林立文，謝 權，朱明輝，楊 琳，李思凡，鄧先清

(井岡山大學 醫(yī)學部，江西 吉安 343009)

0 引言

癲癇是多種原因引起腦部神經(jīng)元群陣發(fā)性異常放電所致的反復性的、突發(fā)性的腦功能短暫異常的疾病。臨床表現(xiàn)有大發(fā)作、小發(fā)作、失神發(fā)作、局限性和混合性發(fā)作等類型。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,現(xiàn)今全球大概有5000萬的癲癇患者,而我國有近1000萬的癲癇患者，每年新增癲癇患者約50萬人[1]?，F(xiàn)有藥物可以控制70%左右患者的癲癇發(fā)作，但僅僅是抑制發(fā)作，并不能治愈，需要長期服藥(半年以上甚至終身)，因而帶來了嚴重的耐藥性和毒副作用的問題[2]。開發(fā)新的具有廣譜、強效、毒副作用小的新型抗癲癇藥物(AEDs)仍然是癲癇治療的重要方向。

吡唑是一種含氮五元雜環(huán)化合物，它的芳香性和富電子性質使其易于與各種不同的酶和受體結合，從而賦予其廣泛的生物活性。如抗炎[3]，抗菌[4]，及抗癲癇活性[5,6]。課題組在前期工作中設計了一系列芳基吡唑縮氨基脲類化合物并對其抗癲癇活性進行了初步探索，結果表明該類化合物大多數(shù)都具有良好的抗癲癇活性，尤其是對戊四唑誘導的癲癇小鼠，顯示出較好的保護作用[7]。酰腙是一類酰肼與羰基化合物縮合而成的結構片段，其結構中含有酰胺和席夫堿，后兩者在抗癲癇藥物設計中被廣泛應用[8-9]。為了獲得新的抗癲癇活性結構，本實驗基于前期研究中發(fā)現(xiàn)的芳基吡唑縮氨基脲類化合物，將酰腙替代上述化合物中的氨基脲片段，設計合成了一系列3-芳基-1H-5-取代吡唑酰腙類化合物并對其進行了抗癲癇活性和神經(jīng)毒性的初步評價。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子能夠直接影響神經(jīng)元以及膠質細胞的電活動，調節(jié)中樞神經(jīng)興奮性,在顳葉內側癲癇患者手術切除的腦組織標本上可以觀察到TNF-α表達上調[10，11]。此外，癲癇發(fā)作也會引起神經(jīng)炎癥反應，進一步加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，形成難治性癲癇的病理基礎[12]。自靶向COX-2的塞來昔布被上市用于炎癥治療以來，大量吡唑類抗炎藥物和抗炎活性分子被發(fā)現(xiàn)和報道[13,14]，而酰腙結構在抗炎藥物中同樣被廣泛報道[15]。因此，基于我們的目標化合物中也含有吡唑和酰腙結構，以及炎癥與癲癇發(fā)病的相關性，我們也對目標化合物的抗炎活性進行了評價。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

核磁共振分析采用BURKER AV-300 型核磁共振儀(Bruker，Switzerland)，四甲基硅(TMS)為內標，溶劑使用CDCl3或DMSO-d6；高分辨質譜采用UltrafleXtreme MALDI-TOF/TOF 質譜儀(Bruker Daltonik GmbH，Leipzig，Germany)測定；熔點采用毛細管法測定(溫度計未經(jīng)校正)。實驗所用試劑包括苯乙酮(99%，阿拉丁試劑公司)、苯甲醛(99%，阿拉丁試劑公司)、草酸二乙酯(99%，天津博迪化工股份有限公司)、水合肼(80%，上海化學試劑廠)，和其他常規(guī)溶劑(分析純，麥克林試劑有限公司)。

1.2 化合物合成

1.2.1 化合物3a-3f的合成。以化合物3a為例[16]：在 100 mL 圓底燒瓶中加入40 mL新配制的乙醇鈉溶液(1 mol/L)，冰浴下滴加苯乙酮(4.8 g，40 mmol)和草酸二乙酯(5.85 g，40 mmol)，滴畢，于30 ℃反應2.5 h(TLC跟蹤，展開劑V石油醚/V乙酸乙酯=6:1)。反應液凝固成固體時，反應完成，得中間體2a。 中間體2a不經(jīng)過后處理，直接滴加冰醋酸0.6 mL,調節(jié)至pH 6-7(固體全部溶解)，室溫攪拌0.5 h后再滴加80%水合肼3.0 mL(48 mmol)，90 ℃下加熱回流2 h(TLC跟蹤，展開劑V石油醚/V乙酸乙酯=6:1)。冷卻，濃縮一半溶劑，殘留物在攪拌下倒入到冰水中，析出固體，抽濾，乙醇重結晶得到黃色固體3a。采用相同方法，用其他取代苯乙酮為原料制備得到化合物3b-3f。

