任城帥，李 慧，翁小航，張淞著，劉麗穎，周永斌，

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，沈陽110161; 2.遼寧遼河平原森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站，遼寧 昌圖112500）

鈣是植物生長發(fā)育的必需營養(yǎng)元素之一，植物的成花誘導(dǎo)、花芽分化及開花調(diào)控等過程都與鈣離子（Ca2+）密切相關(guān)，Ca2+還有助于增強(qiáng)植物莖桿的硬度和植株挺立。 近年來，隨著植物鈣調(diào)素的發(fā)現(xiàn)與研究深入，鈣與園林植物的生理關(guān)系也逐漸引起人們的關(guān)注[1]。 鈣含量過高或過低均會影響相關(guān)生理生化過程，最終導(dǎo)致植物受到傷害。不同植物對鈣有不同的需求，這就產(chǎn)生了植物對鈣適應(yīng)的不同機(jī)制[2]。有研究結(jié)果表明，外源鈣處理可以改善植物在逆境脅迫條件下的生長狀況，從而提高植物的抗逆性[3]。 蒲玉瑾等[4]研究發(fā)現(xiàn)，施加外源Ca2+可以緩解低溫對降香黃檀光合作用和水分利用效率的抑制，隨著Ca2+濃度升高其各項指標(biāo)呈先升后降的趨勢。另有研究表明，增施適宜濃度的鈣肥有利于番茄光合性能的提高，外源鈣可以提高葡萄（Vitis vinifera）和甜椒（Capsicum frutescens）在高溫脅迫下的凈光合速率（Pn）和光系統(tǒng)II （PSII）最大光化學(xué)效率[5-6]。 農(nóng)作物上已有鈣對其生長發(fā)育的影響方面的相關(guān)報道， 但目前尚未有關(guān)于鈣對水曲柳影響的研究報道。 本試驗從鈣對水曲柳生物量、生長量、光合參數(shù)、葉綠素?zé)晒?、水分利用效率和植物葉片鈣含量方面進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步深入研究鈣對水曲柳生長發(fā)育特性和科學(xué)施肥提供理論依據(jù)，進(jìn)以提高水曲柳在園林綠化中的應(yīng)用品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 水曲柳幼苗的培育及處理

試驗于2018 年4～8 月在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)后山實驗基地進(jìn)行。 選用1 年生大小一致的水曲柳樹苗，2018 年4月開始進(jìn)行水培，待幼苗生長一段時間并生根后對其進(jìn)行鈣處理，5～7 月每周更換1 次營養(yǎng)液。

營養(yǎng)液pH 值為5～6。試驗設(shè)定5 個Ca2+濃度水平：0，100，200，400，800mg·kg-1。鈣由無水CaCl2提供，其他提供大量元素的化合物為KCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4、EATA-Na2和FeSO4·7H2O。

1.2 測量方法及指標(biāo)

1.2.1 生物量的測定 水培試驗后將水曲柳幼苗取回，分為葉、側(cè)枝、新干、老干、根5 部分。清水洗凈擦干裝于信封后，置于105℃烘箱殺青0.5h，之后調(diào)制烘箱溫度為80℃烘干至恒重。 使用千分之一天平分別稱量其干重。

1.2.2 生長量的測定 在對水曲柳幼苗進(jìn)行鈣處理前，使用直尺測量各組樹苗的株高，用游標(biāo)卡尺測量其兩點基徑并取平均值以記錄。 鈣處理后，于收苗前再次測量樹苗株高與基徑，并根據(jù)各處理中水曲柳樹苗的平均株高生長量以及平均基徑生長量。

