李清平，張秀飛，梁 明，郭 彥，趙慶臻

(1.聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 聊城 252059；2. 聊城市食品藥品檢驗檢測中心，山東 聊城 252000)

0 引言

葡萄糖作為細胞的主要碳源,不僅為各種細胞組分提供能量,在細胞內(nèi)調(diào)節(jié)中也有著至關(guān)重要的作用。糖代謝的中心途徑是糖異生和糖酵解途徑,二者具有相同的中間產(chǎn)物,且其中大部分步驟為可逆反應(yīng),但有三個步驟是不可逆的,分別由不同的關(guān)鍵酶催化完成。其中,果糖-1,6-二磷酸酯酶(fructose-1,6-biphosphatase,FBPase)是糖異生途徑中的關(guān)鍵酶之一,它催化果糖-1,6-二磷酸(fructose-1,6-diphosphate,FDP)水解成果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate,F6P)和無機磷,而果糖-6-磷酸又是各種生物合成途徑中的重要前體,因此對于FBPase生理功能和代謝調(diào)控的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

1 FBPase的種類及結(jié)構(gòu)與動力學(xué)特征

1.1 酵母中的FBPase

酵母是一種單細胞真菌,早在1943年就已發(fā)現(xiàn)酵母中的FBPase(EC 3.1.3.11)[1],這也是最早被報道的FBPase,研究證明調(diào)節(jié)該酶的活性能夠?qū)崿F(xiàn)酵母細胞在糖酵解和糖異生途徑之間的切換,以保證細胞高效經(jīng)濟地利用能量[2]。

1.2 植物中的FBPase

植物中功能性的FBPase包括兩種類型,一種為細胞質(zhì)FBPase(cytosolic FBPase，cyFBPase),與酵母FBPase作用相同,是糖異生途徑的關(guān)鍵酶,同時也被認(rèn)為是蔗糖生物合成的關(guān)鍵酶,其表達和活性受到光照和干旱等環(huán)境因素的影響[3]。另一種類型是葉綠體FBPase(chloroplast FBPase，cpFBPase),它定位于類囊體基質(zhì)中,其催化的FDP與F-6-P之間的轉(zhuǎn)化是卡爾文循環(huán)及淀粉生物合成途徑的組成部分,因此也是綠色植物實現(xiàn)其自養(yǎng)功能的重要一環(huán)。研究發(fā)現(xiàn),硫氧還蛋白(thioredoxin,TRX)以及光照引起的pH和Mg2+濃度的變化能夠調(diào)節(jié)cpFBPase活性[4]；而后又在草莓中分離出一種新型的葉綠體FBPase-cpFBPaseII,它不受硫氧還蛋白的激活,已被證實可補充酵母細胞中FBPase的缺失和非發(fā)酵碳源的生長缺陷,但對底物的親和力較低[5]。無論是葉綠體FBPase還是細胞質(zhì)FBPase,均不同程度地受到AMP和果糖-2,6-二磷酸的抑制。目前多種植物中的FBPase基因克隆及生化活性測定已完成,如蘋果、甘蔗、壇紫菜和油茶中的胞質(zhì)型FBPase[6-9]及馬鈴薯葉綠體FBPase[10],但它們具體的功能及調(diào)節(jié)機制還鮮有報道。

