刁力 李波

海陽市人民醫(yī)院 265100

高尿酸血癥是體內(nèi)嘌呤代謝紊亂和尿酸排泄異常所致的血尿酸水平升高，已經(jīng)成為一種常見病，不僅可以導(dǎo)致痛風(fēng)、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎及痛風(fēng)性腎病，其對心血管系統(tǒng)也有損傷作用，是心血管疾病的獨立危險因素［1］。近年來一些研究顯示高尿酸可刺激內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生功能異常［2-4］，但具體機制尚不清楚。內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是動脈粥樣硬化發(fā)生的病理基礎(chǔ)，在動脈粥樣硬化的發(fā)病過程中扮演著重要作用［5］，對內(nèi)皮細(xì)胞功能受損機制的研究已成為動脈粥樣硬化性疾病的研究熱點。本研究體外培養(yǎng)HUVEC，觀察不同濃度的尿酸對HUVEC的ROS水平、NO含量及eNOS mRNA表達(dá)的影響，了解尿酸對內(nèi)皮損傷的作用途徑，以探討高尿酸血癥在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其機制，對動脈粥樣硬化的防治有應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（中心實驗室友情提供）；DMEM、0.25%胰酶/0.02%EDTA、胎牛血清（Hyclone 公司）；尿酸（Sigma 公司）；青霉素-鏈霉素雙抗（Solarbio 公司）；磷酸鹽緩沖液（Solarbio 公司）；eNOS 抑制劑L-NAME（Selleckchem 公司）；無水乙醇、異丙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；PCR 引物（生工生物工程上海股份有限公司）；ROS 熒光探針-DHE（威格拉斯生物技術(shù)有限公司）；NO 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；總RNA 試劑盒（美國Omega 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（天根生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 尿酸溶液的配置 1 ml NaOH 液體（1 mmol/L）中加入13.45 mg尿酸粉末，溶解后加至49 ml DMEM 完全培養(yǎng)基中，混勻過濾除菌至50 ml無菌離心管中，吸取300 μl測定其尿酸濃度，由所測結(jié)果調(diào)整至目標(biāo)濃度1 600 μmol/L。以DMEM完全培養(yǎng)基稀釋尿酸原液至200、400、600、800 μmol/L。

1.2.2 HUVEC 的培養(yǎng)及試驗分組 （1）將凍存的HUVEC復(fù)蘇、培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞計數(shù)為10×104于12孔板中，設(shè)置為5組：對照組（單純培養(yǎng)基組）、試驗組4組（分別為200、400、600、800 μmol/L 尿酸刺激組），各組分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，觀察尿酸對內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。（2）選擇結(jié)果較穩(wěn)定的600 μmol/L尿酸刺激組，設(shè)置為3組：對照組（單純培養(yǎng)基組）、試驗組（600 μmol/L 尿酸刺激組）、L-NAME干預(yù)組（100 μmol/L L-NAME預(yù)處理15 min，再與600 μmol/L尿酸溶液共同孵育48 h），觀察高尿酸對eNOS 脫偶聯(lián)的影響。以上每次實驗重復(fù)3板。

1.2.3 DHE 熒光染色法測定 ROS 水平 5 mmol/L 的DHE溶液加入12孔板中，熒光探針終濃度為5 μmol/L，恒溫培養(yǎng)箱避光孵育30 min，PBS清洗。熒光顯微鏡下觀察到有HUVEC 細(xì)胞的視野，以綠光激發(fā)，陰性對照孔下調(diào)整背景熒光強度，觀測并記錄不同濃度尿酸刺激后HUVEC 內(nèi)的熒光強度。

