羅同陽，高慶華，董 聰，馬金國(guó)，王 玥，王慶慶

(河北省微生物研究所，河北保定 071051)

白洋淀位于河北省中部，是海河流域最大的淡水湖泊，也是華北地區(qū)最大的內(nèi)陸淡水湖泊，水質(zhì)肥美，生物繁茂，歷史上有“華北明珠”之稱[1,2]。近年來隨著人民生活水平提高，白洋淀旅游業(yè)發(fā)展迅速，但是由于盲目擴(kuò)張，開發(fā)過程中缺乏科學(xué)的規(guī)劃以及管理，水域生態(tài)系統(tǒng)受到過多的人為因素干擾，湖水質(zhì)量惡化，生態(tài)系統(tǒng)受到破壞[3]。尤其是在夏季，由于氣溫升高，水中浮游動(dòng)物、浮游植物以及魚、蝦等水生生物生長(zhǎng)旺盛，會(huì)產(chǎn)生大量代謝物，加之隨著降水量增多，周圍工業(yè)廢水和生活污水隨地表徑流進(jìn)入湖中，加重水體污染。

在水生生態(tài)系統(tǒng)中，微生物群落是生物地球化學(xué)循環(huán)的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)演變的研究和評(píng)價(jià)非常重要[4]。細(xì)菌是微生物的重要組成部分，其在水環(huán)境中的作用十分重要，它們能夠把有機(jī)物礦化成能被浮游植物利用的無機(jī)化合物，并且是水生食物網(wǎng)中的重要營(yíng)養(yǎng)環(huán)節(jié)，其群落的豐度和多樣性直接受水體環(huán)境的影響，能在一定程度上反映湖泊生態(tài)系統(tǒng)的健康情況[5]。但是目前對(duì)于白洋淀的研究主要為浮游動(dòng)物、浮游植物多樣性，水環(huán)境現(xiàn)狀分析[6-8]等方面，對(duì)于水體微生物的研究較少。近年來分子生物學(xué)發(fā)展迅速，通過高通量測(cè)序能夠快速準(zhǔn)確地獲得樣品中微生物群落的組成[9]，因此，本研究通過16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序分析技術(shù)，對(duì)白洋淀夏季水域進(jìn)行采樣，解析水體細(xì)菌群落分布特征并與環(huán)境因子進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期為白洋淀環(huán)境監(jiān)測(cè)和污染防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)布設(shè)

于2019年8月份，結(jié)合白洋淀水域情況，水樣調(diào)查共設(shè)置8個(gè)采樣點(diǎn)，如圖1所示，燒車淀(SCD)位于淀區(qū)最北部，水面開闊，棗林莊(ZLZ)為淀區(qū)出水口，這兩地距離污染源較遠(yuǎn)，受人為活動(dòng)干擾小，水質(zhì)較好；圈頭(QT)、光淀(GD)、采浦臺(tái)(CPT)和端村(DC)屬于典型水上村落，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)較發(fā)達(dá)；王家寨(WJZ)是白洋淀旅游景區(qū)，受人為活動(dòng)影響較大；南劉莊(NLZ)為污水性河流入口，水質(zhì)較差。

1.2 樣品的采集

采集方法為使用1 L有機(jī)玻璃采水器(型號(hào)為WB-PM，北京普利特儀器有限公司)在水域表層、中層、底層各采集2 L水樣，6 L水樣混合均勻后采集2 L水樣作為一個(gè)處理，每個(gè)采樣點(diǎn)共三個(gè)處理。

圖1 白洋淀采樣點(diǎn)布設(shè)Fig.1 Sampling sites map of the Baiyangdian lake 1.SCD；2.GD；3.NLZ；4.WJZ；5.ZLZ；6.QT；7.CPT；8.DC

