尹大川，鄧玉俠，祁金玉，陳鳳毛，郝德君，談家金，孫守慧

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，沈陽110161；2.遼寧生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院實驗林場，遼寧 撫順113300；3.南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，南京210018）

松材線蟲?。≒ine wilt disease）又稱松樹萎蔫病，是由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）侵染松科植物所引發(fā)的一種以整株枯死為典型癥狀的毀滅性森林病害[1]。自1982 年我國在南京中山陵首次發(fā)現(xiàn)以來，該病不斷擴展蔓延，造成松樹（Pinus spp.）的大量死亡，成為近幾十年來我國發(fā)生最嚴(yán)重、危害面積最廣的重大林業(yè)病害[2]。該病蔓延速度極快，染病后松樹的死亡率極高，因此被稱為“松樹的癌癥”[3]。 現(xiàn)已成為我國林業(yè)生產(chǎn)的巨大威脅，嚴(yán)重危害著森林生態(tài)安全，是我國當(dāng)前林業(yè)生產(chǎn)的頭號大敵[4-6]。

到目前為止，松材線蟲病在我國自然感染的松樹種類有16 種。 其中，遼寧地區(qū)的寄主以油松（P.tabuliformis）、紅松（P.koraiensis）、落葉松（Larix spp.）和樟子松（P.sylvestris var.mongolica）為主[7]。 樟子松作為我國北方的主要造林樹種，其在我國北方地區(qū)，尤其在遼寧西北地區(qū)的防風(fēng)固沙中發(fā)揮著重要作用[8-9]。 有研究表明，3 年生樟子松苗木在人工接種松材線蟲后可在25d 死亡[10]。 但其在感染松材線蟲之后的相關(guān)指標(biāo)變化規(guī)律，相關(guān)研究尚未報道。 因此，對于遼西北地區(qū)樟子松在接種松材線蟲后，相關(guān)抗病性指標(biāo)的變化規(guī)律研究十分必要。

活性氧（ROS）是一種重要的信號分子，具有細(xì)胞毒性。 當(dāng)植物體遭遇外來生物和非生物脅迫時，會產(chǎn)生大量的ROS 分子[11]。 不同的環(huán)境脅迫同時也會影響植物的生長過程，進而使植物產(chǎn)生一定的應(yīng)激響應(yīng)[12]。 在眾多響應(yīng)機制中，抗氧化酶系統(tǒng)（包括過氧化氫酶CAT、過氧化物酶POD 和超氧化物歧化酶SOD），抗病相關(guān)代謝產(chǎn)物（如黃酮類化合物），光合色素等物質(zhì)的變化既能表明植物對病原物的抵抗能力，也能評價該植物的抗病性強弱[13]。

本研究以遼寧西部地區(qū)4 年生樟子松為研究對象，通過對其進行松材線蟲接種，并觀測其光合色素含量、抗氧化酶活性、抗逆性相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，解析各指標(biāo)在防御反應(yīng)中的動態(tài)變化特征，以期為闡明遼西地區(qū)樟子松對松材線蟲的抗性機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試植株和接種

松材線蟲分離自遼寧省沈陽市沈河區(qū)東陵公園感病油松，現(xiàn)保存于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)森林病理實驗室。 4 年生樟子松實生苗購自遼寧省沙地治理與利用研究所。在天氣晴好、氣溫維持在30℃時接種，接種時間為2019 年6月15 日。接種時采用斜切接種法:在當(dāng)年生枝條結(jié)節(jié)5cm 處，沿枝干斜切入木質(zhì)部，切口深2mm、長3cm。迅速將線蟲懸浮液200μL（含10000 頭線蟲）均勻注入切口處。對照組注入等量蒸餾水，每種處理10 株。接種后進行正常管理。

1.2 取樣及檢測方法

為檢測不同時間松材線蟲侵染后樟子松的生理響應(yīng)，在接種后第0，10，20，30 天時，取距離接種口位置相同位置的當(dāng)年生嫩枝針葉，每個時間點取同一植株的3 處作為重復(fù)。 采集的嫩葉立即投入液氮中置于-80℃冰箱中保存。第30 天時，在接種口上、下方各2～5cm 的莖段，剪碎后利用貝爾曼漏斗法分離松材線蟲[14]，統(tǒng)計該時間點的松材線蟲數(shù)量。

