吳 琛，陳 旭，李馨寧，史海粟，李彥博，王儒紅，樊 浩，陶冬冰，武俊瑞，烏日娜，岳喜慶

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，沈陽(yáng)110161；2.遼寧省食品檢驗(yàn)檢測(cè)院，沈陽(yáng)110015）

霉菌奶酪是采用霉菌作為發(fā)酵菌種的一類奶酪的統(tǒng)稱[1-3]，是全球銷量持續(xù)增長(zhǎng)的一種傳統(tǒng)乳制品，現(xiàn)主要分布在美國(guó)、歐洲等地[4-6]。 隨著我國(guó)居民生活水平的提高，霉菌奶酪也正在被更多中國(guó)人所接受，霉菌奶酪食品引入我國(guó)市場(chǎng)已成為大勢(shì)所趨[7-8]。 我國(guó)霉菌奶酪產(chǎn)業(yè)正處于起步階段，并且我國(guó)奶酪工業(yè)相對(duì)落后，因此限制了該行業(yè)的發(fā)展[9]。 因此，開發(fā)出適合中國(guó)人口味的霉菌奶酪，將會(huì)促進(jìn)中國(guó)霉菌奶酪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，增強(qiáng)霉菌奶酪產(chǎn)業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力。

目前，應(yīng)用于霉菌奶酪制作上的菌種有限，主要來源于傳統(tǒng)霉菌附屬發(fā)酵劑，多采用白地霉作為霉菌奶酪的發(fā)酵菌種[10-14]，最新研究也有研究者為了擴(kuò)大消費(fèi)市場(chǎng)以及豐富霉菌奶酪的品種使用傳統(tǒng)發(fā)酵食品中獲得的青霉[15]、毛霉[16]、紅曲霉[17，18]、白霉[19，20]等菌種作為發(fā)酵劑。 但從感官評(píng)價(jià)上大多數(shù)霉菌奶酪不能滿足我國(guó)霉菌奶酪市場(chǎng)[21]，因此，開發(fā)霉菌奶酪發(fā)酵新菌種以及改善其發(fā)酵條件勢(shì)在必行。

本研究從前期在農(nóng)家豆醬中篩選到的米曲霉為研究對(duì)象，在將其應(yīng)用于霉菌奶酪制作之前，首先優(yōu)化了米曲霉的培養(yǎng)條件并提高蛋白酶活力，為后續(xù)米曲霉作為發(fā)酵劑，制作新型霉菌奶酪提供較優(yōu)培養(yǎng)條件，并提高米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶和堿性蛋白酶培養(yǎng)條件，以期為霉菌奶酪品質(zhì)改良提供霉菌添加量、發(fā)酵條件等參數(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 米曲霉菌株由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室前期篩選并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 虎紅（孟加拉紅）瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨5g·L-1，葡萄糖10g·L-1，瓊脂15g·L-1，磷酸二氫鉀1g·L-1，硫酸鎂0.5g·L-1，孟加拉紅0.03g·L-1。 自然pH 值，121°C 滅菌20min。

1.2 儀器設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱（HH·Ⅱ420-S，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、電子天平（PL1501，梅特勒-托利多公司）、蒸汽壓力滅菌鍋（LDZX-40B1，日本三洋電子有限公司）、恒溫振蕩器（THZ-98A，上海一恒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（101-1-S，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、超凈工作臺(tái)（CJ-IB，北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠）。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)

1.3.1.1 碳源試驗(yàn) 培養(yǎng)基中分別加入10g 葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉作為碳源，代替初始培養(yǎng)基中的葡萄糖，將培養(yǎng)基分裝在250mL 三角瓶中，裝液量為70mL，每瓶接入一環(huán)孢子，接種后置于30℃搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為200r·min-1，發(fā)酵周期48h[22]。 發(fā)酵結(jié)束后用3 層紗布過濾，洗滌菌絲體3 次，所得菌絲體70℃烘干24h，稱重，每個(gè)因素3 個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.3.1.2 氮源試驗(yàn) 培養(yǎng)基中分別加入5g 酵母粉、硫酸銨、硝酸鉀代替原始培養(yǎng)基中的蛋白胨。 后續(xù)試驗(yàn)同