1.2.2 化合物4b-4f的合成。以化合物4a為例：在 100 mL 圓底燒瓶中依次加入化合物3a(2.16 g，10 mmol) 和80% 水合肼(10 ml，160 mmol)。混合物于120 ℃下回流反應2 h(TLC跟蹤，展開劑V石油醚/V乙酸乙酯=1∶2)。冷卻至室溫，抽濾，乙醇重結晶得白色固體4a。采用相同方法制備得到化合物4b-4f。

1.2.3 化合物5a-5o的合成。以化合物5a為例[17]：在 100 mL 圓底燒瓶中依次加入20 ml無水乙醇，化合物4a(4.04 g， 20 mmol)和苯甲醛(2.12 g，20 mmol)。加畢，于90 ℃下回流反應2 h(TLC跟蹤，展開劑 V石油醚∶V乙酸乙酯=1∶4)。冷卻至室溫，抽濾，乙醇重結晶得白色固體5a。相同方法下，化合物4a和其他取代的苯甲醛及呋喃甲醛反應得到化合物5b-5h，化合物4a分別與苯乙酮及4-氯苯乙酮反應得到化合物5i和5j；化合物4b-4f分別與苯甲醛反應得到化合物5k-5o。化合物5a-5o的理化數(shù)據(jù)如下：

N'-苯亞甲基-3-苯基-1H-吡唑-5-甲酰肼(5a)：熔點 236-239 ℃，產率 75 %.1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz):δ7.25(s，1H，Pz-H)，7.40-7.86(m，10H，Ph-H)，8.56(s，1H，N=CH)，11.73(s，1H，CONH)，13.82(s，1H，Pz-NH).13C-NMR(DMSO-d6,75MHz):δ158.64，155.88，148.07，147.21，144.21，135.00，130.44，129.52，129.31，129.07，127.53，125.88，103.97.ESI-HRMS calcd for C17H15N4O+([M+H]+):291.1240; found:291.1238.

N'-(2-氟苯亞甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-甲酰肼(5b)：熔點 218-220 ℃，產率 70 %.1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz):δ7.25(s，1H，Pz-H)，7.28-7.99(m，9H，Ph-H)，8.81(s，1H，N=CH)，11.94(s，1H，CONH)，13.83(s，1H，Pz-NH).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz):δ161.26(d，1Jc-f=247.7 Hz)，158.71，147.09，144.23，140.74，132.28(d，3Jc-f=7.5 Hz)，129.55，129.34，129.08，126.85，125.92，125.60，125.39，116.46(d，2Jc-f=20.3 Hz)，104.05.ESI-HRMS calcd for C17H14FN4O+([M+H]+):309.1146; found:309.1143.

N'-(3-氟苯亞甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-甲酰肼(5c)：熔點 216-218 ℃，產率 73 %.1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz):δ7.24(s，1H，Pz-H)，7.28-7.86(m，9H，Ph-H)，8.55(s，1H，N=CH)，11.84(s，1H，CONH)，13.82(s，1H，Pz-NH).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz):δ162.90(d，1Jc-f=242.4 Hz)，158.71，147.09，146.62，144.23，137.56，131.42(d，3Jc-f=8.3 Hz)，129.56，129.10，125.91，125.63，123.95，117.15(d，2Jc-f=21.4 Hz)，113.29(d，3Jc-f=21.2 Hz)，104.06.C17H14FN4O+([M+H]+):309.1146; found:309.1144.

N'-(4-氟苯亞甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-甲酰肼(5d)：熔點 230-233 ℃，產率 75 %.1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz):δ7.26(s，1H，Pz-H)，7.29-7.86(m，9H，Ph-H)，8.53(s，1H，N=CH)，11.75(s，1H，CONH)，13.82(s，1H，Pz-NH).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz):δ163.56(d，1Jc-f=247.2 Hz)，158.66，147.36，146.99，144.17，131.52，129.70(d，3Jc-f=7.6 Hz)，129.50，129.00，125.83，116.38(d，3Jc-f=21.8 Hz)，103.85，103.18.ESI-HRMS calcd for C17H14FN4O+([M+H]+):309.1146; found:309.1151.

