔn)試劑，在分選設(shè)定窗口將分選模式設(shè)為fine tube 模式，計算液滴延遲。這時test sort 窗口會出現(xiàn)2 個框，測試時需要左右2 框數(shù)值相加等于100%，左框達(dá)到90%以上，儀器狀態(tài)為可用。最后記錄Drop Delay 值。每更換1 次噴嘴或分選持續(xù)進(jìn)行4 h以上須重新按照上述步驟調(diào)節(jié)儀器。

1.2.4 不同分選速率、分選模式、噴嘴尺寸下分選純度及得率的計算 以同一濃度的熒光微球（見1.2.1 上樣樣品配制），用purity 模式，70 μm 噴嘴，在flow rates 1.0、3.0、5.0、7.0 4 種模式下分別進(jìn)行分選，每個樣收10 萬events。收集管用1.5 ml EP 管，預(yù)加400 μl ddH2O。分別計算分選得率、分選純度及分選效率。

以同一濃度的熒光微球（配制同上），在一個上樣速率（flow rate 1.0）下，用 70 μm 噴嘴，分別以 purity、yield 和4-way purity 3種模式進(jìn)行分選，收集方式同上，分別計算分選得率、分選純度及分選效率。

以同一濃度的熒光微球（配制同上），在一個上樣速率（flow rate 1.0）下，用purity 模式，以不同尺寸的噴嘴（70、85、100 μm）分別進(jìn)行分選，收集方式同上，分別計算分選得率、分選純度及分選效率。

分選效率用Diva 軟件記錄后統(tǒng)計；分選純度的鑒定在剛分選后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行回測分析（回測前儀器需充分清洗干凈），結(jié)果分析使用Flowjo V10 軟件進(jìn)行。回收率是指設(shè)定通過測量點(diǎn)的目標(biāo)顆粒與實(shí)際收獲的目標(biāo)顆粒之間的比例［11］。分選后目標(biāo)顆粒的計數(shù)使用CytoFLEX LX進(jìn)行。

1.2.5 na?ve CD4+T 細(xì)胞的分選 取6～8 周齡B6 品系Ppp2ca+/+dLck-Cre WT 和 Ppp2cafl/fldLck-Cre KO 小鼠脾臟及外周淋巴結(jié)，制成單細(xì)胞懸液。按照EasySep ?Mouse CD4+T Cell Isolation Kit 說明書分選CD4+T 細(xì)胞。富集后細(xì)胞制成5×107/ml 淋巴細(xì)胞懸液，加入流式抗體FITC-CD44、PE-CD25 、PE/cy5.5-CD4 、APC-CD62L ，按照體積比1∶200 加入細(xì)胞懸液，4℃靜置 30 min，加入 2.0 ml PBS，1 400 r/min 離心5 min，并過濾制成1×107/ml～2×107/ml細(xì)胞懸液。將標(biāo)記過的單細(xì)胞懸液置于BD FACS Sorp Aria II 進(jìn)行分選，分選后樣本取200 μl立即回測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（-x±s）表示，采用Duncan檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 分選儀調(diào)試 FACS Sorp Aria II 常用噴嘴大小為70、85、100 μm，其主要參數(shù)見表1，包括鞘液壓力、振蕩頻率及最大進(jìn)樣速度。由表1 可知，噴嘴孔徑越大，鞘液壓力越小，每秒最大進(jìn)樣速度也越低。儀器通過光路校準(zhǔn)調(diào)試后，調(diào)節(jié)主液流，如圖1 A所示，70 μm噴嘴在上1/3左右處開始斷點(diǎn)，且衛(wèi)星滴能在6滴之內(nèi)與主液滴融合，Gap值趨于穩(wěn)定狀態(tài)，液流狀態(tài)良好。打開分選測試框，調(diào)節(jié)側(cè)液流相關(guān)參數(shù)，4個分叉斑點(diǎn)清晰可見，且分束清楚、無“散花”現(xiàn)象（圖1 B）。通過液滴延遲調(diào)試，當(dāng)Drop Delay值為40.57時分選效果最佳，左框達(dá)到99.3%（圖1 C）。85、100 μm噴嘴亦能調(diào)試到良好狀態(tài)（數(shù)據(jù)未展示），其Drop Delay值分別為26.60、26.80。

2.2 不同分選速率對分選效率、純度及得率的影響70 μm 噴嘴，purity 模式下以不同的 flow rate 分選 1.2.1 配制的同一管上樣樣品，flow rate 1.0 條件下，分選效率最高，為（95.33±1.33）%，隨著flow rate 數(shù)值的增加，分選效率顯著降低（均P＜0.05）。flow rates 1.0、3.0、5.0 時分選得率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），但flow rate 7.0 時得率顯著低于1.0 和3.0 條件下得率（均P＜0.05）。由此可知，上樣的flow rate 值越高，分選效率和得率都會下降，尤其是該值超過5.0 時得率僅為（74.07±10.26）%。4 種模式分選下的分選純度均達(dá)到98%以上（分選前純度為9.23%），符合一般下游試驗(yàn)的要求。見表2。

