李曉杰,李富強(qiáng),朱麗萍,顏世敢

齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物工程學(xué)院,山東省微生物工程重點實驗室,濟(jì)南 250353

肽是蛋白質(zhì)降解后產(chǎn)生的一類分子量介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間的化合物,通常由幾個至幾十個氨基酸組成。生物活性肽是指具有特定生物學(xué)功能的多肽,相對分子質(zhì)量小于6 000 Da。生物活性肽能直接被機(jī)體快速吸收,吸收率超過蛋白質(zhì)和氨基酸。生物活 性肽具有多種生理功能特性[1]。根據(jù)生理學(xué)功能可分為抗菌肽、神經(jīng)活性肽、免疫活性肽和抗氧化肽等。如從亞麻籽蛋白水解物和豌豆蛋白水解物中分離的二肽IR、KF和EF在體外顯示腎素抑制作用[2]；從紫貽貝蛋白水解物中分離的多肽EVMAGNLYPG具有降血壓功能[3]；從明膠中分離的肽HGPLGPL具有抑制脂質(zhì)過氧化功能[4]。

利用肽獨特的功能來生產(chǎn)功能性食品、保健品、醫(yī)用食品等,應(yīng)用前景廣闊。生物活性肽的研發(fā)、應(yīng)用離不開其高效的制備和鑒定技術(shù)。綜述了國內(nèi)外生物活性肽的制備和鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展,為生物活性肽的研發(fā)提供參考。

1 生物活性肽的制備技術(shù)

生物活性肽的制備方法主要有化學(xué)水解法、酶解法、微生物發(fā)酵法三種。不同的制備方法得到的肽的純度、理化性質(zhì)和功能活性不同。其中酶解法最常用,制備的多肽安全性高,易被人體消化吸收,且生產(chǎn)條件溫和、易控制。

1.1 酶解法

酶解法是利用胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和堿性蛋白酶等蛋白水解酶制備活性肽。不同蛋白酶的酶切位點不同,制備的多肽的種類、大小、生物活性存在差異[5]。Himani[6]分別用胰蛋白酶和胃蛋白酶水解小米蛋白,胰蛋白酶水解液中肽的含量(2.14%)顯著高于胃蛋白酶水解液(1.53%)。對胰蛋白酶水解物進(jìn)行純化,發(fā)現(xiàn)水解后小米蛋白的抗氧化活性顯著提高。這是因為水解過程增強(qiáng)了肽清除自由基的能力。

酶法制備多肽時,需要研究酶的種類、用量、底物濃度、溫度、pH、時間等參數(shù)對制備多肽的影響。不同條件制備的多肽的質(zhì)量和純度不同。楊雪[7]用酶解法制備菜籽多肽,通過單因素逐級優(yōu)化實驗最終采用堿性蛋白酶酶解,最佳條件為底物濃度4%、加酶量7%(E/S)、溫度50 ℃、pH 8.5、酶解時間120 min、多肽含量為35.4 mg/mL。張周莉[8]采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解法制備豬肩胛骨抗氧化肽,篩選出風(fēng)味蛋白酶為最優(yōu)酶,在最優(yōu)酶解工藝參數(shù)下獲得的肽的得率為62.80%。Bah[9]用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和真菌FP400和FPII的蛋白酶水解動物血液制備多肽,選用木瓜蛋白酶水解生成的紅細(xì)胞水解產(chǎn)物表現(xiàn)出更高的三價鐵還原抗氧化劑能力(FRAP)和氧自由基吸收能力(ORAC)。

采用復(fù)合酶水解法能夠克服酶作用的單一性及水解效率較低的弊端,能提高酶解效率。劉靜[10]用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶協(xié)同水解大豆蛋白制備小分子大豆肽,3種酶協(xié)同水解明顯優(yōu)于單酶,制得的大豆肽相對分子質(zhì)量集中在6 000 Da以下。多酶復(fù)合水解也能降低多肽的苦味值,林洋[11]篩選出堿性、中性蛋白酶和胰蛋白酶進(jìn)行復(fù)合酶解豆粕制備大豆肽,通過對比單酶、雙酶及3種酶酶解豆粕的水解度和苦味值兩項,發(fā)現(xiàn)3種酶組合使用制備大豆肽水解度更高、苦味更低。

1.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物活性肽,是利用微生物發(fā)酵過程產(chǎn)生的蛋白酶將蛋白質(zhì)分子分解成多肽或游離氨基酸的工藝,發(fā)酵的同時還會產(chǎn)生蛋白酶以外的酶來降解復(fù)雜的碳水化合物和脂質(zhì)[12]。常用的微生物有枯草芽孢桿菌、放線菌、黑曲霉、米曲霉、釀酒酵母等。