N'-(4-氯苯亞甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-甲酰肼(5e)：熔點 278-280 ℃，產率 79 %.1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz):δ7.24(s，1H，Pz-H)，7.50-7.75(m，7H，Ph-H)，7.85(d，2H，J=7.2 Hz，Ph-H)，8.55(s，1H，N=CH)，11.80(s，1H，CONH)，13.82(s，1H，Pz-NH).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz):δ158.67，147.16，146.68，144.22，134.82，133.96，129.53，129.41，129.29，129.11，125.92，125.66，104.02.ESI-HRMS calcd for C17H14ClN4O+([M+H]+):325.0851; found:325.0846.

N'-(4-溴苯亞甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-甲酰肼(5f)：熔點 290-292 ℃，產率 79 %1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz):δ7.25(s，1H，Pz-H)，7.40-7.73(m，7H，Ph-H)，7.85(d，2H，J=7.4 Hz，Ph-H)，8.53(s，1H，N=CH)，11.81(s，1H，CONH)，13.82(s，1H，Pz-NH).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz):δ158.64，147.14，146.77，144.24，134.29，132.32，129.51，129.38，129.07，129.03，125.89，123.60，104.00.ESI-HRMS calcd for C17H14BrN4O+([M+H]+):369.0346; found:369.0344.

N'-(4-甲基苯亞甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-甲酰肼(5g)：熔點 295-297 ℃，產率 91 %.1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz):δ2.35(s，3H，Ph-CH3)，7.24(s，1H，Pz-H)，7.28(d，2H，J=7.4 Hz，Ph-H)，7.39-7.63(m，5H，Ph-H)，7.85(d，2H，J=7.4 Hz，Ph-H)，8.51(s，1H，N=CH)，11.66(s，1H，CONH)，13.80(s，1H，Pz-NH).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz):δ158.53，148.10，147.30，144.16，140.22，132.25，129.92，129.50，129.03，127.52，125.87，125.67，103.91，21.50.ESI-HRMS calcd for C18H17N4O+([M+H]+):305.1397; found:305.1399.

N'-(呋喃-2-基亞甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-甲酰肼(5h)：熔點 223-225 ℃，產率 67 %.1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz):δ6.53-6.55(m，1H，F(xiàn)ur-H)，6.91(d，1H，J=3.6 Hz，F(xiàn)ur-H)，7.23(s，1H，Pz-H)，7.40-7.86(m，6H，Ph-H，F(xiàn)ur-H)，8.44(s，1H，N=CH)，11.75(s，1H，CONH)，13.80(s，1H，Pz-NH).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz):δ158.55，150.17，147.18，145.48，144.19，137.77，129.56，129.09，129.05，125.92，113.44，112.66，104.02.ESI-HRMS calcd for C15H13N4O2+([M+H]+):281.1033; found:281.1030.

3-苯基-N'-(1-苯亞乙基)-1H-吡唑-5-甲酰肼(5i)：熔點 266-268 ℃，產率 70 %.1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz):δ2.39(s，3H，CH3)，7.27(s，1H，Pz-H)，7.38-7.86(m，10H，Ph-H)，10.40(s，1H，CONH)，13.86(s，1H，Pz-NH).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz):δ158.38，147.20，144.31，138.48，133.66，129.92，129.53，129.06，128.87，126.88，125.86，125.73，103.74，14.06.ESI-HRMS calcd for C18H17N4O+([M+H]+):305.1397; found:305.1396.

N'-(1-(4-氯苯基) 亞乙基)-3-苯基-1H-吡唑-5-甲酰肼(5j)：熔點 251-253 ℃，產率 81 %.1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz):δ2.38(s，3H，CH3)，7.29(s，1H，Pz-H)，7.39-7.90(m，9H，Ph-H)，10.43(s，1H，CONH)，13.85(s，1H，Pz-NH).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz):δ158.39，152.29，147.19，144.44，137.30，134.62，129.49，129.07，128.91，128.64，126.12，125.82，103.80，14.07.ESI-HRMS calcd for C18H16ClN4O+([M+H]+):339.1007; found:339.1010.