1.3.1.1 。

1.3.1.3 溫度試驗(yàn) 設(shè)置搖床溫度分別為26，28，30 和32℃，轉(zhuǎn)速200r·min-1，將分裝好的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)48h。米曲霉生物量測(cè)定同1.3.1.1。

1.3.1.4 pH 值試驗(yàn) 將pH 值分別為6.0，6.5，7.0，7.5 的培養(yǎng)基置于30℃、200r·min-1搖床培養(yǎng)48h。 米曲霉生物量測(cè)定同1.3.1.1。

1.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取碳源、 氮源、 溫度3 個(gè)因素， 采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)法，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)單因素試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3 米曲霉中蛋白酶活力測(cè)定 參照OZTURKOGLUBUDAK 等[23]方法，使用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的酪蛋白測(cè)定法定量米曲霉菌株上清液中蛋白酶活力。 以0.25，0.50，1.0，2.0，3.0，5.0μg·mL-1胰蛋白酶制作標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蛋白酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線，在激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)分別為485nm 和530nm 時(shí)測(cè)定樣品相對(duì)熒光，獲得蛋白酶活力。 酶活力定義：米曲霉培養(yǎng)濾液中每分鐘每克總蛋白釋放的胰蛋白酶微摩爾的當(dāng)量（U·g-1）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010 軟件整理數(shù)據(jù)，使用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析，方差分析選取Duncan 檢驗(yàn)，在p＜0.05 檢驗(yàn)水平上對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；運(yùn)用數(shù)據(jù)分析軟件Design Expert 8.0.6.1 對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析，確定米曲霉培養(yǎng)最佳條件。

表1 因素水平編碼Table 1 Code table of factor levels

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件對(duì)米曲霉生物量的影響

2.1.1 碳源對(duì)米曲霉生長(zhǎng)影響 米曲霉在pH 值7.0，30℃條件下恒溫培養(yǎng)48h，考察不同碳源對(duì)米曲霉生物量的影響。 由圖1 可知，米曲霉在不同碳源培養(yǎng)基中生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著差異，在麥芽糖和葡萄糖中生長(zhǎng)狀態(tài)良好，生物量分別達(dá)到（2.20±0.06）g·L-1和（1.80±0.15）g·L-1。 可溶性淀粉和蔗糖對(duì)米曲霉生物量影響差異較小，10g·L-1可溶性淀粉或蔗糖添加量時(shí)，生物量分別為（1.20±0.03）g·L-1和（1.40±0.06）g·L-1，顯著低于麥芽糖和葡萄糖。麥芽糖作為麥麩中的主要碳水化合物，是理想的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)和產(chǎn)酶培養(yǎng)碳源[24]，可促進(jìn)米曲霉的生長(zhǎng)，增加菌株生物量。 在可溶性淀粉和蔗糖分別替代葡萄糖作為碳源時(shí)，菌株生物量顯著降低，說明單糖作為碳源具有一定優(yōu)勢(shì)，但麥芽糖作為碳源，米曲霉生物量顯著高于葡萄糖，說明麥芽糖的分子結(jié)構(gòu)優(yōu)于可溶性淀粉和蔗糖，更利于米曲霉分解代謝。

2.1.2 氮源對(duì)米曲霉生長(zhǎng)影響 米曲霉在pH 值7.0，30℃條件下恒溫培養(yǎng)48h，考察不同氮源對(duì)米曲霉生物量的影響。由圖2 可知，米曲霉在不同氮源培養(yǎng)基中生長(zhǎng)存在顯著差異。在以酵母粉為氮源的培養(yǎng)基中生物量達(dá)到最高值（2.00±0.13）g·L-1，蛋白胨為氮源培養(yǎng)基中生物量為（1.80±0.04）g·L-1，硫酸銨為氮源培養(yǎng)基中生物量為（0.80±0.04）g·L-1，硝酸鉀為氮源培養(yǎng)基中生物量最低值為（0.60±0.05）g·L-1。 以蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀為氮源時(shí)，米曲霉生物量依次降低10%、60%、70%。 米曲霉在有機(jī)氮源中的生長(zhǎng)顯著優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源，而有機(jī)氮源中酵母粉的利用效果優(yōu)于蛋白胨，在米曲霉培養(yǎng)時(shí)應(yīng)優(yōu)先選用有機(jī)氮源。