1.3 相關(guān)指標(biāo)測定

光合色素采用丙酮-乙醇研磨法[15]。 抗氧化酶活性采用南京建成公司的酶活檢測試劑盒，按照說明書進行操作。黃酮類化合物采用紫外分光光度計法[15]?？扇苄缘鞍撞捎每捡R斯亮藍(lán)G-250 法[16]。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010 進行數(shù)據(jù)處理，并用Graphpad Prism 7.0 進行雙因素方差分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樟子松梁病癥狀觀察

對接種后苗木進行正常管理。在第10 天時接種苗木開始出現(xiàn)針葉枯黃、干枯等癥狀，少數(shù)苗木出現(xiàn)梢部倒頭（圖1A）。 針葉圍繞接種部位開始逐漸變黃、干枯（圖1B）。 隨著時間的推移，針葉枯萎面積逐漸擴大，并逐步向全株擴展，試驗結(jié)束時，樹木尚未完全死亡。

接種松材線蟲第30 天，圍繞在接種部位的上部和下部均分離檢測到松材線蟲。 不同部位的松材線蟲數(shù)量存在一定的差異, 其中，接種口下方莖段中松材線蟲多于上部，但無顯著差異（圖2）。

圖1 樟子松苗木發(fā)病癥狀（第10 天）Figure 1 Symptom of seedling of P.sylvestris var.mongolica seedlings (Day 10)

2.2 接種松材線蟲后樟子松針葉內(nèi)光合色素的動態(tài)變化

由圖3A 可知，接種后，葉綠素a 含量開始下降，對同一時間點不同處理間樟子松針葉內(nèi)葉綠素a 含量進行方差分析，發(fā)現(xiàn)第30 天，葉綠素a 的含量與對照組達到極顯著差異水平（p＜0.01），接種處理比對照低38.6%。雙因素方差分析結(jié)果表明，時間[F(1,16)=11.21]和接種[F(3,16)=5.854]對試驗結(jié)果均有顯著影響，但二者無交互影響[F(3，16)=3.002]（表1）。 由圖3B 可知，接種后，葉綠素b 含量開始下降，在第10 天，葉綠素b 的含量與對照組達到極顯著差異（p＜0.01）；到第30 天，接種處理與對照組達到極顯著差異水平（p＜0.01），接種處理比對照降低50.9%。 雙因素方差分析結(jié)果表明，時間[F(1,16)=70.69]和接種[F(3,16)=46.72]對試驗結(jié)果均有顯著影響，而且二者交互影響顯著[F(3,16)=9.307]（表1）。 該結(jié)果表明接種松材線蟲對樟子松的生長產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響。

圖2 樟子松苗木線蟲數(shù)量（第30 天）Figure 2 The number of nematodes in P.sylvestris var.mongolica seedlings (Day 30)

2.3 接種松材線蟲后樟子松針葉內(nèi)抗氧化酶的動態(tài)變化

圖3 樟子松苗木光合色素含量變化Figure 3 Content of photosynthetic pigment in P.sylvestris var.mongolica seedlings

表1 樟子松苗木光合色素含量方差分析Table 1 Variance analysis of photosynthetic pigment content in P.sylvestris var.mongolica seedlings

由圖4 可知，接種線蟲后，苗木CAT 活性即開始上升，對同一時間點不同處理間樟子松針葉內(nèi)CAT 活性進行方差分析，結(jié)果表明，第10 天即與對照組相比達到顯著差異水平（p＜0.01），隨著時間的推移，繼續(xù)上升，第20 天時達到最大，與對照組相比達到極顯著差異水平（p＜0.01），此時接種處理比對照組CAT 活性提高890%。第30 天時，酶活性下降，但仍然達到極顯著差異水平（p＜0.01）。對照組CAT 活性無顯著變化（圖4A）。雙因素方差分析結(jié)果表明，時間[F(1，16)=1074]和接種[F(3，16)=554.6]對試驗結(jié)果均有極顯著影響，二者交互影響也極顯著[F(3，16)=597.5]（表2）。與CAT 變化規(guī)律類似，接種線蟲后，苗木POD 活性即開始上升，對同一時間點不同處理間樟子松針葉內(nèi)POD 活性進行方差分析，結(jié)果表明，在第10 天即上升至最高點，酶活性比對照組高373%，且與對照組相比達到極顯著差異水平（p＜0.01）。 隨著時間的推移，POD 活性開始下降，在第30 天下降至最低，但與對照組仍然存在顯著差異（p＜0.01）。對照組POD 活性無明顯的變化（圖4B）。雙因素方差分析表明，時間[F(1,16)=527.9]和接種[F(3,16)=160.6]對試驗結(jié)果均有極顯著影響，二者交互影響也極其顯著[F(3,16)=193.7]（表2）。 SOD 變化規(guī)律與的變化規(guī)律略有不同，接種線蟲之后，SOD 活性開始上升，隨后下降，但下降幅度不明顯，且在整個試驗過程中，接種處理與對照相比SOD 活性均達到極顯著差異水平（p＜0.01）（圖4C）。 雙因素方差分析結(jié)果表明，時間[F(1,16)=780.7]和接種[F(3,16)=125.4]對試驗結(jié)果均有極顯著影響，二者交互影響也極顯著[F(3,16)=110.6]（表2）。