N'-苯亞乙基-3-(4-氟苯基)-1H-吡唑-5-甲酰肼(5k)：熔點 268-270 ℃，產率 47 %.1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz):δ7.24(s，1H，Pz-H)，7.30-7.91(m，9H，Ph-H)，8.56(s，1H，N=CH)，11.73(s，1H，CONH)，13.80(s，1H，Pz-NH).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz):δ162.58(d，1Jc-f=243.3 Hz)，158.60，148.06，147.27，143.30，135.00，130.40，129.31，128.15(d，3Jc-f=7.8 Hz)，127.50，125.75(d，4Jc-f=3.0 Hz)，116.52(d，2Jc-f=21.4 Hz)，104.06.ESI-HRMS calcd for C17H14FN4O+([M+H]+):309.1146; found:309.1144.

N'-苯亞乙基-3-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-甲酰肼(5l)：熔點 267-269 ℃，產率 67 %1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz):δ7.32(s，1H，Pz-H)，7.43-7.49(m，3H，Ph-H)，7.56(d，2H，J=8.0 Hz，Ph-H)，7.72-7.74(m，2H，Ph-H)，7.87(d，2H，J=8.0 Hz，Ph-H)，8.53(s，1H，N=CH)，11.78(s，1H，CONH)，13.89(s，1H，Pz-NH).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz):δ158.52，156.47，148.35，148.26，134.86，133.49，132.44，130.53，129.53，129.31，127.57，107.01，104.27.C17H14ClN4O+([M+H]+):325.0851; found:325.0846.

N'-苯亞乙基-3-(4-溴苯基)-1H-吡唑-5-甲酰肼(5m)：熔點 258-260 ℃，產率 76 %.1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz):δ7.32(s，1H，Pz-H)，7.46-7.87(m，9H，Ph-H)，8.52(s，1H，N=CH)，11.79(s，1H，CONH)，13.90(s，1H，Pz-NH).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz):δ157.47，148.27，137.40，134.85，132.44，131.89，130.54，129.32，129.04，127.79，127.57，123.90，104.28.ESI-HRMS calcd for C17H14BrN4O+([M+H]+):369.0346; found:369.0345.

N'-苯亞乙基-3-(4-甲苯基)-1H-吡唑-5-甲酰肼(5n)：熔點 248-249 ℃，產率 71 %.1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz):δ2.35(s，3H，Ph-CH3)，7.21(s，1H，Pz-H)，7.30(d，2H，J=8.0 Hz，Ph-H)，7.44-7.74(m，7H，Ph-H)，8.53(s，1H，N=CH)，11.73(s，1H，CONH)，13.73(s，1H，Pz-NH).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz):δ158.48，148.10，148.07，138.39，138.30，134.93，130.46，130.04，129.46，129.31，127.53，125.76，103.36，21.30.ESI-HRMS calcd for C18H17N4O+([M+H]+):305.1397; found:305.1394.

N'-苯亞乙基-3-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-甲酰肼(5o)：熔點 239-241 ℃，產率 73 %.1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz):δ3.81(s，3H，Ph-OCH3)，7.05(d，2H，J=8.4 Hz，Ph-H)，7.12(s，1H，Pz-H)，7.44-7.73(m，5H，Ph-H)，7.77(d，2H，J=8.4 Hz，Ph-H)，8.53(s，1H，N=CH)，11.68(s，1H，CONH)，13.64(s，1H，Pz-NH).13C-NMR(DMSO-d6,100MHz):δ161.05，159.95，147.98，135.01，131.10，130.41，129.31，128.47，127.51，127.35，114.91，114.23，103.01，55.72.ESI-HRMS calcd for C18H17N4O2+([M+H]+):321.1346; found:321.1340.

1.3 化合物抗驚厥活性及神經(jīng)毒性評價

按照美國NIH的抗癲癇藥物開發(fā)方案，采用最大電驚厥模型和皮下戊四唑模型評價目標化合物的抗癲癇活性，旋轉棒法評價目標化合物的神經(jīng)毒性[18，19]。實驗動物采用昆明種小鼠(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘) 2016-0003)，體重18-22 g，雌雄均可。實驗前3 d飼養(yǎng)于23-27 ℃、相對濕度45%-65% 的實驗室中，實驗時間以外可以自由采食和飲水。測試化合物均用DMSO溶解，以0.05 mL/20 g容積腹腔注射，評價化合物在30、100、300 mg/kg三個劑量下的抗癲癇活性和神經(jīng)毒性?；钚杂^測時間為給藥后0.5 h。