2.3 不同分選模式對分選效率、純度及得率的影響以 70 μm 噴嘴，flow rate 1.0 條件分選 1.2.1 配制的同一管上樣樣品，yield 模式的分選效率和得率都是最高的，分別為（99.67±0.33）%、（79.78±7.14）%。但yield 模式的純度顯著低于purity和4-way purity的（均P＜0.05）。見表3。

表1 FACS Sorp Aria II不同大小噴嘴下的主要參數(shù)

圖1 分選儀液流調(diào)試圖

2.4 不同尺寸的噴嘴對分選效率、純度及得率的影響 以purity 模式，flow rate 1.0 條件分選1.2.1 配制的同一管上樣樣品，70 μm噴嘴分選的效率為（95.00±1.53）%，顯著高于85 μm 噴嘴的（90.33±0.33）%和100 μm 噴嘴的（84.67±0.88）%（均P＜0.05）。分選前目的顆粒群比例為8.90%，而3 種噴嘴條件下分選后的純度均達(dá)到98%以上，且分選得率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表4。

表2 不同分選速率下分選結(jié)果的比較（n=3，±s，%）

表2 不同分選速率下分選結(jié)果的比較（n=3，±s，%）

分選速率flow rate 1.0 flow rate 3.0 flow rate 5.0 flow rate 7.0分選純度98.90±0.25 99.13±0.18 99.53±0.17 99.83±0.12分選效率95.33±1.33 90.00±0.58 84.67±1.45 86.67±1.20分選得率98.10±0.53 93.54±4.81 92.31±1.39 74.07±10.26

表3 不同分選模式下分選結(jié)果的比較（n=3，±s，%）

表3 不同分選模式下分選結(jié)果的比較（n=3，±s，%）

分選模式purity yield 4-way purity分選純度99.30±0.12 97.97±0.39 99.73±0.03分選效率93.33±0.88 99.67±0.33 93.33±0.88分選得率75.26±4.02 79.78±7.14 54.85±7.43

表4 不同尺寸噴嘴下分選結(jié)果的比較（n=3，±s，%）

表4 不同尺寸噴嘴下分選結(jié)果的比較（n=3，±s，%）

噴嘴大小70 μm 85 μm 100 μm分選純度99.77±0.12 98.37±0.26 99.57±0.12分選效率95.00±1.53 90.33±0.33 84.67±0.88分選得率53.80±1.86 53.28±1.63 54.45±1.88

2.5 na?ve CD4+T 細(xì)胞的分選 以Ppp2ca+/+dLck-Cre WT樣本為例，70 μm噴嘴、flow rate 1.0、purity模式條件下分選。P5 門為na?ve CD4+T 細(xì)胞群，分選該亞群后馬上進(jìn)行了回測，如圖2 所示，分選后純度達(dá)到了99.2%，且從FSC/SSC的物理參數(shù)圖可知，分選前，樣本中有不少狀態(tài)不好的或粘連的細(xì)胞，目的細(xì)胞亞群P1 門僅占75.8%，但分選后，P1 門比例達(dá)到了97.8%；說明該條件下分選得到的細(xì)胞狀態(tài)較好。另外，筆者也測試了KO樣本，亦得到了類似結(jié)果（數(shù)據(jù)未展示）。WT 和KO（4 只小鼠）分別分選回收了2 400 萬na?ve CD4+T細(xì)胞，足夠下游刺激活化試驗(yàn)用，分選得率高。

圖2 FACS Sorp Aria II檢測分選后目的細(xì)胞的分選純度

3 討 論

利用流式細(xì)胞分選儀進(jìn)行分選試驗(yàn)，其分選純度和得率往往會受很多因素影響［12］，如儀器狀態(tài)、樣品狀態(tài)、儀器調(diào)試情況、上樣參數(shù)設(shè)置等。因此，如何平衡以上因素，高效地完成一個分選試驗(yàn)一直是需要探索的問題。Vorobjev IA等［13］通過優(yōu)化流式分選儀濾光片配置，高純度、高得率地分選到了被帶綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)的寄生蟲感染的紅細(xì)胞，從而用于下游的顯微鏡及成像流式分析試驗(yàn)。Kabacaoglu G 等［14］通過優(yōu)化側(cè)向位移分離裝置（DLD）以促進(jìn)細(xì)胞的有效分選，從而有利于許多疾病的快速醫(yī)療診斷。Higdona LE 等［15］通過優(yōu)化孔板分選的參數(shù)，證明稀有的人淋巴細(xì)胞亞群比較適合用70 μm 噴嘴、低速的條件進(jìn)行單細(xì)胞分選。作為公共技術(shù)平臺的儀器，測試時間緊張，因此，高效分選條件的探索為更主要的亟待解決的問題。