1.2.4 上清液NO含量檢測 根據(jù)NO試劑盒說明書操作，測定細(xì)胞上清液NO 含量。每組3復(fù)孔。

1.2.5 熒光定量PCR 檢測eNOSmRNA 的表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，測其純度與濃度。按天根公司KR106 FastQuant RT Ki 試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以eNOS為引物、β-action 為內(nèi)參，按天根公司 FP205 SYBR Green 試劑盒說明書，Bio-Rad 儀進(jìn)行熒光定量PCR 檢測eNOSmRNA 的表達(dá)。反應(yīng)條件：95oC、15 min，95oC、10 sec，60oC、32 sec，循環(huán)40 次?！鳌鰿t=（目的基因Ct 值-內(nèi)參 Ct值）試驗組-（目的基因Ct值-內(nèi)參Ct值）對照組。試驗組目的基因?qū)τ趯φ战M目的基因的表達(dá)量即為2-△△Ct。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19.0軟件，數(shù)值以（±s）表示。多組間兩兩比較符合正態(tài)分布的采用單因素方差分析（one-way ANOVA）Tukey 法，不符合正態(tài)分布的采用Dunnett法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 尿酸對HUVEC ROS 表達(dá)的影響 隨著尿酸濃度升高及作用時間延長，600、800 μmol/L 濃度組 ROS 表達(dá)顯著增強（見圖1、表1）。

2.2 尿酸對HUVEC NO 含量的影響 隨著尿酸濃度升高及作用時間延長，600、800 μmol/L 濃度組 NO 含量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見圖2）。

2.3 尿酸對eNOS 脫偶聯(lián)的影響 選擇前述試驗結(jié)果較為穩(wěn)定的 600 μmol/L 尿酸濃度組，作用 HUVEC 48 h，高濃度的尿酸可以增加細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，降低NO 含量及eNOSmRNA 表達(dá)；加入 eNOS 抑制劑 L-NAME 之后，顯著降低由高尿酸所引起的細(xì)胞內(nèi)ROS 水平并增加NO 含量及eNOSmRNA表達(dá)；差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見圖3）。

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞通常是指覆蓋于血管內(nèi)膜表面的單層扁平上皮細(xì)胞，它形成血管的內(nèi)壁，是血管壁與血液之間的分界細(xì)胞，是血管腔內(nèi)血液與其他血管壁（如單層鱗狀上皮）的接口。它不但具有吞噬功能，是血管的保護(hù)膜，而且還是機體重要的內(nèi)分泌及旁分泌器官，參與免疫活動，包括調(diào)節(jié)血管舒張與收縮，調(diào)節(jié)凝血功能，防止血管通透性增加，緩解血管炎癥反應(yīng)等，維持著心血管系統(tǒng)的正常功能。內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是動脈粥樣硬化的始動因素，是造成動脈粥樣硬化性疾病高發(fā)生率和病死率的重要原因之一，其中的一個主要表現(xiàn)為內(nèi)皮舒張因子NO的生物利用度下降［6］。

NO 是內(nèi)皮細(xì)胞重要的調(diào)節(jié)因子之一，主要由一氧化氮合酶（NOS）催化產(chǎn)生。NOS 是一種同工酶，有3 種不同亞型：神經(jīng)型（nNOS）、誘導(dǎo)型（iNOS）和內(nèi)皮型（eNOS），與心血管系統(tǒng)疾病密切相關(guān)的是eNOS 和iNOS。eNOS 是調(diào)節(jié)NO 產(chǎn)生的主要限速酶，于1991 年由Forstermann 和Pollock在內(nèi)皮細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)。eNOS 源性的NO 發(fā)揮著調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能、維持血管平衡，預(yù)防動脈粥樣硬化的作用。但是某些病理情況下，激活的eNOS 不再產(chǎn)生NO，而是形成超氧陰離子（），即 eNOS 出現(xiàn)脫偶聯(lián)狀態(tài)，導(dǎo)致 NO 水平下降和水平升高。研究發(fā)現(xiàn)，eNOS 脫偶聯(lián)可加重內(nèi)皮損傷，促進(jìn)動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生與發(fā)展［7］。