注：選取不同物種FBPase的氨基酸序列,利用鄰接法構(gòu)建其系統(tǒng)進化樹。 cyFBP:細胞質(zhì)FBPase; cpFBP:葉綠體FBPase;FBP1:肝型FBPase; FBP2:肌型FBPase.S.lycopersicum cyFBP:(番茄，XP_004252579.1); S.tuberosum cyFBP:(馬鈴薯，NP_001274842.1); V.vinifera cyFBP:(葡萄，XP_002269230.1); G.hirsutum cyFBP:(陸地棉，AGU12783.1); C.oleifera cyFBP:(油茶，QGW58450.1); S.oleracea cyFBP:(菠菜，XP_021857795.1); B.vulgaris cyFBP:(甜菜，prf||1906373A); M.domestica cyFBP:(蘋果，XP_008381814.2); A.thaliana cyFBP:(擬南芥，NP_175032.1); Z.mays cyFBP:(玉米，NP_001151106.2); S.officinarum cyFBP:(甘蔗，CAA61409.1); O.sativa cyFBP:(水稻，BAA25422.1); S.cerevisiae FBP:(釀酒酵母，QHB10516.1); P.haitanensis cyFBP:(壇紫菜，AIY29189.1); H.sapiens FBP1:(人，NP_000498.2); M.musculus FBP1:(家鼠，NP_062268.1); H.sapiens FBP2:(人，EAW92616.1); M.musculus FBP2:(家鼠，NP_032020.2)；S.lycopersicum cpFBP:(番茄，NP_001315602.1); S.tuberosum cpFBP:(馬鈴薯，XP_006349477.1); C.oleifera cpFBP:(油茶，QGW58457.1); S.oleracea cpFBP:(菠菜，AAD10207.1); A.thaliana cpFBP:(擬南芥，CAA41154.1); V.vinifera cpFBP:(葡萄，XP_002270826.2)。

1.3 動物中的FBPase

與酵母中一樣,無脊椎動物基因組中也只有一個FBPase位點[11]；而脊椎動物中的FBPase則有肝型 FBPase(FBP1) 和肌型 FBPase(FBP2)兩種同工酶,其蛋白質(zhì)同源性約為77%[12]。其中FBP1主要分布在肝臟和腎臟,肝臟是糖異生的主要器官,參與機體血糖水平的調(diào)節(jié)；而腎臟在長時間處于饑餓或患有糖尿病機體內(nèi)也會參與糖異生的調(diào)節(jié)。FBP2主要在非糖異生的細胞中廣泛表達[13],但具體功能尚不明確。

從酵母及部分動植物FBPase的系統(tǒng)進化樹(圖1)中可以看出,哺乳動物肝型FBPase(FBP1)與肌型FBPase(FBP2)在進化上均與酵母FBPase很接近,植物中胞質(zhì)FBPase(cyFBP)也是與酵母FBPase同源,而葉綠體FBPase(cpFBP)在進化上與酵母FBPase的親緣關(guān)系較遠,可能是由其他如葉綠體祖先中的基因演變而來的。

1.4 FBPase的結(jié)構(gòu)與動力學(xué)特征

有關(guān)FBPase蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及動力學(xué)特征主要是利用哺乳動物肝腎中的FBP1分析的,但基于這兩種同工酶在催化位點和底物結(jié)合位點上的高度相似性,肌型和肝型FBPase的催化機制應(yīng)該完全相同。該酶是同源四聚體,單亞基分子量約為37 ku。每個單體蛋白由兩個結(jié)構(gòu)域組成：一個含有底物結(jié)合位點,稱為FBP結(jié)構(gòu)域；另一個可變構(gòu)的結(jié)構(gòu)域可與AMP和NAD+相互作用,稱為AMP結(jié)構(gòu)域。AMP(可能還包括NAD+)能與AMP結(jié)構(gòu)域的結(jié)合,從而將FBPase穩(wěn)定在失活的“T-狀態(tài)”。而二價陽離子如Mg2+、 Mn2+、 Co2+或Zn2+對于酶的催化活性是必須的,可使FBPase由無活性的“T-狀態(tài)”轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘摹癛-狀態(tài)”,這些離子可能結(jié)合于底物果糖-1,6-二磷酸的1位磷酸基團上。而Ca2+則是肌型FBPase的強抑制劑,但對肝型FBPase影響很小。另外,肝型和肌型FBPase都能被某些一價陽離子(如Na+、K+和NH4+)激活,也都會受到果糖-2,6-二磷酸的抑制,因為它會與底物果糖-1,6-二磷酸競爭結(jié)合FBP結(jié)構(gòu)域[14]。