1.2.3 光合參數(shù)的測定 在水曲柳幼苗生長最優(yōu)時期（2018 年6 月），選擇晴朗天氣條件下的每日上午8∶30～11∶30，使用Li-6400 便攜式光合測定系統(tǒng)（LI-COR，Inc，USA）測定水曲柳葉片的凈光合速率（Pn），氣孔導(dǎo)度（Cond）和蒸騰速率（Tr）等光合參數(shù)。 有效光輻射強(qiáng)度（PAR）控制在1000μmol·m-2·s-1，重復(fù)3 次進(jìn)行測量。

1.2.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定 在晴朗天氣的上午9∶00～11∶00，對水曲柳葉片進(jìn)行20min 暗處理后，使用便攜式脈沖調(diào)制熒光儀測量不同鈣濃度處理下水曲柳幼苗的最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）和潛在光化學(xué)效率（Fv/F0）。

1.2.5 水分利用效率 在施鈣處理至產(chǎn)生生長差異性后開始破壞性采樣， 將水曲柳葉片洗凈后放入105℃烘箱內(nèi)殺青30min，然后80℃烘干至恒質(zhì)量，研磨后過100 目篩制成備用樣品。使用穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀（DELTAV Advantage Isotope Ratio Mass Spectrometer）檢測CO2的13C 與12C 的比率，與國際標(biāo)準(zhǔn)物（pee dee belemnite，PDB）比對，計算出樣品13C/12C 與標(biāo)準(zhǔn)物13C/12C 偏離的千分率，即為樣品的δ13C 值，根據(jù)以下公式進(jìn)行計算：

式中：A 為凈光合速率；gs為氣孔導(dǎo)度；ca和ci為大氣和葉片細(xì)胞內(nèi)的CO2氣壓值；a,b 分別為CO2擴(kuò)散到氣孔時產(chǎn)生的分部效應(yīng)和氣孔光合羧化酶RUBP 對碳同位素的分部效應(yīng)。

1.2.6 植物鈣測定 將幼苗葉片置于105℃烘箱中殺青0.5h，60℃烘干至衡重。使用粉碎機(jī)將葉片粉碎，再將葉片樣品使用球磨儀粉碎，過100 目篩，使用濕灰化法測定植物葉片鈣濃度。 精準(zhǔn)取樣0.1g，置于錐形瓶中，加入硝酸、高氯酸混合酸（硝酸∶高氯酸=4∶1）10mL，將漏斗放置錐形瓶口上，置于加熱板上，控制加熱板溫度逐漸升高，使樣品消化至無色透明后移入50mL 容量瓶并加入屏蔽劑（氯化鍶30g·L-1），之后使用原子吸收分光光度計測定樣品鈣含量。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 利用Excel 和SPSS 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源鈣對水曲柳生物量及生長量的影響

由表1 可知，水曲柳的葉、側(cè)枝、新干、老干、根生物量以及總生物量在施加外源Ca2+處理后與未施鈣處理的對照相比提升顯著（p＜0.05），且隨著Ca2+濃度升高其數(shù)值呈先升后降的趨勢，均在200mg·kg-1時達(dá)到最大，說明200mg·kg-1處理對水曲柳生長的促進(jìn)效果最為明顯，分別達(dá)到其最優(yōu)值2.058，0.489，0.435，1.885，3.308，7.722g。 由此可見，外源Ca2+的施加確實使得水曲柳生長量有所提升，而且存在最適處理的Ca2+濃度，使水曲柳的各部生長指標(biāo)達(dá)到峰值。 結(jié)果表明，對水曲柳試驗幼苗施加濃度為200mg·kg-1的外源Ca2+，植株的各部生物量和總生物量與其他處理相比均出現(xiàn)顯著差異 （p＜0.05）， 但隨著Ca2+濃度的持續(xù)升高， 在400mg·kg-1和800mg·kg-1濃度下水曲柳各部生物量及總生物量較200mg·kg-1處理時出現(xiàn)下降， 說明一定濃度的鈣可以促進(jìn)水曲柳的生長。

表1 鈣對水曲柳幼苗葉、側(cè)枝、新干、老干、根和總生物量的影響Table 1 Effect of calcium on leaves, side branches, new stems, old stems, roots and total biomass of F.mandshurica seedlings

