王春雨，李彥生，劉長鍇，張秋英，3，金 劍，劉居?xùn)|，劉曉冰

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室，哈爾濱 150081；3.中國科學(xué)院種子設(shè)計創(chuàng)新研究院，北京 100101)

0 引 言

【研究意義】大豆是起源于中國的作物之一，籽粒蛋白質(zhì)含量達40%左右，可以加工成食品和飼料，成為人類和動物的重要蛋白質(zhì)來源[1]。同時，大豆籽粒中含有20%左右的脂肪，是重要的油料作物。統(tǒng)計表明，95%的大豆油作為食用，其余5%作為工業(yè)用途[2]。不同品種大豆籽粒大小差異顯著，按照目前國家標準，百粒重5.0～9.9 g為小粒大豆，10.0～14.9 g為中小粒大豆，15.0～19.9 g為中粒大豆，20.0～24.9 g為中大粒大豆，大于25.0 g為大粒大豆[3]。而大豆在加工過程中往往只被劃分為小粒大豆、中粒大豆和大粒大豆3種。一般而言，小粒大豆用作芽用，中粒大豆用作飼料和油品的加工，而大粒大豆被用來與米飯一起蒸煮、菜用、做豆腐、豆奶和醬油等[4]。肖伶俐等[5]通過對不同大豆品種芽用特性比較發(fā)現(xiàn)，百粒重在7 g左右的小粒大豆品種適合芽用，百粒重在10～20 g的大豆品種比較適用于食用油的提取以及豆制品加工，百粒重大于30 g被亞洲蔬菜研究中心確定為鮮食菜用大豆品種的選擇標準[6-7]。研究粒重不同的大豆蛋白質(zhì)和脂肪等積累差異以及相關(guān)機制，對于不同用途大豆的品種選育和合理栽培具有重要科學(xué)意義?！厩叭搜芯窟M展】通過籽粒大小來劃分大豆的用途，是因為大豆籽粒的大小與不同營養(yǎng)成分含量密切相關(guān)[8]。例如，宋江峰等[9]發(fā)現(xiàn)大豆籽粒大小與脂肪含量之間呈較強的負相關(guān)關(guān)系(r= -0.399)，與蛋白質(zhì)的負相關(guān)關(guān)系則較弱(r= -0.015)。美國西部大豆種植區(qū)域百粒重9.2 g的小粒大豆蛋白質(zhì)含量比百粒重18.6 g的中粒大豆低1%左右，但脂肪含量基本相同[10]。雖然以上研究結(jié)果基本證實大豆籽粒大小與蛋白質(zhì)和脂肪含量存在密切關(guān)系。但是在同一生態(tài)條件下研究不同籽粒大小大豆籽粒灌漿期蛋白質(zhì)和脂肪積累規(guī)律及差異的研究較少。有研究表明，籽粒灌漿過程中，籽粒蛋白質(zhì)和脂肪的絕對含量與籽粒干物質(zhì)重變化趨勢基本一致，總體上表現(xiàn)為不斷上升的趨勢[11]。蛋白質(zhì)和脂肪的相對含量在大豆籽粒灌漿過程中存在差異。于鳳瑤等[12]指出，大豆籽粒中脂肪相對含量的變化呈先快后慢、最后趨于緩慢的S型曲線；蛋白質(zhì)的相對含量則大致呈W型曲線變化，二者積累關(guān)鍵期在生殖后期?！颈狙芯壳腥朦c】大豆籽粒灌漿過程中蛋白質(zhì)和脂肪的積累很可能取決于大豆對光合產(chǎn)物的同化能力，例如光合產(chǎn)物獲得能力較強的高節(jié)位籽粒中蛋白質(zhì)和脂肪的相對含量更高[13]。鄒琦等[14]發(fā)現(xiàn)在相同栽培條件下，小粒大豆的單株光補償點和光飽和點都比普通大豆低，這很可能是導(dǎo)致籽粒大小不同大豆蛋白質(zhì)和脂肪積累差異的原因。籽重不同的大豆籽粒干物質(zhì)、蛋白質(zhì)和脂肪積累規(guī)律差異的研究還鮮有報道，三者之間的關(guān)系尚不清楚。研究粒重不同的大豆籽粒蛋白質(zhì)、脂肪及可溶性糖積累動態(tài)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究選取籽粒大小差異明顯，但生育期基本一致的3個大豆品種作為材料，分析籽粒干物質(zhì)、蛋白質(zhì)和脂肪積累規(guī)律，闡明三者之間的相互關(guān)系，為大豆生物學(xué)規(guī)律和不同用途大豆的栽培和選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗在中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所哈爾濱試驗場進行(45o73`N，126o61`E)。供試土壤為典型黑土，土壤總N為2.3 g/kg，速效N為148 mg/kg，速效P為48 mg/kg，速效K為75 mg/kg，有機質(zhì)含量31 g/kg。

供試品種材料分別為小粒大豆：品系y53，百粒重為7.13 g左右，紫花，亞有限結(jié)莢習性，生育期為118 d左右；普通大豆：品系p13，百粒重為20.21 g左右，紫花，亞有限結(jié)莢習性，生育期為120 d左右；大粒大豆：品系025，百粒重約為30.54 g左右，白花，亞有限結(jié)莢習性，生育期為121 d左右。

1.2 方 法

試驗采取小區(qū)隨機區(qū)組方式，12行區(qū)，0.67 m壟距，5 m行長，3次重復(fù)。采取人工點播的播種方式，播種密度為33×104株/hm2，保苗27×104株/hm2。播種前施用化肥磷酸氫二銨150 kg/hm2，尿素50 kg/hm2和硫酸鉀50 kg/hm2。生育期內(nèi)人工除草，定期噴施殺蟲劑控制蟲害。