圖4 樟子松苗木抗氧化酶活性變化Figure 4 Activities of antioxidant enzyme in P.sylvestris var.mongolica seedlings

表2 樟子松苗木抗氧化酶活性方差分析Table 2 Variance analysis of antioxidant enzymeactivities in P.sylvestris var.mongolica seedlings

2.4 接種松材線蟲后樟子松針葉內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及黃酮含量的動態(tài)變化

接種線蟲后，苗木可溶性蛋白含量開始上升，方差分析表明， 第10 天即與對照組相比達到極顯著差異水平（p＜0.01），隨著時間的推移，開始下降，第30 天時下降到最低，但與對照組相比未達到顯著差異（p＞0.05）（圖5）。雙因素方差分析結(jié)果表明，時間[F(1,16)=0.1687]對試驗結(jié)果無顯著影響，但接種線蟲[F(3,16)=10.4]對試驗結(jié)果均有顯著影響， 二者交互影響顯著[F (3,16)=10.36]（表3）。

接種線蟲后，苗木MDA 含量開始上升，表明松材線蟲脅迫對樟子松細(xì)胞造成了較大的破壞（圖6）。 對同一時間點不同處理間樟子松針葉內(nèi)MDA 含量進行方差分析，結(jié)果表明，在第10 天即與對照組相比達到極顯著差異水平（p＜0.01），隨著時間的推移，在第20 天達到最高，此時比對照組高449%，達到極顯著差異水平（p＜0.01）。 隨后開始下降，在第30 天時下降到最低，但與對照組相比依然存在極顯著差異（p＜0.01）（圖6）。 雙因素方差分析結(jié)果表明，時間[F(1,16)=663.6]和接種[F(3,16)=124]均對試驗結(jié)果有顯著影響，二者交互影響顯著[F(3,16)=122.9]（表3）。

圖5 樟子松苗木可溶性蛋白含量變化Figure 5 Content of soluble proteinin P.sylvestris var.mongolica seedlings

表3 樟子松苗木滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和黃酮方差分析Table 3 Variance analysis of osmotic adjustment substances and flavone in P.sylvestris var.mongolica seedlings

接種線蟲后，苗木黃酮含量開始上升，表明松材線蟲脅迫后樟子松苗木出現(xiàn)較大的應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量的黃酮類化合物來抵御病原入侵， 先上升后下降的變化趨勢可能的原因為苗木在試驗后期生命活動降低所造成黃酮含量下降（圖7）。 對同一時間點不同處理間樟子松針葉內(nèi)黃酮含量進行方差分析，結(jié)果表明，在第10，20和30 天與對照組相比均達到極顯著差異水平（p＜0.01），隨著時間的推移，在第20 天達到最高，此時比對照組升高450%。 隨后開始下降，在第30 天時仍與對照組相比依然存在極顯著差異（p＜0.01）（圖7）。 雙因素方差分析結(jié)果表明，時間[F(1,16)=3657]和接種[F(3,16)=1176]均對試驗結(jié)果有顯著影響，且二者交互影響顯著[F(3,16)=904.8]（表3）。

3 討論與結(jié)論

松材線蟲病是目前林業(yè)發(fā)展所面臨的頭等大敵。松材線蟲入侵后，一般會對松樹的生長產(chǎn)生極其不良的影響，導(dǎo)致松樹萎蔫甚至死亡[18-19]。樟子松作為東北地區(qū)的主要防風(fēng)固沙樹種，在東北地區(qū)尤其是遼寧西部地區(qū)的生態(tài)安全和環(huán)境保護中發(fā)揮著重要作用，其安全性直接關(guān)乎遼寧西部的國土安全。 目前，已有報道樟子松發(fā)生自然感病[7]，但對于其在人工接種條件的發(fā)病癥狀及生理響應(yīng)的研究仍然具有十分重要的意義。有研究表明，病原體脅迫會對植物的葉綠素含量產(chǎn)生消極地影響。 本研究中，接種松材線蟲可以抑制葉片中葉綠素合成。 樟子松接種后，葉綠素a 和葉綠素b 的含量隨著時間的推移均呈下降趨勢，這個結(jié)果與整個發(fā)病過程中針葉逐步出現(xiàn)枯黃的葉色變化一致。 這一現(xiàn)象與何龍喜等[20]不同松樹感染松材線蟲研究的結(jié)果一致。