由圖1 和圖2 可知，隨著Ca2+濃度的升高，水曲柳的株高與基莖增量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢。 在不同Ca2+濃度處理水平下，試驗幼苗的株高與基莖較對照相比出現(xiàn)不同程度的升高，且在Ca2+濃度為200mg·kg-1時分別達(dá)到其最大值（株高平均增長量為8.175cm,基徑平均增長量為1.785mm）。與其他濃度處理間產(chǎn)生顯著差異（p＜0.05）。這說明施加外源Ca2+濃度為200mg·kg-1時，水曲柳生長量增幅最高，隨著Ca2+濃度的逐漸升高，在處理水平高于400mg·kg-1后，外源Ca2+對水曲柳生長的促進(jìn)效果下降明顯，這與其生物量的變化趨勢吻合，從而再次證明200mg·kg-1Ca2+的濃度對水曲柳的生長發(fā)育產(chǎn)生最有利。

2.2 外源鈣對水曲柳幼苗光合特征的影響

由圖2～圖5 可知，施加外源Ca2+會對水曲柳的光合起到促進(jìn)作用，試驗中植株的光合指標(biāo)（凈光合速率Pn、氣孔導(dǎo)度Gs、蒸騰速率Tr）隨著營養(yǎng)液中Ca2+處理水平的提高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。 Ca2+水平在0～200mg·kg-1時，水曲柳的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率均大幅提高，較未施加鈣處理的對照差異顯著（p＜0.05）。同樣，當(dāng)Ca2+濃度為200mg·kg-1時，其光合指標(biāo)分別達(dá)到最優(yōu)值（凈光合速率的最優(yōu)值達(dá)到7.972μmol·m-2·s-1，氣孔導(dǎo)度最優(yōu)值達(dá)0.086mmol·m-2·s-1，蒸騰速率最優(yōu)值達(dá)到1.792mmol·m-2）。 而根據(jù)試驗設(shè)定，隨著營養(yǎng)液中Ca2+濃度的繼續(xù)升高，水曲柳光合指標(biāo)下降趨勢明顯。由此說明，200mg·kg-1的Ca2+濃度對試驗植株的各項光合指標(biāo)產(chǎn)生最適影響，過高濃度的Ca2+會抑制水曲柳的光合。

2.3 外源鈣對水曲柳幼苗葉片光合系統(tǒng)Ⅱ的影響

由圖6 和圖7 可知， 水曲柳幼苗的PSⅡ的潛在光化學(xué)效率（Fv/Fo）和最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）均在Ca2+為200mg·kg-1時達(dá)到峰值，（Fv/Fo最優(yōu)值為4.555，F(xiàn)v/Fm最優(yōu)值為0.818）。 隨著外源Ca2+的加入，水曲柳的葉綠素?zé)晒鈪?shù)增幅明顯，較未施鈣前的處理提升顯著（p＜0.05）。 由于Ca2+濃度的升高，水曲柳葉綠素?zé)晒鈪?shù)與其光合指標(biāo)變化一致，即兩類指標(biāo)均呈先升后降的趨勢，并且，在未施鈣和Ca2+濃度超過400mg·kg-1時水曲柳最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）均小于0.8，產(chǎn)生脅迫。 從而在另一方向證明水曲柳在施加外源Ca2+處理為200mg·kg-1時達(dá)到最適水平。