呂靖[13]采用米曲霉和枯草芽孢桿菌共生發(fā)酵魔芋粉制備魔芋多肽。劉曉艷[14]用枯草芽孢桿菌、米曲霉和釀酒酵母固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)大豆多肽,最終發(fā)酵物中多肽得率達(dá)54.89%,發(fā)酵產(chǎn)物中多肽含量為21.47%,枯草芽孢桿菌和米曲霉分泌蛋白酶可以降解基料中的蛋白質(zhì),使其分解成小肽,米曲霉可以將淀粉和纖維素降解為簡單糖類物質(zhì),釀酒酵母分解糖類,產(chǎn)生醇香味,增加多肽飼料的適口性。王勇[15]采用復(fù)合菌共生發(fā)酵法制備甘薯蛋白肽,枯草芽孢桿菌與黑曲霉按1.5:1.0比例混合,用混合菌種發(fā)酵甘薯蛋白粉,產(chǎn)生的內(nèi)肽酶和端肽酶可將甘薯蛋白水解為具有一定DPPH自由基清除能力以及還原能力的小分子肽類物質(zhì)。

微生物代謝活動產(chǎn)生的混合酶可以將生物活性肽水解釋放,同時微生物可借助多肽水解液提高生長及產(chǎn)酶能力,循環(huán)協(xié)作,效率更高。雖然微生物發(fā)酵法具有成本低、蛋白酶產(chǎn)量高等優(yōu)點,但是微生物發(fā)酵及代謝過程復(fù)雜,產(chǎn)物難以控制,會產(chǎn)生很多雜質(zhì),對于后期的分離純化有一定的難度。

1.3 化學(xué)水解法

化學(xué)水解法是指在一定溫度下,通過化學(xué)試劑將蛋白質(zhì)分子的肽鏈斷裂,使之形成小分子多肽物質(zhì)的方法[16],包括酸水解法和堿水解法。酸水解法的成本低,但導(dǎo)致色氨酸完全破壞,蛋氨酸部分丟失,谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸,天冬酰胺轉(zhuǎn)化為天冬氨酸。堿水解法也具有成本低的優(yōu)點,并且可以獲得100%的色氨酸回收率。然而,導(dǎo)致大多數(shù)原子吸收光譜完全破壞。趙林[17]以蠶絲為原材料,用高溫高壓堿法進(jìn)行水解,得到絲膠多肽水解液,最佳水解條件為:溫度120 ℃,pH11,時間4 h。

酸堿水解法相對簡單,生產(chǎn)成本低,但水解條件難以控制,氨基酸易破壞,產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定,所以此法多用于實驗室研究,不適合工廠生產(chǎn)。

2 生物活性肽的分離純化技術(shù)

多肽的種類繁多,根據(jù)多肽與蛋白質(zhì)、氨基酸的分子量不同、電荷性質(zhì)和多少、疏水性等理化性質(zhì)選擇適宜的分離純化方法。常用的分離純化方法包括化學(xué)浸提法、鹽析法、超濾法、色譜法等。每種方法分離程度不同,需要將幾種方法組合在一起進(jìn)行生物活性肽的分離純化。初步選用超濾、凝膠過濾層析進(jìn)行分離純化后再通過高效液相色譜分離出最后的目標(biāo)組分。

2.1 化學(xué)浸提法

化學(xué)浸提法是指使用化學(xué)試劑直接提取生物活性肽的方法。該法操作簡便,成本較低。但耗費能源較多,揮發(fā)出的有機(jī)溶劑對周圍環(huán)境污染較大。常用的提取方法是溶劑萃取法,目前常用的提取溶劑有水、乙酸、乙酸銨、高氯酸等[18]。忽曉平[19]采用酸溶醇沉法從金華火腿提取多肽,研究了鹽酸、磷酸鹽緩沖溶液兩種浸提液和乙醇的體積分?jǐn)?shù)對金華火腿粗多肽提取效果的影響,結(jié)果表明乙醇沉淀大蛋白除雜,多肽提取率達(dá)4.64%。孟春英[20]根據(jù)抗菌肽的陽離子特性,用5%乙酸浸提法以仿刺參體壁為原料進(jìn)行粗提,以抑菌活性為指標(biāo)分離抗菌肽,效果顯著。