我們選取不同物種中有代表性且定位于細胞質(zhì)中的FBPase(分別來源于人類肝型FBPase、酵母FBPase及擬南芥胞質(zhì)FBPase),利用Swiss-model構(gòu)建了其三維結(jié)構(gòu)模擬圖,并以其中一個亞基為例將其配體位點標(biāo)示(圖2)。從圖中可以看出,與哺乳動物FBP1的結(jié)構(gòu)相似,酵母與擬南芥胞質(zhì)FBPase也均為同源四聚體,這與FBPase功能的保守性是一致的。人類肝型FBPase的結(jié)構(gòu)研究較為清楚,可以確定其AMP的變構(gòu)位點及FBP與Mg2+的結(jié)合位點；而酵母及擬南芥胞質(zhì)FBPase目前只能確定金屬離子的結(jié)合位點。

注：(a) 人類肝型FBPase(NP_000498.2)；(b) 酵母FBPase(QHB10516.1)；(c) 擬南芥胞質(zhì)FBPase(NP_175032.1)。圖2 不同物種FBPase的三維結(jié)構(gòu)模擬圖

2 FBPase的生理功能及調(diào)控機理

2.1 酵母中FBPase的活性調(diào)節(jié)及降解機制

當(dāng)酵母細胞生長在非發(fā)酵碳源(如乙醇)培養(yǎng)基上時,FBPase開始合成并啟動糖異生途徑,從而將無機碳轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟枪┘毎?；一旦在培養(yǎng)基中添加葡萄糖,細胞中就會發(fā)生由糖異生向糖酵解途徑的快速轉(zhuǎn)變,以阻止ATP的無效循環(huán)水解,從而避免能量浪費。關(guān)閉糖異生途徑的分子機制就是FBPase蛋白的代謝物失活和降解,主要包括其編碼基因FBP1的表達抑制,FBPase蛋白的磷酸化修飾及果糖-2,6-二磷酸和AMP的變構(gòu)抑制,隨之而來的即是FBPase的快速降解[5]。

在酵母細胞中FBPase蛋白的降解可以有不同的方式(圖3)。研究者首先發(fā)現(xiàn)FBPase的降解依賴于液泡,并分離了葡萄糖誘導(dǎo)下FBPase液泡輸入及降解缺陷的vid(vacuolar import and degradation)突變體[15]。除此之外,Wolf等人提出分解代謝物降解的另一種機制,他們認(rèn)為FBPase的代謝降解依賴于完整的蛋白酶體,而其降解的前提是FBPase的多聚泛素化[16]。有趣的是,FBPase的降解可以從蛋白酶體途徑轉(zhuǎn)移到液泡降解途徑,這個過程取決于酵母細胞葡萄糖饑餓的持續(xù)時間[17]。最近還發(fā)現(xiàn)甲醇酵母中FBPase的降解可能與自噬途徑相關(guān)[18]。

注：Fbp1是酵母果糖-1,6-二磷酸酯酶(FBPase)。Fbp1的26S蛋白酶體途徑降解首先由PKA催化其磷酸化修飾,而后在特定E2(Ubc8p/Gid3p)和E3(GID Complex)的作用下多聚泛素化修飾,然后送至26S蛋白酶體降解；其液泡降解途徑首先Fbp1在Vid22p、Sec28p及Vid30的參與下包裹入Vid囊泡,Vid28參與Vid囊泡的胞質(zhì)定位；Vid24p則參與了FBPase由Vid囊泡向液泡的轉(zhuǎn)運過程。另外Fbp1的降解可能與自噬途徑有關(guān)。

2.1.1 FBPase的液泡降解途徑。當(dāng)酵母細胞長期處于葡萄糖饑餓狀態(tài)時,FBPase會分泌到細胞周質(zhì)中。當(dāng)向培養(yǎng)基中添加葡萄糖時,FBPase會首先包裹到Vid囊泡(vacuole import and degradation vesicle)/內(nèi)吞小體(endosome)中,隨后通過這種中間載體被送至液泡中進行降解[19]。目前已鑒定出酵母細胞中多個參與FBPase液泡運輸及降解的Vid基因,其在小鼠和人中的同源基因表明Vid基因在進化上是高度保守的。如Vid24p/Gid4p是定位于含有FBPase的囊泡的膜外周蛋白,其缺失導(dǎo)致FBPase在這些小泡中積累,無法被運送到液泡中降解[20]。定位于質(zhì)膜的Vid22p則參與了從胞漿到Vid囊泡的轉(zhuǎn)運過程[21],FBPase包裹入Vid囊泡還需要內(nèi)吞途徑組分SEC28的參與[22]。肌動蛋白聚合在細胞內(nèi)吞的早期步驟中起著重要的作用,Vid囊泡形成的早期也需與肌動蛋白斑塊結(jié)合,Vid28對于這種結(jié)合以及Vid囊泡的胞內(nèi)定位起著關(guān)鍵作用[23]；Vid30則通過與Vid24p及Sec28p相互作用影響肌動蛋白聚合及內(nèi)吞作用,從而調(diào)節(jié)FBPase的液泡降解途徑[24，25]。另外,還發(fā)現(xiàn)TORC1(target of rapamycin complex 1)復(fù)合體的組分TOR1過表達會抑制FBPase的磷酸化及隨后的液泡降解[26],但只有早期文章提及FBPase液泡降解之前需磷酸化修飾[27],但后續(xù)未見相關(guān)研究。