1.3 水質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

采用便攜式pH計(jì)(型號(hào)為pH5F平面筆式pH計(jì)，上海三信儀表廠)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定水溫(T)及pH，塞氏盤法測(cè)定透明度(SD)。其他指標(biāo)在樣品帶回實(shí)驗(yàn)室24 h內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。溶解氧(DO)采用GB7489-1987《水質(zhì) 溶解氧的測(cè)定 碘量法》，生化需氧量(BOD5)依據(jù)HJ 505-2009《水質(zhì) 五日生化需氧量(BOD5)的測(cè)定 稀釋與接種法》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定。化學(xué)需氧量(COD)、總磷(TP)和總氮(TN)通過紫外可見智能型多參數(shù)水質(zhì)分析儀測(cè)定(型號(hào)為L(zhǎng)H-3BA，華聯(lián)科技)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel處理后，采用SPSS軟件的One-way ANOVA程序進(jìn)行顯著性分析，多重比較采用Duncan方法檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，測(cè)定結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

1.5 DNA的提取及高通量測(cè)序

取1 L水樣通過微孔濾膜(直徑50 mm，孔徑0.22 mm)進(jìn)行抽濾。抽濾過后的濾膜收集于無菌培養(yǎng)皿中，存放干冰盒內(nèi)。每個(gè)采樣點(diǎn)三個(gè)處理的濾膜合并為一個(gè)樣本送至諾禾致源公司(天津)進(jìn)行樣品基因組DNA提取、16S rDNA基因擴(kuò)增和測(cè)序，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多樣性分析。

DNA的提取和PCR擴(kuò)增：采用SDS方法對(duì)樣本基因組DNA進(jìn)行提取，之后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，將提取得到的DNA進(jìn)行稀釋備用。PCR擴(kuò)增及其高通量測(cè)序采用細(xì)菌引物為(515F和806R)，以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer進(jìn)行PCR。

PCR產(chǎn)物的混樣和純化：PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，對(duì)目的條帶使用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

文庫構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序：使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和QPCR定量，文庫合格后，使用Illumina NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 水質(zhì)理化性質(zhì)分析

由表1可以看出，白洋淀夏季各采樣點(diǎn)水溫基本在25 ℃，差異不大，平均pH為7.95，為偏堿性湖泊。采樣點(diǎn)之間SD差異顯著，SCD和ZLZ兩地透明度較高，均超過100 cm，水質(zhì)較清澈。各采樣點(diǎn)DO含量較高，平均值可達(dá)16.67 mg/L。COD含量在12.04～65.47 mg/L波動(dòng)，WJZ含量最低。BOD5含量為1.26～5.43 mg/L，SCD、CPT和DC含量相對(duì)較高，與其他地區(qū)差異顯著。TN的濃度在1.11～4.71 mg/L之間波動(dòng)，含量最高水域?yàn)镹LZ，差異顯著，最低為SCD。不同樣點(diǎn)間TP濃度差異也較大，在0.025～0.145 mg/L之間波動(dòng)，DC含量最高，ZLZ含量最低。

2.2 細(xì)菌多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)可以反映出樣本內(nèi)的微生物群落多樣性。Coverage指數(shù)代表測(cè)序?qū)ξ锓N的覆蓋度，表2中Coverage指數(shù)均大于0.99，說明樣本測(cè)序結(jié)果可以反映樣品的真實(shí)情況。稀釋曲線(圖2)基本趨于平緩，也反映出測(cè)序深度達(dá)到要求，可信度較高。Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)常用于物種豐富度的評(píng)價(jià)，由表可以看出白洋淀整體細(xì)菌群落豐富度較高，其中GD地區(qū)細(xì)菌豐富度最高，QT地區(qū)豐富度最低。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)通常被用來評(píng)價(jià)微生物群落多樣性，Shannon指數(shù)越高，物種多樣性越好，穩(wěn)定性越強(qiáng)；Simpson指數(shù)越高，群落多樣性越低，穩(wěn)定性越差[10]。表中可以看出Shannon指數(shù)較高，為7.151～8.443，Simpson指數(shù)較低，為0.986～0.992，說明白洋淀各采樣點(diǎn)微生物群落多樣性較豐富，穩(wěn)定性較好，且同樣以GD地區(qū)多樣性最為豐富。