2.2 鹽析法

鹽析法是在溶液中加入硫酸銨、硫化鈉或氯化鈉等中性鹽使其達(dá)到飽和度而析出蛋白質(zhì)或多肽。張虹[21]對大豆蛋白酶粗提液經(jīng)硫酸銨分級沉淀可以得到不同飽和度的九個鹽析組分。吳疆[22]對提取的抗菌肽溶液進(jìn)行兩次硫酸銨鹽析,得到的抗菌肽樣品可以達(dá)到直接電泳純化的純度,說明通過兩次硫酸銨鹽析方法可以很大程度提高乳源抗菌肽的純度。

鹽析法析出的蛋白質(zhì)或多肽為可逆性變性,一定條件下可恢復(fù)活性,操作簡便,多次鹽析可提高產(chǎn)物純度。

2.3 超 濾

超濾是以壓力差為推動力的一種膜分離過程。一般使用1～10 kDa的膜分離生物活性肽,濾膜孔徑在0.001～0.005 μm之間,在田少軍[23]采用不同截留分子量的超濾膜進(jìn)行超濾分離大豆分離蛋白酶解液,通過研究超濾過程中操作壓力、料液質(zhì)量濃度、超濾時間對超濾膜通量的影響,并測定各超濾成分清除·OH與DPPH·的能力,操作壓力0.2 MPa、料液質(zhì)量濃度50 g/L、通過相對分子質(zhì)量為10 kDa、3 kDa、1 kDa超濾膜,操作時間80 min的超濾條件下分離大豆肽,超濾效果較好。

超濾操作簡便,設(shè)備簡單,成本低,更適合工廠生產(chǎn),但是超濾膜容易堵塞,需要及時清理更換,且分離的多肽分子量相差不能太小。

2.4 色譜法

色譜法又稱層析法,是常用的肽分離純化方法,具有很好的分離能力。根據(jù)分離原理的不同,分為凝膠過濾層析、離子交換層析和親和層析等。高效液相色譜法(HPLC)常用于混合物中復(fù)雜組分的分離以及與其他技術(shù)聯(lián)用進(jìn)而對分離的物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。多肽主要是根據(jù)極性(疏水性)的差異而進(jìn)行分離,根據(jù)流動相和固定性的極性不同分為正相色譜和反相色譜,在多肽的分離純化中應(yīng)用最多的是反相色譜(RP-HPLC),約95%使用C18反向硅膠層析介質(zhì)。徐坤[24]基于高效液相色譜的分離性能和多級質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)鑒定能力,建立了多肽的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS)分析法。在工業(yè)規(guī)模上,與提純生物活性肽相關(guān)的加工成本必須根據(jù)提純或半提純產(chǎn)品的價值進(jìn)行評估。當(dāng)活性肽的高純度對于商業(yè)化至關(guān)重要時,也可以使用半制備型色譜。

該法具有分離能力強(qiáng)、柱效高、操作簡單、分辨率和靈敏度高和良好的可重復(fù)性等優(yōu)點。

3 生物活性肽定性定量鑒定技術(shù)

多肽的定性檢測技術(shù)主要包括多肽的結(jié)構(gòu)測定和序列測定；多肽的定量檢測技術(shù)包括多肽含量檢測、分子量大小及分布檢測和純度鑒定等。檢測方法最早是N末端序列測定法、核磁共振技術(shù),后來質(zhì)譜技術(shù)被廣泛應(yīng)用于多肽的分析鑒定。

3.1 末端序列測定法

最早的蛋白質(zhì)多肽測序方法主要是末端序列測定法,分為C端測序和N端測序,經(jīng)典方法是Edman化學(xué)降解法[25]。該法在降解多肽過程中操作簡單,效率很高,但是不適于N-端封閉的環(huán)形多肽,常與其他方法聯(lián)用,這種傳統(tǒng)的多肽測定方法已經(jīng)被慢慢取代。孫敬敬等[26]先采用多次反相高效液相色譜分離出具有抗菌活性的多肽,然后經(jīng)多肽N端測序,分析出該抗菌肽由55個氨基酸殘基構(gòu)成,含6個半胱氨酸并形成三對二硫鍵。

3.2 核磁共振技術(shù)

二維三維以及四維核磁共振(NMR)結(jié)合計算機(jī)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于多肽的定性定量研究。NMR多適用于小于30個氨基酸殘基的小分子多肽的分析。Xie[27]采用2D NMR光譜檢測出由16～21種氨基酸組成的套索肽的序列結(jié)構(gòu),由此把NMR作為套索肽結(jié)構(gòu)測定的主要工具。但是用此法分析多肽的研究較少。

3.3 質(zhì)譜法(MS)