圖1 尿酸刺激HUVEC內(nèi)ROS表達(dá)（20×鏡下觀察，曝光時間2 s）

表1 尿酸刺激HUVEC內(nèi)ROS表達(dá)（±s）

表1 尿酸刺激HUVEC內(nèi)ROS表達(dá)（±s）

時間24 h 48 h 72 h t值P值濃度200 μmol/L 1.82±1.35 1.99±1.62 2.37±1.88 3.624＜0.05 400 μmol/L 2.19±1.27 2.22±1.34 2.63±1.51 4.008＜0.05 600 μmol/L 2.45±1.49 2.95±1.38 3.41±1.08 4.649＜0.05 800 μmol/L 3.94±1.05 4.41±1.38 5.04±1.64 4.811＜0.05

高尿酸血癥與動脈粥樣硬化的發(fā)展和內(nèi)皮功能受損密不可分。目前，國內(nèi)外有關(guān)尿酸對血管內(nèi)皮細(xì)胞功能影響的研究不是很多，并且觀點存在較大差異。Papezikova I等［8］將尿酸與牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞作用24 h 后發(fā)現(xiàn)尿酸呈劑量依賴性降低了NO 的濃度，同時增加了ROS 的產(chǎn)生，損傷了血管內(nèi)皮細(xì)胞；Mishima M 等［9］通過激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的尿酸轉(zhuǎn)運體，證明尿酸可以減少NO 的產(chǎn)生，引起炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞。這些均提示高尿酸血癥對心血管疾病有損害作用，但也有人提出相反意見。因此，為了解高尿酸血癥對內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響及其機制，本實驗在HUVEC 與不同濃度尿酸作用不同時間后，采用DHE熒光染色法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)，NO試劑盒檢測上清液中NO含量。結(jié)果顯示，隨著尿酸濃度的增加及作用時間的延長，尤其是600 μmol/L 以上尿酸濃度組，作用48 h 以上，HUVEC 上清液NO 含量顯著降低，ROS 表達(dá)強度顯著增加，表明高尿酸可以減少NO生成，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷，這與前面提到的試驗結(jié)果一致。

為了研究尿酸對eNOS脫偶聯(lián)的影響，筆者在分析比較了前述試驗結(jié)果后，選擇結(jié)果較為穩(wěn)定的600 μmol/L 尿酸濃度組，加入eNOS 抑制劑L-NAME，作用48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-NAME 可以降低由高尿酸所引起的細(xì)胞內(nèi)ROS水平并增加 NO 的含量及 eNOSmRNA 的表達(dá)。 L-NAME 是 eNOS 抑制劑，能夠阻止電子向L-Arg 或者是分子氧的傳遞，在正常內(nèi)皮細(xì)胞上，應(yīng)用L-NAME 抑制eNOS 電子向L-Arg 的傳遞，導(dǎo)致NO產(chǎn)生減少，而ROS水平反而增高；而當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞或者組織eNOS 發(fā)生脫偶聯(lián)時，應(yīng)用L-NAME 后，可抑制電子向分子氧的傳遞，使得ROS 產(chǎn)生減少。因此采用L-NAME 觀察細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化，已成為評定eNOS脫偶聯(lián)的常用簡易方法［10］。

圖2 尿酸刺激HUVEC后NO檢測

圖3 高尿酸引起內(nèi)皮細(xì)胞eNOS脫偶聯(lián)

因?qū)嶒灂r間和器材的限制，本實驗只是初步探討了尿酸對血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及eNOS脫偶聯(lián)的影響，尚未涉及具體的信號通路。但我們的實驗表明高尿酸血癥可以通過eNOS 脫偶聯(lián)使內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激從而導(dǎo)致內(nèi)皮損傷。因此，逆轉(zhuǎn)由高尿酸引起的eNOS脫偶聯(lián)具有重要的科學(xué)意義，可為高尿酸誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化性疾病的早期防治提供新的藥物作用靶點，為深入研究人高尿酸血癥的致病機制及合理的干預(yù)措施提供初步證據(jù)。