圖1 10g·L-1 碳源對(duì)米曲霉生物量影響Figure 1 Effect of 10g·L-1 carbon source on biomass of A.oryzae

圖2 10g·L-1 氮源對(duì)米曲霉生物量影響Figure 2 Effect of 10g·L-1 nitrogen source on biomass of A.oryzae

2.1.3 溫度對(duì)米曲霉生長(zhǎng)影響 當(dāng)pH 值7.0、培養(yǎng)48h 時(shí)，考察不同溫度對(duì)曲霉生物量的影響。 由圖3 可知，在26～32°C 溫度范圍內(nèi)，米曲霉生物量隨溫度上升呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在30°C 生物量達(dá)到最高值為（2.10±0.12）g·L-1，顯著高于26，28，32°C。 不同培養(yǎng)溫度主要影響米曲霉中酶系活性，進(jìn)而調(diào)控菌株的生長(zhǎng)代謝，促進(jìn)或抑制霉菌生長(zhǎng)。 培養(yǎng)溫度變化顯著影響米曲霉的生長(zhǎng)，溫度會(huì)影響膜的液晶結(jié)構(gòu)、酶和蛋白質(zhì)的合成與活性以及影響RNA 的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄，在分子水平影響霉菌的生長(zhǎng)代謝，使米曲霉生物量發(fā)生顯著變化。 溫度的微小變化即可對(duì)菌株產(chǎn)生明顯影響，在霉菌生長(zhǎng)過程中應(yīng)嚴(yán)格控制培養(yǎng)溫度，以期獲得最高生物量和最佳酶活力。

2.1.4 pH 值對(duì)米曲霉生長(zhǎng)影響 pH 值影響菌體細(xì)胞膜電荷性質(zhì)的變化和微生物代謝過程中酶的活性。 米曲霉在30°C 恒溫培養(yǎng)48h，觀察不同pH 值對(duì)米曲霉生物量的影響。由圖4 可知，pH 值6.0～7.0 時(shí)，米曲霉生物量呈上升趨勢(shì)，由（1.70±0.03）g·L-1增加至（2.10±0.02）g·L-1，pH 值7.5 時(shí)生物量為（2.00±0.04）g·L-1，略有下降。 不同pH 值顯著影響米曲霉生物量，pH 值在7.0～7.5 范圍內(nèi)， 米曲霉能夠保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)， 生物量保持在[（2.10±0.02）±（2.00±0.04）]g·L-1范圍內(nèi)。

圖3 不同溫度對(duì)米曲霉生物量影響Figure 3 Effects of different temperatures on biomass of A.oryzae

圖4 pH 值對(duì)米曲霉生物量影響Figure 4 Effect of pH on biomass of A.oryzae

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)表2 安排試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果回歸擬合所得回歸模型為：

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for response surface quadratic model

由表2 和表3 可知，相關(guān)系數(shù)R2=90.99%，響應(yīng)面回歸模型高度顯著（p≤0.0004），模型失擬項(xiàng)（p≤0.1439）不顯著，說明該二次模型可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。

由表3 可知，A、B、C 的p 值分別為0.6291，0.0014，0.0069，因此確定因素影響順序?yàn)椋築＞C＞A

依據(jù)回歸模型的數(shù)學(xué)分析并綜合響應(yīng)圖5、圖6、圖7 確定最佳培養(yǎng)條件為：麥芽糖15.30g·L-1，酵母粉11.60g·L-1，溫度30.80°C。 回歸模型預(yù)測(cè)生物量為2.19g·L-1。

取麥芽糖15.30g·L-1，酵母粉11.60g·L-1，溫度30.80°C，試驗(yàn)重復(fù)3 次。 3 次平行試驗(yàn)的米曲霉生物量分別為2.21，2.17 和2.25g·L-1，平均生物量為2.21g·L-1，與理論預(yù)測(cè)值相比相對(duì)誤差為0.002g·L-1，可見該模型能較好地模擬和預(yù)測(cè)培養(yǎng)條件對(duì)米曲霉生物量的影響。

圖5 Y=f(A，B)的響應(yīng)面與等高線Figure 5 Response surface and contour of Y=f(A,B)

圖6 Y=f(A，C)的響應(yīng)面與等高線Figure 6 Response surface and contour of Y=f(A,C)

圖7 Y=f(B，C)的響應(yīng)面與等高線Figure 7 Response surface and contour of Y=f(B,C)