最大電休克發(fā)作實驗(MES)：使用110 V，60 Hz的交流電，小鼠耳電極通電0.3 s，出現(xiàn)后肢強直的視為驚厥。正式實驗前一天預篩小鼠，出現(xiàn)驚厥的小鼠用于正式實驗。腹腔給藥0.5 h后對小鼠進行電刺激，觀察藥物的抗電誘導驚厥活性，不出現(xiàn)后肢強直，視為化合物在該劑量下有效。

皮下戊四唑實驗(sc-PTZ)：小鼠給藥0.5 h后皮下給予85 mg/kg的戊四唑(該劑量可以使97%以上的小鼠產生連續(xù)5 s的陣攣性驚厥)，小鼠單獨放置在鼠籠中觀察30 min，以沒有出現(xiàn)連續(xù)5 s以上的陣攣性驚厥為有效，認為該化合物可以對抗由戊四唑誘導的驚厥。

神經(jīng)毒性實驗：神經(jīng)毒性實驗采用旋轉棒法，腹腔給藥 0.5 h后將小鼠置于直徑 1 英寸、轉速為 6 r/min的木棒上，在連續(xù)三次的測試中小鼠均不能在木棒保持1 min而掉下視為有神經(jīng)毒性，反之則無神經(jīng)毒性。

1.4 細胞培養(yǎng)與ELISA實驗(TNF-α濃度測定)

小鼠 RAW264.7 巨噬細胞(北京協(xié)和細胞庫，北京)用添加了10% FBS(BI生物有限公司， 批號：1552680)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素混合液(索萊寶科技有限公司，批號：20160909)的RPMI 1640 完全高糖培養(yǎng)基(杭州四季青生物工程有限公司，批號：170504)于37 ℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每 24 h更換培養(yǎng)基，細胞生長至 90% 傳代。待細胞傳至 3 代，狀態(tài)穩(wěn)定后，用于實驗。將細胞接種到24孔板中，培養(yǎng)24 h后，藥物組加入20 μg/mL的化合物或陽性藥地塞米松(DXMS)預處理4 h，然后加入LPS(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)(1 μg/ml)培養(yǎng)24 h。收集培養(yǎng)液，1000 rpm離心10 min后取上清液，使用小鼠TNF-α ELISA試劑盒(San diego，CA，USA)檢測TNF-α濃度水平[20]。

圖1 目標化合物5a-5o的合成路線

2 結果與討論

2.1合成部分

本實驗以以苯乙酮(或取代苯乙酮)為起始原料，先后與草酸二乙酯發(fā)生縮合反應，與水合肼進行環(huán)化、縮合，最后與芳香醛(酮)縮合得到目標化合物5a-5o(見圖1)?；衔?的制備過程中，使用新制備的乙醇鈉并保證反應體系無水比較關鍵，反應體系中水的存在會降低乙醇鈉的活性從而阻止反應的進行。該反應結束后反應體系會凝固成固體，這是因為化合物2在堿性條件下以鹽的形式存在，在乙醇中溶解度變低導致的。加入醋酸調整pH到7可以使其轉換成分子形態(tài)，溶解度增加，從而溶解到乙醇溶液中。再加入水合肼在90 ℃下回流，可以得到環(huán)合后的吡唑甲酰乙酯3?；衔?直接與水合肼發(fā)生肼解得到酰肼化合物4。該反應中我們嘗試了不同溶劑，發(fā)現(xiàn)反應至少需要110 ℃的反應溫度，才能確保反應進行。如甲苯作溶劑同樣得到預計產物，但比較發(fā)現(xiàn)水合肼直接充當溶劑，可以加快反應速度，并且易于后處理。最后，在醋酸催化下，化合物4與各種羰基化合物縮合得到目標化合物5a-5o。

化合物5a-5o的結構通過核磁共振氫譜、碳譜和質譜得到了確證。結構解析以化合物5a為例：在1H-NMR 中，δ7.25處的單峰為吡唑環(huán)上C-H的吸收峰，δ7.40-7.86范圍的多重峰為兩個苯環(huán)上10個質子的吸收峰，δ8.56處的單峰為席夫堿上的質子信號，δ11.73和13.82位置的兩個單峰則分別為酰胺氮和吡唑氮上的兩個質子的吸收峰。13C NMR譜也準確的給出了該化合物結構的各種信息，恰好是13種不同化學環(huán)境的碳。高分辨質譜分析中，化合物5a([M+H]+)理論分子質量為291.1240，實測值為291.1238，結合氫譜和碳譜可以確證其分子結構。