圖1 水曲柳株高增量Figure 1 Increase in plant height of F.mandshurica

圖2 水曲柳基莖增量Figure 2 Increase in basal stem of F.mandshurica

圖3 水曲柳凈光合速率Figure 3 Net photosynthetic rate of F.mandshurica

圖4 水曲柳氣孔導(dǎo)度Figure 4 Stomatal conductance of F.mandshurica

圖5 水曲柳蒸騰速率Figure 5 Transpiration rate of F.mandshurica

2.4 外源鈣對水曲柳幼苗水分利用效率的影響

由圖8 可知，施加外源Ca2+后水曲柳的水分利用效率較未施鈣處理產(chǎn)生顯著提高（p＜0.05）。 隨著Ca2+濃度的提高，其水分利用效率呈上升趨勢。 在Ca2+濃度達(dá)到800mg·kg-1時，試驗植株水分利用效率達(dá)到118.824g·kg-1，相比較其未添加鈣處理時增加15.267%。 從低鈣處理（100mg·kg-1）到高鈣處理（800mg·kg-1），水曲柳水分利用效率的持續(xù)提升體現(xiàn)了外源Ca2+對其水分利用效率明顯的促進(jìn)作用。

圖6 水曲柳潛在光化學(xué)效率Figure 6 Potential photochemical efficiency of F.mandshurica

圖7 水曲柳潛在光化學(xué)效率Figure 7 Potential photochemical efficiency of F.mandshurica

2.5 水曲柳鈣累積

由圖9 可知，隨著Ca2+處理濃度的升高，水曲柳試驗幼苗中的鈣含量大幅上升，各處理水平下水曲柳鈣積累量的差異均達(dá)到顯著差異（p＜0.05）。 當(dāng)營養(yǎng)液中Ca2+濃度分別為100，200，400，800mg·kg-1時，水曲柳中鈣含量分別達(dá)到14110，19010，28415，37775μg·g-1， 較未添加鈣處理時水曲柳鈣含量分別增加184.19%，248.16%，370.93%，493.11%。 在處理水平為800mg·kg-1時呈現(xiàn)最大值。

圖8 水曲柳水分利用效率Figure 8 Water use efficiency of F.mandshurica

圖9 水曲柳鈣積累Figure 9 Calcium accumulation in F.mandshurica

3 討論與結(jié)論

添加適量的鈣可以改善光合代謝，使植物葉片保持較高的光合性能。 光合作用是植物生長發(fā)育和產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)[7]，為植物有機(jī)物合成與能量獲取的途徑之一，其參數(shù)可揭示植株生長與抗逆性強(qiáng)弱的程度[8]。 本研究結(jié)果表明，不施鈣條件下和高鈣處理的水曲柳葉片光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率均較低。 在施鈣濃度達(dá)到200mg·kg-1時，其光合特性達(dá)到最優(yōu)。導(dǎo)致此現(xiàn)象的原因是鈣作為信號物質(zhì)參與植物的光合作用電子傳遞和光合磷酸化等生理生化過程，對植物的光合作用有著重要的作用[9]。 并且施用鈣可以緩解其凈光合速率的衰減，并提高各時期葉片內(nèi)葉綠素含量[10]，從而改變水曲柳的光合特性。但是，過高的鈣含量也可能導(dǎo)致鈣毒性。植物細(xì)胞內(nèi)過量的鈣可以與磷酸鹽一起形成沉淀，會干擾光合作用，降低植物生長速率[11]。

葉綠素?zé)晒獾膮?shù)變化可反映出不良環(huán)境對植物光合性能的影響。 與表觀的光合指標(biāo)相比，葉綠素?zé)晒鈪?shù)更能反映植物光合系統(tǒng)的內(nèi)在特性[12]，其中PSII 的最大光化學(xué)效率Fv/Fm是光抑制的敏感指標(biāo)，反映植物的潛在最大光合能力，水曲柳光抑制程度越高則葉片PSⅡ的Fv/Fm越低。Fv/Fo是PSII 反應(yīng)中心的潛在活性[13]，試驗結(jié)果顯示，隨著鈣離子的加入，水曲柳的葉綠素?zé)晒獾膮?shù)Fv/Fm與Fv/Fo均發(fā)生顯著提高，在鈣濃度為200mg·kg-1時最優(yōu)。 這說明適量鈣的施加提高了水曲柳葉片PSII 的電子傳遞速率，提高了水曲柳的PSII 剩余活性中心的效率[14-15]。一旦施加鈣的濃度超過最適鈣濃度，則會降低水曲柳的潛在最大光合能力與PSII 反應(yīng)中心的潛在活性。 由于植物葉綠素?zé)晒鈪?shù)在各種脅迫下表現(xiàn)的十分敏感，它們可以作為鑒定植物抗逆性的理想指標(biāo)[16]。 本試驗結(jié)果表明，施鈣可以提高水曲柳的光合性能，高濃度的鈣則會對水曲柳的生長產(chǎn)生脅迫反應(yīng)。