2.3 米曲霉中產(chǎn)蛋白酶活力影響因素

2.3.1 培養(yǎng)基組成對(duì)產(chǎn)蛋白酶活力影響 米曲霉在自然pH 值，30°C 恒溫培養(yǎng)48h 時(shí)，考察不同碳氮比對(duì)蛋白酶活力的影響。 由表4 可知，分別以麥芽糖、酵母粉為碳源和氮源，隨著碳氮比的增加，中性蛋白酶活力逐漸增加，由（296.7±0.7）U·g-1升高至（412.2±0.4）U·g-1，酶活力提高38.9%。堿性蛋白酶活力先增加后降低，在C∶N=4∶1時(shí)，酶活力最高值為（335.1±0.3）U·g-1。 不同培養(yǎng)基組成對(duì)米曲霉蛋白酶活力影響顯著，中性蛋白酶活力明顯高于堿性蛋白酶且中性蛋白酶活力穩(wěn)定性較高，堿性蛋白酶活力波動(dòng)明顯，受碳氮比影響較大。當(dāng)C∶N=4∶1 時(shí)，米曲霉中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力分別達(dá)到最高值（412.2±0.4）U·g-1和（335.1±0.3）U·g-1，此時(shí)米曲霉蛋白酶活力最高，代謝活力最強(qiáng)。

2.3.2 培養(yǎng)基pH 值對(duì)產(chǎn)蛋白酶活力影響 在C∶N=4∶1，30°C 恒溫培養(yǎng)48h 時(shí)， 考察不同培養(yǎng)基pH 值對(duì)蛋白酶活力的影響。 由圖8 和圖9 可知，pH 值分別為6.0，7.0，7.5 時(shí)，米曲霉中性蛋白酶活力分別為（410.4±0.9），（408.5±0.01）和（395.4±0.4）U·g-1，顯著低于pH 值6.5 時(shí)中性蛋白酶活力[（530.2±0.4）U·g-1]。pH 值對(duì)蛋白酶活性的影響主要為破壞酶的空間結(jié)構(gòu)，影響酶活性部位催化基團(tuán)的解離狀態(tài)和底物解離狀態(tài)。在pH 值為6.5 時(shí)，蛋白酶分子上的極性基團(tuán)受到弱酸性環(huán)境的影響，處于較為穩(wěn)定的解離狀態(tài)，此時(shí)蛋白酶與底物結(jié)合表現(xiàn)出較高的活性。

表4 培養(yǎng)基組成對(duì)蛋白酶活力影響Table 4 Effect of medium composition on protease activity

相對(duì)于中性蛋白酶的穩(wěn)定狀態(tài)，堿性蛋白酶受pH 值影響波動(dòng)較大。 在pH 值分別為6.0 和7.0 時(shí)，堿性蛋白酶活力分別為（351.2±0.2）U·g-1和（351.5±0.9）U·g-1，顯著低于pH 值6.5 和7.5 時(shí)酶活力的（375.3±0.3）U·g-1和（408.8±0.4）U·g-1，比pH 值6.0 時(shí)酶活力分別提升6.9%和16.4%。中性蛋白酶和堿性蛋白酶分別在pH 值為6.5和7.5 時(shí)達(dá)到最高酶活力，但堿性蛋白酶活力低于中性蛋白酶活力。 培養(yǎng)基pH 值的變化對(duì)于中性蛋白酶和堿性蛋白酶的影響存差異，在相同pH 值時(shí)中性蛋白酶活力高于堿性蛋白酶，說明米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的酸堿耐受性更好。

圖8 pH 值對(duì)米曲霉中性蛋白酶活力影響Figure 8 Effect of pH on neutral protease activity of A.oryzae

圖9 pH 值對(duì)米曲霉堿性蛋白酶活力影響Figure 9 Effect of pH on alkaline protease activity of A.oryzae

