張 力,李敬龍

齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 生物工程學院,生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室,濟南 250353

大蠟螟(Galleriamellonella)是一昆蟲綱,鱗翅目,螟蛾科昆蟲,其免疫特點與哺乳動物近似,體內(nèi)蛋白質含量極其豐富,利用其生長繁殖周期短等特點,常常被廣泛應用在病原菌感染模型當中,以此來研究致病的機制和相關基因轉錄組的分析[1-2]。

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)在國內(nèi)外被用于害蟲的生物防治實驗與研究,且取得很好的對害蟲持續(xù)性的消除控制功效,其被廣大科學研究者稱為最具開發(fā)潛力的昆蟲病原真菌之一[3-4]。實驗室從大蠟螟上分離得到6個樣品并進行轉錄本的對比分析,共檢測到12 770個共表達的基因。我們利用轉錄組測序技術分析了大蠟螟幼蟲,在受白僵菌侵染的免疫應答相關基因,使用 TRIzol 法,利用苯酚等物質從感染了 B6 菌株和感染野生菌株的 3 d的大蠟螟幼蟲(200 mg)中分離提取出總 RNA,并對其進行定性和定量分析,研究高毒力菌株侵染的大蠟螟幼蟲的轉錄組變化情況,為從分子學水平上應用白僵菌防治生物害蟲的研究奠定信息學基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和供試昆蟲

實驗中使用的球孢白僵菌野生菌株B.bassianaARSEF2860,由實驗室保存。實驗中使用的球孢白僵菌高毒力菌株為實驗室通過ARTP和FACS誘變篩選得到。

1.2 白僵菌侵染

將4齡的大蠟螟幼蟲分別浸泡在濃度為107個/ml的野生型和高毒力菌種B6的分生孢子懸浮液中,以浸泡在0.02%無菌吐溫-80中的大蠟螟幼蟲作為對照組進行試驗。浸泡10 s后,立即將大蠟螟幼蟲拿出,并放入干凈的透明塑料盒中,在室溫下培養(yǎng)3 d。每組實驗使用30頭大蠟螟幼蟲,處理組和對照組各取3個生物學重復。

1.3 RNA提取、文庫制備和轉錄組測序

使用TRIzol法,利用苯酚等物質從感染了B6菌株和感染野生菌株的3 d的大蠟螟幼蟲(200 mg)中分離提取出總RNA,并對其進行定性和定量分析。用磁珠對mRNA進行純化,分別合成兩條cDNA產(chǎn)物。cDNA片段產(chǎn)物純化驗證后,用phi29擴增以制成DNA納米球并在BGISEQ-500平臺上讀取150 bp的單端讀數(shù)。

利用Trimmomatic對原始數(shù)據(jù)進行過濾,去掉原始數(shù)據(jù)中帶有接頭的數(shù)據(jù)、含N的比例大于5%的數(shù)據(jù)以及低質量數(shù)據(jù),最后獲得純凈數(shù)據(jù)。將純凈數(shù)據(jù)與參考基因組進行對比。為探究大蠟螟幼蟲對高毒力菌株侵染的反應變化,將差異倍數(shù)為兩倍以上(|FC|≥4),Q≤0.001的基因定義為顯著差異表達基因。對差異基因進行GO和KEGG的基因功能和生物通路進行分類分析和富集分析,Q≤0.05視為顯著富集。

2 結果與分析

研究對球孢白僵菌高毒力菌株和野生型菌株侵染得到的6個樣品(B6和野生型各三組樣品)進行轉錄本的對比分析,在高毒力和野生型球孢白僵菌菌株感染72 h的大蠟螟4齡幼蟲中,共檢測到12 770個共表達的基因。用Log2 Fold Change(FC)作為篩選標準,得到了|FC|≥4,Q≤0.001的224個上調基因和227個下調基因,并定義為顯著差異表達的差異基因。

2.1 顯著差異基因的GO(Gene ontology)GO分類

Gene Ontology分類分析根據(jù)451個顯著差異基因的功能將其分為分子功能(molecular function)、細胞組分(cellular component)和生物過程(biological process)等三大類中的33條GO二級條目中。

注釋在生物過程分類中的差異基因分布于13條GO二級條目,其中,注釋到代謝過程的差異基因數(shù)目是最多的,其次是細胞過程條目。注釋到細胞過程的17個差異基因中,有15個是顯著下調的,注釋到代謝過程的23個差異基因中有14個是顯著下調的。注釋在細胞組分分類中的差異基因分布于12條GO二級條目,其中,注釋到膜和膜的一部分條目的差異基因數(shù)目是最多的。注釋到這兩個條目的63個差異基因中,有42個是顯著上調的。注釋在分子功能分類中的差異基因分布于8條GO二級條目,其中,注釋催化活性條目的差異基因數(shù)目是最多的,其次是結合。注釋到這兩個條目的差異基因分別是52個和45個,都分別有31個是顯著下調的,具體分類見表1、表2和表3。