植物水分利用效率是藍(lán)色革命更加具體的思想和舉措，是農(nóng)林業(yè)未來發(fā)展的關(guān)鍵方向和潛力所在[17]。 葉片水分利用效率作為植物生理活動過程中消耗水分形成有機(jī)物質(zhì)的基本效率， 成為確定植物體生長發(fā)育所需要的最佳水分供應(yīng)的重要指標(biāo)之一[18-19]。 由于水分利用效率可用于估算環(huán)境因素對植物的影響。 因此，葉片的水分利用效率可以作為一種簡單方法用于評價限制植物生長因素[20-21]，可為探尋水曲柳最適鈣濃度提供理論支持。 而鈣作為一種重要的礦質(zhì)元素，植物細(xì)胞具有一系列感知內(nèi)源和外源信號或刺激的精巧機(jī)制[22]。 鈣累積量是生物量與鈣含量的乘積，鈣累積量變化動態(tài)是樹體鈣素吸收動態(tài)的體現(xiàn)[23]，植物主要通過木質(zhì)部將根系吸收的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)到新葉等部位[24]。在本研究中，出現(xiàn)了水曲柳植物鈣累積的被動吸收，隨著營養(yǎng)液鈣濃度提升，水曲柳鈣累積含量大幅度升高，水曲柳的生物量與生長量確實在施鈣處理的影響下發(fā)生顯著提升。 同時發(fā)現(xiàn)，水曲柳水分利用效率會因為施鈣而提升，隨著了解到外源鈣對于水曲柳水分利用效率的促進(jìn)作用，也為提高植物水分利用效率，從而緩解植物的干旱脅迫的研究提供思路。 由此可見，適宜的鈣可以作為一種外源調(diào)節(jié)物質(zhì)增強(qiáng)水曲柳抗逆能力,隨著鈣濃度的提升，依靠增強(qiáng)根系吸收鈣能力提高鈣在水曲柳中的累積量，以及調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育[25-26]。

適宜的鈣濃度可以促進(jìn)水曲柳的生長,濃度過低或過高的鈣離子對水曲柳的生長產(chǎn)生抑制作用。 施鈣能夠有效提升水曲柳的光合特性，其凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率等光合指標(biāo)均取得顯著改善。水曲柳的葉綠素?zé)晒鈪?shù)同樣隨著鈣的施加產(chǎn)生明顯變化，存在最適宜的鈣濃度使得水曲柳的葉綠素?zé)晒鈪?shù)出現(xiàn)最優(yōu)值。水曲柳葉片鈣含量隨著鈣濃度增加持續(xù)累積，鈣對水曲柳水分利用效率具有明顯促進(jìn)作用，鈣可以提高水分利用效率，緩解植物干旱脅迫。

綜上，最適合水曲柳生長的鈣濃度為200mg·kg-1。 當(dāng)鈣的施加達(dá)到最適值時，水曲柳的生物量、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率以及PSⅡ最大光化學(xué)效率等數(shù)值均隨之達(dá)到最優(yōu)值，鈣濃度高于或低于其最適濃度時都會對水曲柳的生長產(chǎn)生抑制作用，使其未能得到最優(yōu)生長效果。