2.1.2 FBPase的26S蛋白酶體降解途徑。當(dāng)酵母細胞從非發(fā)酵培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到含有葡萄糖的培養(yǎng)基中時,FBPase除了會通過Vid途徑運送至液泡中降解,還可以通過26S蛋白酶體途徑快速降解[16，28]。該途徑是所有真核生物體內(nèi)均具有的高度選擇性的蛋白質(zhì)降解途徑,其中泛素化修飾是底物蛋白被送入26S蛋白酶體中降解的前提條件。泛素化修飾是通過泛素激活酶E1(ubiquitin activating enzyme)、泛素耦合酶E2(ubiquitin conjugating enzyme)和泛素連接酶E3(ubiquitin ligase)的依次級聯(lián)反應(yīng)完成的[29，30]。酵母基因組中E1、E2和E3的編碼基因數(shù)量分別為1、11和超過600個。E1的功能比較通用,底物蛋白的特異性主要由E3決定,而E2會影響所產(chǎn)生的泛素化修飾鏈的具體構(gòu)型[31]。特定的E2-E3組合能夠調(diào)控特異底物蛋白發(fā)生特定類型的泛素化修飾,從而決定該底物蛋白的命運[32]。雖然大部分底物蛋白泛素化修飾的特定E2-E3尚需解析,作用于酵母FBPase的E2和E3已經(jīng)確定。Wolf 實驗室鑒定了一系列的酵母Gid(Glucose induced degradation)基因,發(fā)現(xiàn)由Ubc8p/ Gid3p作為E2[33],由7個Gid蛋白組成的GID復(fù)合物作為泛素連接酶E3[2，34]，共同參與了FBPase的泛素化修飾。生化分析表明,GID復(fù)合物中的兩個亞基Gid2和Gid9具有非經(jīng)典的RING結(jié)構(gòu)域,承擔(dān)其E3活性[2],而Gid4則是在添加葡萄糖后才結(jié)合到由其他6個亞基組成的復(fù)合體中,組成具有E3活性的完整的GID復(fù)合體[34]。另外,還發(fā)現(xiàn)HSP70類分子伴侶Ssa1在快速清除糖異生酶包括FBPase的泛素蛋白降解途徑中起著重要作用[35]。

2.2 FBPase對植物生長發(fā)育的影響

綠色植物通過光合作用將大氣中CO2首先固定成磷酸三碳糖,而葉綠體中的磷酸三碳糖有兩種去向：一是運送到細胞質(zhì)中合成蔗糖,二是在葉綠體中轉(zhuǎn)變成淀粉。細胞質(zhì)型和葉綠體型FBPase分別是蔗糖和淀粉合成的關(guān)鍵酶,葉綠體FBPase同時還是卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶,因此這兩種FBPase在光合碳同化和分配過程中起重要作用。