圖6 樟子松苗木MDA 含量變化Figure 6 Content of MDAin P.sylvestris var.mongolica seedlings

圖7 樟子松苗木黃酮含量變化Figure 7 Content of flavonein P.sylvestris var.mongolica seedlings

植物在受到病原物脅迫時會產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，ROS 積累造成細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生大量H2O2，進而毒害細(xì)胞。 俞祿珍等[21]研究表明，黑松受到松材線蟲侵染后，體內(nèi)產(chǎn)生大量的H2O2，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 何龍喜等[22]對不同抗性樹種感染松材線蟲后針葉內(nèi)H2O2含量進行分析， 發(fā)現(xiàn)感病樹種后針葉內(nèi)H2O2含量顯著高于高度抗病樹種，說明松樹抗線蟲能力越強，其ROS 的去除能力也越強，也就是說其抗氧化酶活性越強。 CAT、POD 和SOD是植物體內(nèi)主要的抗氧化環(huán)境脅迫的酶系，通過它們的變化程度可以反映植物的抗逆性強弱[23]。MDA 是細(xì)胞膜質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，該物質(zhì)的含量變化情況可以衡量細(xì)胞膜系統(tǒng)被破壞的程度[24-25]。很多研究發(fā)現(xiàn)，在生物脅迫條件下，植物細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性有所升高，MDA 含量上升[26]。 本研究中，3 種抗氧化酶活性均出現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢，MDA 含量呈現(xiàn)上升-平穩(wěn)-下降的趨勢。此結(jié)果表明，松材線蟲對樟子松苗木造成了脅迫，產(chǎn)生大量的ROS，致使苗木抗氧化酶活性升高用以去除多余的ROS。 但隨著時間的推移，苗木受松材線蟲脅迫致使生長勢逐漸下降，致使酶活性和MDA 含量降低。 保護酶活性和MDA 的變化，表明樟子松受松材線蟲脅迫后，顯著加劇了樟子松針葉細(xì)胞膜過氧化程度，導(dǎo)致細(xì)胞膜被破壞，針葉內(nèi)細(xì)胞內(nèi)容物外露、崩解，使植株趨于死亡。

可溶性蛋白是植物細(xì)胞內(nèi)主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它的變化可以反映細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、變性及降解等多方面信息[27-28]。 有研究表明，在外界環(huán)境脅迫條件下，植物體可以降低可溶性蛋白含量以應(yīng)對環(huán)境脅迫[24]。 本研究中，隨著處理時間的延長，樟子松針葉內(nèi)的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢，可能是由于松材線蟲脅迫致使樟子松出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，可溶性蛋白含量陡然升高，用以增加細(xì)胞的滲透勢來抵御不良環(huán)境。然而，隨著樟子松被脅迫程度的加深，細(xì)胞活性降低，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞，致使細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白被沉淀、降解或者變性，呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢。黃酮類化合物是植物抗逆性的重要代謝物，與植物抗病性有直接的關(guān)系。本研究中，松材線蟲接種則直接誘導(dǎo)了樟子松黃酮化合物的合成，促使黃酮化合物含量顯著升高。 苗木在受到松材線蟲脅迫時出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，隨著生長勢的降低，黃酮含量下降。

綜上，松材線蟲侵染使樟子松體內(nèi)各項抗性生理指標(biāo)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，但隨著病情的加重，樟子松生長勢衰弱，枯黃萎蔫，光合色素含量下降。 接種松材線蟲后，樟子松抗氧化酶系統(tǒng)變化較為明顯，均呈先升高后降低的變化趨勢，其中SOD 表現(xiàn)較為平穩(wěn)。 樟子松受松材線蟲脅迫細(xì)胞受損程度較大，MDA 含量在接種后即上升至較高的水平。 可溶性蛋白和黃酮化合物含量均表現(xiàn)出與抗氧化酶相似的趨勢，即先升高后降低，表明樟子松對松材線蟲脅迫具有一定的應(yīng)激反應(yīng)。