表1 感染高毒力菌株的大蠟螟幼蟲轉錄組中差異表達基因的GO分類(生物過程) 個

表2 感染高毒力菌株的大蠟螟幼蟲轉錄組中差異表達基因的GO分類(細胞組成) 個

表3 感染高毒力菌株的大蠟螟幼蟲轉錄組中差異表達基因的GO分類(分子功能) 個

2.2 顯著差異基因的KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集

將顯著性差異的基因進行KEGG富集,451個差異基因注釋在了231條代謝通路上。其中有18條條目的Q≤0.05,被視為了顯著富集。在顯著富集的18條途徑當中,注釋在蛋白質消化和吸收途徑,胰液分泌,腎素血管緊張素系統(tǒng)和溶酶體途徑中的上調基因是多于下調基因的。其余的代謝途徑中下調基因數(shù)目多于上調基因。其中,注釋在脂肪酸合成途徑的13個差異基因中有9個是顯著下調的。注釋在脂肪酸代謝途徑的22個差異基因中有17個是顯著下調的。注釋到RNA聚合酶途徑的16個基因中有11個是顯著下調的。注釋在AMPK途徑的15個基因中有11個是顯著下調的見表4。

表4 感染高毒力菌株的大蠟螟幼蟲轉錄組中差異表達基因的KEGG富集

續(xù)表

2.3 顯著差異基因分析

為了進一步研究高毒力菌株侵染的大蠟螟幼蟲的轉錄組變化情況,我們把所有差異基因按照差異倍數(shù),即Log2 Fold Change進行排序,分別統(tǒng)計了上調和下調程度最高的20個差異基因進行分析。

結果顯示,前20個上調基因的FC范圍在11.29～8.02。其中,2個與麥芽糖酶表達相關的基因,2個與胰蛋白酶表達相關的基因和3個與氨肽酶表達相關的基因是顯著上調的。這與KEGG富集分析蛋白質消化吸收途徑的上調是一致的。前20個下調基因的FC范圍在-12.55～-7.47。值得注意的是,其中有4個與脂肪酸合成相關的酶和一個與脂肪酶相關的酶是顯著下調的。這與富集分析中脂肪酸合成和代謝途徑的下調結果是一致的,見表5和表6。

表5 B6對WT感染的大蠟螟DEGs的前20個上調基因

表6 B6對WT感染的大蠟螟DEGs的前20個下調基因列表

3 討 論

當球孢白僵菌侵染寄主時,首先會將分生孢子附著在昆蟲角質層上并萌發(fā)菌絲體,在此過程中分泌蛋白酶和幾丁質酶等會破壞角質層[5]。菌絲體穿透角質層到達宿主血腔后,會破壞血細胞的細胞壁結構,分泌次生代謝物以逃避宿主免疫[6]。分生孢子轉換成芽生孢子以便快速增殖并消耗宿主營養(yǎng)[7-8]。此外,球孢白僵菌還會產(chǎn)生白僵素、卵孢霉素有毒代謝物加速昆蟲的死亡[9-10]。

在昆蟲病原性真菌的研究中,對宿主進行轉錄組分析可以對宿主的病原體的相互作用進行整體性研究[11-12]。本研究對球孢白僵菌高毒力菌株B6和wt感染3 d的大蠟螟4齡幼蟲轉錄組進行了G0分類注釋和KEGG富集分析。分析表明,在B6感染3 d后的大蠟螟幼蟲中檢測到622個上調基因和869個下調基因。用Log2 Fold Change(FC)作為篩選標準,得到了|FC|≥4,Q≤0.001的224個上調基因和 227個下調基因。

轉錄組分析結果表明,高毒力菌株侵染3 d后,大蠟螟體內(nèi)脂肪酸合成,AMPK信號通路,糖原異生等代謝過程以及催化活性,RNA聚合等活性受到了高度抑制。其中,脂肪酸合成途徑中,14個編碼脂肪酸合成酶(FAS)的酰基載體蛋白的基因被下調,從而抑制了脂肪酸的合成。值得注意的是,下調的14個編碼FAS酰基載體蛋白的基因與AMPK信號通路高度相關。AMPK信號通路是生物體中保持和調節(jié)細胞能量動態(tài)平衡的重要信號通路[13-14]。

除此之外,大蠟螟幼蟲中的蛋白質的消化和吸收進程,腎素血管緊張素系統(tǒng)以及免疫反應被高度激活。在蛋白質的消化吸收途徑中,21個分別編碼胰蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶N的基因被顯著上調。在大蠟螟免疫反應相關的基因中,與吞噬體,溶酶體和生物刺激反應相關的12個基因被上調。除此之外,9個與抗菌肽合成有關的基因也被顯著上調。使用印楝素處理的Bactroceradorsalis幼蟲在組織蛋白酶高度表達時,幼蟲的生長和發(fā)育受到了顯著抑制[15]。家蠶和血吸蟲通過上調C-溶菌酶的表達來抵抗病毒和細菌的侵襲[16-17]。

研究對侵染高毒力菌株的大蠟螟幼蟲轉錄組進行分析,從轉錄組層面對宿主和高毒力病原體的相互作用進行了進一步研究。為篩選高毒力病原體提供了潛在靶點。