FACS Sorp Aria II流式細(xì)胞分選儀可使用4-way purity、purity、yield、single cell、initial 和 fine tube 6 種模式進(jìn)行分選，single cell模式主要用于單細(xì)胞分選，本儀器暫未配置單細(xì)胞分選模塊，initial 和fine tube 模式主要用于手動液滴延遲的調(diào)試。因此，在本儀器實(shí)際試驗(yàn)中，purity、yield 和4-way purity 模式應(yīng)用較多，但每種模式對得率和純度的影響都不一樣。本研究中，yield 模式的分選效率和得率都是最高的，純度為（97.97±0.39）%，雖顯著低于 purity 的（99.30±0.12）%和 4-way purity 的（99.73±0.03）%（表 3），但接近98%的純度也滿足很多下游試驗(yàn)的要求。本研究上樣的樣品是直徑小于10 μm 的微球，分布均一；由此推測，如果分選試驗(yàn)上樣的顆粒是直徑小于10 μm 的，又能制成很好的單細(xì)胞懸液，且分群清楚，那么選用yield模式分選也能得到高純度的目的顆粒，且能保證高的得率，尤其對于一些珍貴稀有的樣本可以嘗試此模式分選。但對于直徑較大又容易粘連的細(xì)胞，yield 模式會注重高得率而導(dǎo)致分選純度下降，如果下游試驗(yàn)對樣本純度要求高的，那么可能需要考慮選用purity 或4-way purity 模式。當(dāng)然purity 模式偏重于純度，含非目標(biāo)細(xì)胞該液滴就不分選；當(dāng)分選樣本比較稀少時，二次分選法（yield+purity）既能保證高得率又能提高分選純度［16］。

FACS Sorp Aria II 分選儀常用的有 70、85 和 100 μ m 3種噴嘴，噴嘴尺寸越大，對應(yīng)的鞘液壓力越小，對細(xì)胞的活性保護(hù)更好些，一般待分選細(xì)胞直徑應(yīng)小于等于噴嘴孔徑的1/4［8］；但噴嘴尺寸越大，上樣速度越慢，一定量的樣本相對分選時間較長，細(xì)胞在體外時間越久，活性越差，不利于下游試驗(yàn)。因此，實(shí)際試驗(yàn)建議以分選目的顆粒種類來選擇合適的噴嘴。另外，筆者研究了不同flow rates 條件下的分選結(jié)果，4 種模式分選下的分選純度均較高，但flow rate 7.0的得率是顯著下降的。由此可知，上樣的flow rate 越高，分選效率和得率都會下降，尤其是該值超過5.0時得率降低明顯（表2）。因此，流式分選上樣時flow rate 最好不要超過5.0；另外，適當(dāng)調(diào)整樣本濃度，使flow rate 1.0 的進(jìn)樣速度盡量接近該噴嘴的最大進(jìn)樣速度為宜。

本研究以優(yōu)化后的條件嘗試高效分選小鼠na?ve CD4+T細(xì)胞。由于T細(xì)胞直徑小于10 μm，每個樣本都需要分選上千萬目的細(xì)胞，不能耗時太長，所以選擇了70 μm 噴嘴；樣本濃度為 1×107/ml～2×107/ml、flow rate 1.0 時 Thresold rate能達(dá)到15 000～22 000 events/s，未超過該噴嘴的最大進(jìn)樣速度（表1）；下游試驗(yàn)需要做多組刺激活化試驗(yàn)，對純度和得率要求都較高，試驗(yàn)樣本為原代細(xì)胞，有一定粘連和死細(xì)胞碎片，因此選用purity模式。試驗(yàn)表明，該分選條件下，可以得到較理想的分選結(jié)果。

綜上所述，不同的分選速率、分選模式及噴嘴大小對分選結(jié)果影響很大，試驗(yàn)者應(yīng)根據(jù)當(dāng)次試驗(yàn)的樣本進(jìn)行平衡選擇。穩(wěn)定良好的儀器性能是不斷重現(xiàn)試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果的基礎(chǔ)［17］，因此，操作者儀器條件的選擇對研究結(jié)果有較大影響。本研究探索的分選條件可以幫助試驗(yàn)者快速、準(zhǔn)確地設(shè)置流式細(xì)胞分選儀的參數(shù)，從而獲得較好的試驗(yàn)結(jié)果，對流式分選技術(shù)的應(yīng)用起到一定的參考作用。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。