質(zhì)譜法主要通過對多肽離子質(zhì)荷比的分析,測定其分子量、分子結(jié)構(gòu)來對多肽進(jìn)行定性分析的一種方法。質(zhì)譜分析具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度等優(yōu)點,為多肽的結(jié)構(gòu)測定提供了新途徑。

鑒定時經(jīng)常將各種分離型儀器與質(zhì)譜結(jié)合應(yīng)用,將具有高效、快速分離的液相色譜或毛細(xì)管的高分離能力與靈敏準(zhǔn)確的質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)鑒定功能相結(jié)合[28],并研發(fā)出一系列聯(lián)用設(shè)備。如毛細(xì)管電泳-電噴霧電離質(zhì)譜(CE-ESI-MS),到目前為止,在單次CE分析(單次激發(fā)分析)中鑒定的最大數(shù)量大約是50個肽。Fernando等[29]采用CE-MS分離鑒定從牛奶蛋白水解物中提取的營養(yǎng)品中的降壓肽,采用具有C18吸附劑的固相萃取(SPE)進(jìn)行樣品處理,最后分離鑒定了17種降血壓肽。Sergio等[30]使用CE-TOP-MS分離鑒定三種低過敏性嬰兒配方奶粉中的生物活性肽,最后鑒定了92種生物活性肽,其中還有一些是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制劑。Anisa Elham等[31]將N-甲基聚乙烯醇吡啶聚合物與ESI-MS(CE-ESI-MS)聯(lián)用作為CE的二氧化硅表面改性劑,通過對多肽和蛋白質(zhì)消化液的分析,證明了其與ESI-MS的相容性。表面涂層與ESI高度相容,有利于復(fù)雜肽混合物的分離和分析。

1988年出現(xiàn)電噴霧技術(shù)(ESI-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸技術(shù)(MALDI-TOF-MS),軟離子技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用使多肽的分析鑒定獲得了迅速的發(fā)展,分子量分析范圍達(dá)到幾千。Guijie Zhu[32]優(yōu)化了毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS),采用電動泵浦的納米噴霧界面,涂層毛細(xì)管和用于樣品進(jìn)樣的堆疊條件,通過優(yōu)化的單次CZE-ESI-MS/MS鑒定出了1 250種肽。優(yōu)化后的CZE-ESI-MS/MS可用于大規(guī)模、全面和可靠的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

近幾年電噴霧技術(shù)(ESI-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸技術(shù)(MALDI-TOF-MS)應(yīng)用較多。MALDI-TOF-MS是目前多肽分析鑒定的必備工具,具有操作簡單、快速、譜圖直觀、高靈敏度高高分辨率高采集速度所需樣品量非常少等特點,特別適合于多肽、大分子蛋白等序列結(jié)構(gòu)測定。ESI-MS不但具有普遍的適用性,同時還具有測量速度快、適合大批量樣品分析等諸多特點并且具有靈敏度和高效等優(yōu)勢。現(xiàn)在多把液相和質(zhì)譜技術(shù)串聯(lián),MALDI、ESI和TOF飛行時間聯(lián)用,適合于具有高相對分子質(zhì)量的化合物及混合物分析。

4 結(jié) 語

生物活性肽可用于食品、醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域,具有極大的開發(fā)潛力,然而因其制備的產(chǎn)物成分復(fù)雜且含量較低,制約了其開發(fā)利用。當(dāng)前的生物活性肽的制備分離技術(shù)還存在不足之處,雖然現(xiàn)在研究者們多使用多種方法聯(lián)合制備實現(xiàn)方法互補(bǔ),多級分離,獲得高純度的目的肽,但是還存在成本高、操作繁瑣、回收率底等問題,不適合工廠規(guī)?；a(chǎn)。

生物活性肽的鑒定,隨著蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展、質(zhì)譜和軟離子技術(shù)結(jié)合,基于質(zhì)譜定性定量分析成為多肽鑒定的主要方向,質(zhì)譜圖的精準(zhǔn)度是多肽分析的關(guān)鍵,ESI-MS高電荷離子實現(xiàn)分子量的精確定量,精確分子結(jié)構(gòu)信息,因此,ESI-MS與其他技術(shù)串聯(lián)分析具有特定功能的生物活性肽,具有良好的發(fā)展前景?，F(xiàn)在我國生物活性肽的研究發(fā)展迅速,開發(fā)出高效精準(zhǔn)肽分離鑒定技術(shù),為多肽類食品的研發(fā)和質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐,推動生物活性肽的健康規(guī)范發(fā)展。