科學(xué)家們嘗試通過改變基因表達量來分析植物中這兩種FBPase的功能。將胞質(zhì)FBPase與磷酸三碳糖轉(zhuǎn)運蛋白(triose-phosphate translocater,TPT)同時過表達的擬南芥,表現(xiàn)出比野生型蓮座葉大、鮮重提高等生長更旺盛的表型,轉(zhuǎn)基因植物中光合碳同化速率及可溶性糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)含量也明顯提高,證明胞質(zhì)型FBPase的確是蔗糖合成的關(guān)鍵酶[36]；但擬南芥胞質(zhì)FBPase突變體與野生型并無明顯差異,其體內(nèi)蔗糖含量沒有降低的原因可能是由葉綠體輸出的己糖或己糖磷酸鹽補償了胞質(zhì)中(由于cyFBPase缺失導(dǎo)致的)通過糖異生途徑生成六碳糖的缺陷[37]；馬鈴薯中也有類似的結(jié)果,利用反義技術(shù)降低其胞質(zhì)FBPase的活性雖然會導(dǎo)致蔗糖合成速率有所降低,但對馬鈴薯的生長發(fā)育和塊莖幾乎沒有影響[38]。但水稻中胞質(zhì)FBPase突變體的光合速率明顯降低,蔗糖合成受損,出現(xiàn)了嚴(yán)重的生長遲緩現(xiàn)象甚至導(dǎo)致死亡[39],這種單雙子葉植物表現(xiàn)出的差異還需進一步分析。

研究表明,改變?nèi)~綠體FBPase表達水平對植物的光合作用和淀粉及可溶性糖的分配都有著重要影響。利用反義RNA技術(shù)降低擬南芥葉綠體FBPase的表達量,會使植物中蔗糖含量提高,同時氮代謝也發(fā)生了改變[40]；在其基因功能完全敲除的突變體中,光合作用和CO2固定速率等許多過程都受到影響,突變體比野生型明顯生長遲緩；胞質(zhì)型和葉綠體型FBPase的雙突變體則表現(xiàn)為葉綠體FBPase突變體的表型[37]。抑制番茄葉綠體FBPase活性,其果實的重量平均減少20%[41]。綜合不同物種中下調(diào)cpFBPase活性的結(jié)果,可以看出葉綠體FBPase的不同表達量對光合碳同化產(chǎn)生不同的影響：當(dāng)葉綠體FBPase的活性被抑制20%以內(nèi)會促進光合作用和碳同化,而被抑制80%以上將會對植物造成傷害[42]。葉綠體FBPase的活性受f型及m型硫氧還蛋白調(diào)節(jié)[43，44],豌豆中還發(fā)現(xiàn)S-亞硝基化也是影響葉綠體FBPase活性的因素[45]；在擬南芥細胞質(zhì)中過表達藍藻FBPaseII,由于碳分配的改變影響了生長素和獨腳金內(nèi)酯等激素代謝和響應(yīng)過程,進而促進了植物側(cè)根的生長[46]。

2.3 動物中FBPase的生理功能及抑制劑研究

2.3.1 肝型FBPase是調(diào)節(jié)糖代謝的關(guān)鍵酶。FBPase是調(diào)節(jié)糖異生途徑的關(guān)鍵酶,在動物內(nèi)源性葡萄糖的合成、輸出及調(diào)控中發(fā)揮重要作用。肝型FBPase即 FBP1主要在糖異生器官如肝臟、腎臟中表達,在葡萄糖和糖原合成中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[14]。雖然糖異生途徑的酶一般都定位于細胞質(zhì)中,但肝型FBPase也發(fā)現(xiàn)有細胞核定位[47]。糖異生途徑異常是人類 2 型糖尿病的主要原因,研究發(fā)現(xiàn),在肥胖和胰島素抵抗動物模型中,FBPase及其調(diào)節(jié)的糖異生作用均增加；在小鼠中過表達人類肝型FBPase也導(dǎo)致其葡萄糖水平增高[48]。因此,FBPase 成為人類糖尿病治療的靶點之一,其抑制劑的研究成為新藥研發(fā)的一個重要方向。FBPase有兩種內(nèi)源性生理抑制劑,一種是底物 FDP的類似物果糖-2,6-二磷酸(fructose-2,6-diphosphate),它與 FDP 競爭性地結(jié)合于 FBPase 的激活位點,抑制其活性；另一種則是與 FBPase 變構(gòu)位點結(jié)合的 AMP,可使 FBPase 處于失活狀態(tài)[49]。近年來,許多靶向AMP位點的FBPase抑制劑被開發(fā),然而這些抑制劑均沒有表現(xiàn)出合適的效力和藥物性。最近,研究者發(fā)現(xiàn)幾個硝基苯乙烯化合物共價結(jié)合在FBPase上的C128位點上,顯示出對FBPase的強大抑制作用[50],起到有效的降血糖作用,但后續(xù)研究尚未報道。另外,肝型FBPase缺乏還是引起孩童復(fù)發(fā)性低血糖和酸中毒的重要原因[51]；最新證據(jù)還表明FBP1在幾種癌癥的腫瘤起始和進展中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[12，52]。