表1 白洋淀水質(zhì)理化指標(biāo)Tab.1 Physical and chemical properties of Baiyangdian lake

表2 白洋淀水域細(xì)菌群落的α-多樣性指數(shù)Tab.2 Microbial α-diversity index of samples in each station of the Baiyangdian lake

圖2 稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of OTU number

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征

如圖3所示，白洋淀細(xì)菌序列主要分布于10個(gè)菌門中，其中變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)之和在各個(gè)樣品中可達(dá)90%以上。各采樣點(diǎn)中變形菌門(Proteobacteria)均為第一優(yōu)勢(shì)門類，占全細(xì)菌群落的44.15%～60.18%。QT地區(qū)厚壁菌門(Firmicutes)為第二優(yōu)勢(shì)菌，豐度為23.34%，但在其他采樣點(diǎn)，該菌含量均較低。龐微菌門(Verrucomicrobia)相對(duì)于各采樣點(diǎn)之間，在SCD和CPT地區(qū)含量較高，豐度分別為5.45%和5.67%。其他被檢測(cè)到的主要優(yōu)勢(shì)菌門還有綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)。

圖3 門水平物種群落組成Fig.3 Community composition of phylum level

在屬水平上，白洋淀各采樣點(diǎn)檢測(cè)到的細(xì)菌主要屬于變形菌門，且豐度差異較大(表3)。除QT地區(qū)外，其余采樣點(diǎn)基本以u(píng)nidentified_Cyanobacteria、多核桿屬(Polynucleobacter)和Limnohabitans為主要優(yōu)勢(shì)菌屬，其中WJZ地區(qū)三者豐度之和最大，為22.17%，GD地區(qū)三者豐度之和最小，為11.53%。而QT地區(qū)以奈瑟菌屬(Neisseria)和嗜血桿菌屬(Haemophilus)為主要優(yōu)勢(shì)菌屬，豐度之和達(dá)9.65%。ZLZ地區(qū)鏈球菌屬(Streptococcus)含量最高，豐度為5.46%，GD地區(qū)地桿菌屬(Geobacter)含量相比其他地區(qū)較高，豐度為4.80%。其他檢測(cè)到的菌屬主要還有Vogesella，噬氫胞菌屬(Hydrogenophaga)和產(chǎn)乙醇桿菌屬(Ethanoligenens)。較為特殊的是在SCD地區(qū)和CPT地區(qū)均未檢出嗜血桿菌屬(Haemophilus)，且CPT地區(qū)還未檢出鏈球菌屬(Streptococcus)。

表3 屬水平上物種群落組成/%Tab.3 Community composition of genus level/%

2.4 環(huán)境因子分析

通過R軟件(Version 2.15.3)進(jìn)行CCA分析，在門水平上構(gòu)建了白洋淀細(xì)菌群落與環(huán)境變量之間的關(guān)系。如圖4所示，第一主軸與第二主軸對(duì)細(xì)菌群落相對(duì)豐度方差的解釋占比分別為73.42%和17.96%，兩者共解釋91.38%的方差變化，表明細(xì)菌群落和環(huán)境變量之間關(guān)系可靠。DO和pH對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布影響較大，DO與第一、第二排序軸的相關(guān)性分別為-0.3716、0.9284，藍(lán)細(xì)菌門、擬桿菌門和龐微菌門受其影響較大，存在負(fù)相關(guān)性。pH與第一、第二排序軸的相關(guān)性分別為-0.6527和-0.7576。pH和與變形菌門呈顯著性負(fù)相關(guān)，與龐微菌門呈現(xiàn)正相關(guān)性。