表1 化合物5a-5o的抗癲癇活性及神經(jīng)毒性

2.2 藥理實驗部分

2.2.1 抗癲癇活性。本實驗采用MES和sc-PTZ模型來評價目標化合物5a-5o的抗癲癇活性。雖然這兩個模型在對難治性癲癇的藥物篩選方面有所欠缺，但目前依然是抗癲癇藥物篩選的首要選擇，被美國NIH列舉為主要的抗癲癇藥物篩選模型[21]。其中MES模型用于篩選能對抗全身強直陣攣性發(fā)作的候選藥[22]，而sc-PTZ 模型則用來篩選失神發(fā)作的候選藥物[23]。本實驗對目標化合物進行了30，100 和300 mg/kg 三個劑量的活性和神經(jīng)毒性的初步評價，其結果見表1。化合物5d和5e在100 mg/kg劑量下表現(xiàn)出抗電刺激所致驚厥活性，化合物5g，5k和5o在300 mg/kg劑量下表現(xiàn)出對抗電刺激所致驚厥活性。其他化合物在最大劑量300 mg/kg 下未見抗電驚厥活性。

scPTZ實驗中，絕大多數(shù)化合物在100 mg/kg劑量下表現(xiàn)出抗戊四唑所致驚厥活性，說明該系列化合物對戊四唑所致癲癇更為敏感，其中化合物5f在30 mg/kg劑量下仍表現(xiàn)出抗癲癇活性。旋轉棒實驗模型中，所有化合物在300 mg/kg劑量下均未表現(xiàn)出神經(jīng)毒性。

2.2.2 抗炎活性。脂多糖(LPS)，革蘭氏陰性細菌細胞壁外壁的組成成分，被認為是通過刺激炎性細胞因子(如腫瘤壞死因子(TNF-α)的釋放而啟動炎癥過程的主要危險因素[24]。LPS誘導TNF-α 釋放模型被認為是一種有效的用于篩選抗炎活性的體內外模型[25，26]。在本研究中，我們通過建立LPS誘導RAW 264.7細胞炎癥模型來篩選化合物5a-5o的體外抗炎活性。如圖2所示，被LPS刺激的RAW 264.7細胞TNF-α濃度顯著升高，陽性藥DXMS可以顯著抑制LPS誘導的TNF-α濃度的升高，在20 μg/mL劑量下抑制率達到62%?；衔镏?a-5f，5h和5k-5m在20 μg/mL劑量下可以顯著抑制LPS誘導的TNF-α濃度的升高。簡單的構效關系分析可以發(fā)現(xiàn)，氟取代化合物5b，5k和呋喃化合物5h具有最好的抗炎活性，抑制率分別為64%，61%和55%，與陽性藥地塞米松相當。而給電子基團甲基或者甲氧基取代的5g，5n和5o則抗炎活性偏弱，對LPS誘導TNF-α表達的抑制率分別為23%，21%和11%，統(tǒng)計時與模型組相比沒有顯著性差異。不同氟取代化合物中，鄰位氟取代的化合物抑制活性更好(5b>5c，5d)，鹵素取代的化合物中，氟取代化合物抑制活性優(yōu)于氯溴取代化合物(5d>5e，5f;5k>5l，5m)。

圖2 化合物5a-5o(20 μg/mL)在LPS誘導RAW 264.7細胞炎癥模型中的抗炎活性(與LPS組比較，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，未標注組p>0.05，沒有顯著性差異，統(tǒng)計分析采用ANOVA followed by Dunnett’s test)

3 結論

本文合成了一系列3-芳基-1H-5-取代吡唑酰腙類化合物，其結構均經(jīng)過光譜學方法確證。體內抗癲癇活性評價表明：該系列化合物大部分表現(xiàn)出不同程度的抗癲癇活性，尤其是對sc-PTZ 模型更為有效，且化合物未見明顯神經(jīng)毒性。此外，該系列化合物在LPS誘導的RAW 264.7細胞炎癥模型中可以顯著抑制TNF-α的釋放，說明其具有良好的抗炎作用。該研究為研究失神發(fā)作類癲癇和炎癥的治療藥物提供了一定基礎。