2.3.2 肌型FBPase的生理功能。研究表明收縮肌中糖酵解產(chǎn)生的乳酸有多達50%可以在肌肉中轉(zhuǎn)變成糖原,而不是經(jīng)血液運送到肝臟中通過糖異生途徑生成葡萄糖[53],這說明肌肉中的FBP2一定是有活性的。對其機理的研究發(fā)現(xiàn),肌型FBPase即FBP2能夠與肌型醛縮酶ALDOA(糖酵解關(guān)鍵酶,催化果糖-1,6-二磷酸與磷酸三碳糖之間的相互轉(zhuǎn)換)結(jié)合,它們以代謝物依賴的方式形成一個底物通道[54，55]。通過這個通道,ALDOA催化反應(yīng)的產(chǎn)物果糖-1,6-二磷酸(FDP)可以直接轉(zhuǎn)移至糖原合成途徑,因此可以保護FDP,避免其被糖酵解途徑降解。目前認(rèn)為這是使得肌纖維能夠從碳水化合物前體合成糖原的基本機制[56]。FBP2-ALDOA復(fù)合物定位于橫紋肌Z-線的兩側(cè),其穩(wěn)定性受Ca2+調(diào)節(jié)。肌肉收縮時伴隨著鈣離子濃度的升高,刺激了FBP2從FBP2-ALDOA-Z-線復(fù)合物中解離出來,位于細胞質(zhì)中游離的FBP2立即被AMP和Ca2+抑制,這就避免了細胞中由于糖異生和糖酵解同時發(fā)生而導(dǎo)致的能量浪費。在胰島素促進糖酵解速率增加時也是通過相同的機制完成對糖異生的抑制[57]。近年還發(fā)現(xiàn)FBP2而非FBP1對線粒體的ATP合成有保護作用,這兩種FBPase似乎都有抑癌作用[14]。

3 結(jié)語

FBPase是一種進化上非常保守的碳水化合物代謝途徑中的關(guān)鍵酶,其催化的反應(yīng)決定了該酶的功能在細胞代謝中的重要性。早在1943年就發(fā)現(xiàn)了第一個FBPase,但近一個世紀(jì)以來,對FBPase的研究大部分停留在它是糖代謝的調(diào)控因子,側(cè)重于研究其酶促動力學(xué)及酶的蛋白結(jié)構(gòu)等方面。近年來動物中FBP1除了糖異生途徑關(guān)鍵酶的細胞質(zhì)定位,還被發(fā)現(xiàn)其存在于細胞核中；FBP2更是在多種組織中有非常廣泛的表達,包括神經(jīng)元這種一般認(rèn)為不會發(fā)生從碳水化合物前體合成糖原的部位。這些信息表明FBPase在細胞中的功能不僅僅是糖代謝調(diào)控這一個方面,更有可能通過多個途徑參與細胞命運的調(diào)節(jié),具有比我們現(xiàn)在所認(rèn)識到的更加重要的生物學(xué)功能,目前這方面的研究還處在起步階段[14]。綠色植物特有的葉綠體FBPase是卡爾文循環(huán)及淀粉合成的關(guān)鍵酶,它與在細胞質(zhì)中參與糖異生途徑的胞質(zhì)FBPase都在光合碳同化和分配中起重要的調(diào)控作用,因此對植物的生長發(fā)育至關(guān)重要,但它們本身的調(diào)控機制還知之甚少。目前酵母中FBPase降解的機制研究得較為清楚,但動植物中還沒有相關(guān)方面的報道,這應(yīng)是今后研究FBPase作用機制的主要方向之一。