3 討論

3.1 水質(zhì)分析

白洋淀湖泊水體溶氧整體較高，說明水體自凈能力較好[11]。在對(duì)白洋淀水質(zhì)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，該水域整體呈堿性，QT、CPT、DC相比其他采樣點(diǎn)水質(zhì)更偏堿性，且TN和TP含量也相對(duì)較高， 更適宜藻類繁殖[12-14]，導(dǎo)致水體SD較低。夏季是漁業(yè)網(wǎng)箱養(yǎng)殖的旺季，大量魚蟹餌料的投入會(huì)引起有機(jī)耗氧量的增加導(dǎo)致COD的升高[15]，QT、CPT和DC水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)較發(fā)達(dá)，因而COD含量更高。

圖4 白洋淀細(xì)菌與環(huán)境因子CCA分析Fig.4 CCA of bacterial and environmental factors in Baiyangidna lake

SCD由于位于最北部，水面開闊，水生植物較多，能快速吸收氮磷等營(yíng)養(yǎng)物，分解有機(jī)污染物[16]，水體TN和TP含量較低，SD較高，水質(zhì)較好。

3.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

α-多樣性指數(shù)是反映微生物多樣性的綜合性指標(biāo)，豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)尤為重要。與鄱陽湖和北海湖細(xì)菌多樣性相比[17,18]，白洋淀Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)和shannon指數(shù)均較高，表明白洋淀水域細(xì)菌豐富度和多樣性較好。

通過高通量測(cè)序，對(duì)白洋淀水域細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布特征進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)不同水域細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)相似，優(yōu)勢(shì)菌門主要有變形菌門、厚壁菌門、藍(lán)細(xì)菌門、擬桿菌門和放線菌門，這些都屬于典型的淡水細(xì)菌門類，其他研究水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的文獻(xiàn)結(jié)果相似，但在屬水平上，不同地區(qū)差異較大[19-21]。

變形菌門是水環(huán)境中普遍存在的一種原核生物，有研究指出在濕地、污染河流和深海沉積物等環(huán)境中以第一優(yōu)勢(shì)門存在[22-24]，在本研究中同樣表現(xiàn)為相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌門。在屬水平上，Limnohabitans作為主要的優(yōu)勢(shì)菌屬，TP和TN有利于其生長(zhǎng)繁殖[18]，間接反映出水體TP、TN含量較高。本試驗(yàn)結(jié)果還顯示藍(lán)細(xì)菌的相對(duì)豐度較高，是由于其嗜高溫的特性使其在夏季大量繁殖[25,26]。除此之外藍(lán)細(xì)菌在水體自凈中也可起到積極作用，能夠吸收水體中氮、磷等無機(jī)物，可作為水體富營(yíng)養(yǎng)化的指示生物，因此一定程度上也可表明白洋淀水體中氮、磷等含量較高。除此之外檢測(cè)出的厚壁菌門和龐微菌門也均是富營(yíng)養(yǎng)化水體中常見的細(xì)菌[27,28]。白洋淀水中還檢測(cè)到存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的一些致病菌，例如擬桿菌門以及進(jìn)一步檢測(cè)到的鏈球菌屬、奈瑟菌屬和嗜血桿菌屬[29,30]，且所占比例均相對(duì)較高，說明該區(qū)域受人為活動(dòng)的影響較大。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)白洋淀水域的細(xì)菌宏基因組16S rDNA測(cè)序及OTUs分子生物信息分析表明，不同采樣點(diǎn)水體中細(xì)菌均具有較高的豐富度和多樣性，穩(wěn)定性較好，且以光淀(GD)地區(qū)多樣性最為豐富。在門分類水平上，變形菌門、厚壁菌門 、藍(lán)細(xì)菌門、放線菌門和擬桿菌門為白洋淀水域主要優(yōu)勢(shì)菌門，平均豐度之和能達(dá)到90%，變形菌門為第一優(yōu)勢(shì)門類；屬水平上以u(píng)nidentified_Cyanobacteria、多核桿屬和Limnohabitans為主要優(yōu)勢(shì)菌屬。CCA分析結(jié)果顯示DO和pH是影響白洋淀細(xì)菌群落分布的主要環(huán)境因子。