2.3.3 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)蛋白酶活力影響 C∶N=4∶1、pH 值為6.5、 恒溫培養(yǎng)48h 時(shí)， 考察不同溫度對(duì)酶活力的影響。 由圖10 和圖11 可知，在不同溫度下，米曲霉中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力變化顯著。 溫度為30°C 時(shí)兩者酶活力達(dá)到最大值[（508.2±0.4）U·g-1]和[（392.4±0.3）U·g-1]。在28°C 時(shí)，中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力分別為（430.1±0.3）U·g-1和（380.3±0.4）U·g-1，32°C 時(shí)酶活力分別為（450.3±0.3）U·g-1和（385.8±0.3）U·g-1。不同溫度對(duì)中性蛋白酶和堿性蛋白酶影響趨勢(shì)相似，但堿性蛋白酶活力均低于中性蛋白酶活力，即使在30°C 時(shí)兩者酶活力相差115.8U·g-1。 此外，中性蛋白酶在相鄰溫度下酶活力之差分別為78.1U·g-1和57.9U·g-1，而堿性蛋白酶分別為12.1U·g-1和6.6U·g-1，說明相同溫度變化范圍內(nèi)，中性蛋白酶穩(wěn)定性低于堿性蛋白酶。

3 討論與結(jié)論

麥麩中含有64.5%碳水化合物，是理想的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)和產(chǎn)酶培養(yǎng)碳源[25]，而麥麩中主要的碳水化合物為麥芽糖，因此米曲霉在麥芽糖為碳源時(shí)表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。 KETIPALLY 等[26]優(yōu)化米曲霉產(chǎn)多聚半乳糖酶條件，以纖維素和麥芽提取物作為碳源和氮源時(shí)，獲得最高酶活力。本研究麥芽糖與酵母粉比例為4∶1 時(shí)，菌株產(chǎn)中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力最高， 其最佳酶活力溫度與多聚半乳糖酶相接近。 米曲霉生長(zhǎng)量和產(chǎn)酶量在30～35°C 具有最高值[27]，本研究中米曲霉生物量在30°C 達(dá)最高值，為（2.10±0.12）g·L-1，此溫度下中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力達(dá)最大值，分別為（508.2±0.4）U·g-1和（392.4±0.3）U·g-1，與SHAFIQUE 等[28]和DJEKRIFDAKHMOUCHE 等[29]研究結(jié)果一致。

圖10 培養(yǎng)溫度對(duì)米曲霉中性蛋白酶活力影響Figure 10 Effect of culture temperature on neutral protease activity of A.oryzae

圖11 培養(yǎng)溫度對(duì)米曲霉堿性蛋白酶活力影響Figure 11 Effect of culture temperature on alkaline protease activity of A.oryzae

蛋白酶作為最重要的水解酶和工業(yè)酶類[30]，在全球總酶類銷售中占有60%的比例，被應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)[31]，具有極高的商業(yè)價(jià)值[32]。 在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，蛋白酶能夠分解原料中蛋白質(zhì)，產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)增加食品風(fēng)味[33]。 米曲霉普遍存在于發(fā)酵食品，其蛋白酶研究對(duì)于發(fā)酵食品制作工藝優(yōu)化具有重要意義。 米曲霉中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力對(duì)奶酪中營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味的形成十分重要，兩者活力的提高對(duì)于奶酪品質(zhì)改良影響顯著。研究獲得的米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶和堿性蛋白酶培養(yǎng)條件，使其活力分別提高69.49%和53.59%，利于米曲霉在霉菌奶酪中的應(yīng)用。 除蛋白酶研究外，米曲霉其它酶類研究在乳糖分解[34]、木質(zhì)素催化降解[35]、去除酒糟化學(xué)需要量[36]等應(yīng)用中進(jìn)展迅速，奠定了米曲霉在食品發(fā)酵中的重要地位。

米曲霉培養(yǎng)條件優(yōu)化，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)研究十分重要[37]，本研究中優(yōu)勢(shì)米曲霉作為新型霉菌奶酪發(fā)酵劑，最佳培養(yǎng)條件為麥芽糖15.30g·L-1、酵母粉11.60g·L-1、溫度30.80°C、pH 值7.0，高產(chǎn)中性蛋白酶和堿性蛋白酶條件分別為pH 值6.5 和pH 值7.5、C∶N=4∶1、溫度30°C，為后續(xù)霉菌奶酪制作和品質(zhì)研究提供參考。 米曲霉菌株在傳統(tǒng)發(fā)酵食品工業(yè)中具有長(zhǎng)期的安全歷史[38-39]，其作為霉菌奶酪新菌種的開發(fā)將為國(guó)內(nèi)新型霉菌奶酪研制提供理論依據(jù)。