從始花期(R1)開始到葉片完全老化，每隔10 d采用手持便攜式光合儀CI-301(CID公司，美國)測定大豆葉片光合速率。從鼓粒始期(R5)后第10 d(大約是開花后30 d)到籽粒完全成熟，每隔10 d對大豆籽粒進行取樣。每次取樣連續(xù)拔取大豆植株10株，摘取大豆中上部節(jié)位豆莢，去莢皮后籽粒放入烘箱中105℃殺青，30 min后于80℃烘至恒重，干樣稱重后置于干燥器中編號保存并用于不同指標的測定。

蛋白質(zhì)含量的測定采取杜馬斯燃燒定氮法[15]，總氮含量乘以換算系數(shù)6.25即得蛋白質(zhì)含量，儀器為元素分析儀(Elementar GmbHE-Ⅲ，德國)。脂肪測定使用索氏提取法，精確稱取粉碎后干樣2.000 g左右放入濾紙斗中密封后稱重，然后，放入裝有乙醚的索氏提取器中提取12 h，借蒸發(fā)除去溶劑后稱量濾紙包重量，通過差重得出樣品中脂肪的含量。籽粒中可溶性糖用80%乙醇進行提取，采用經(jīng)典蒽酮比色法進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用統(tǒng)計分析軟件SPSS 16.0，利用單因素方差分析方法(one way ANOVA)對相同時期不同籽粒大小大豆樣本數(shù)據(jù)差異進行統(tǒng)計分析；不同指標之間的相互關(guān)系通過Pearson相關(guān)系數(shù)顯著性確定；對比不同方程的R2和顯著性(Curve estimation)確定籽粒蛋白質(zhì)、脂肪和可溶性糖與籽粒大小之間的回歸關(guān)系。用專業(yè)畫圖軟件SigmaPlot12.5畫圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 粒重不同大豆籽粒干物質(zhì)積累動態(tài)

研究表明，鼓粒前期(0～20 d)小粒大豆、普通大豆和大粒大豆籽粒干物質(zhì)積累強度顯著不同，所積累干物質(zhì)分別達到最終干物質(zhì)重的82%、49%和66%；在鼓粒后的20～30 d、30～40 d和40～50 d，小粒大豆籽粒干物質(zhì)重比上一時期分別增加12%、3.8%和4.1%；普通大豆分別增加30%、26%和25%；大粒大豆則分別增加16%、17%和11%，即鼓粒前期是小粒大豆籽粒干物質(zhì)積累的快速期和關(guān)鍵期，對籽粒的物質(zhì)積累至關(guān)重要，而鼓粒后期對普通大豆和大粒大豆的物質(zhì)積累同樣重要。圖1

3種大豆單株籽粒產(chǎn)量差異顯著，其中普通大豆單株產(chǎn)量最高為36.2 g/株，比大粒大豆和小粒大豆分別高出38%和53%。圖2

2.2 粒重不同大豆葉片生殖生長期光合速率

研究表明，生殖生長期3種大豆葉片凈光合速率變化趨勢相近，都呈單峰曲線變化。普通大豆和大粒大豆葉片光合速率在開花后0～30 d(始花期-鼓粒后10 d)保持較高水平，凈光合速率峰值出現(xiàn)開花后30 d，之后逐漸降低。小粒大豆葉片凈光合速率峰值則出現(xiàn)開花后20 d(鼓粒始期)，隨后進入下降期。開花后30 d，大粒大豆葉片凈光合速率比普通大豆和小粒大豆分別顯著(P< 0.05)高出13%和22%。小粒豆與普通大豆和大粒大豆葉片凈光合速率差異主要出現(xiàn)在開花后30～40 d，其他時期無顯著差異(P> 0.05)。大粒大豆與普通大豆葉片凈光合速率在其他時期并無顯著(P> 0.05)差異。圖3

2.3 粒重不同大豆籽?？扇苄蕴欠e累動態(tài)

研究表明，3種大豆籽粒中可溶性糖積累趨勢基本一致，在大豆鼓粒過程中籽粒可溶性糖含量呈先增加后下降的單峰曲線變化，峰值出現(xiàn)在鼓粒后20 d。高峰期大粒大豆籽粒中可溶性糖含量最高，比普通大豆和小粒大豆分別顯著(P< 0.05)高出16%和50%。在鼓粒后20～50 d，3種大豆籽粒中可溶性糖含量均不斷下降，但普通大豆和小粒大豆兩者之間無顯著差異(P> 0.05)；而鼓粒后40～50 d，大粒大豆籽粒中可溶性糖含量顯著高于普通大豆和小粒大豆(P< 0.05)。圖4

2.4 粒重不同大豆籽粒蛋白質(zhì)積累動態(tài)

研究表明，3種大豆籽粒中蛋白質(zhì)積累整體表現(xiàn)出鼓粒前期較低，籽粒成熟后達到最高值。普通大豆籽粒中蛋白質(zhì)濃度在整個鼓粒期都顯著(P< 0.05)低于小粒大豆和大粒大豆。小粒大豆和大粒大豆在鼓粒后20～50 d期間籽粒中蛋白質(zhì)濃度無明顯差異。小粒大豆籽粒中蛋白質(zhì)濃度在40%～43%，普通大豆籽粒中蛋白質(zhì)濃度在37%～39%，而大粒大豆籽粒中蛋白質(zhì)濃度40%～43%。圖5

2.5 粒重不同大豆籽粒脂肪積累動態(tài)

研究表明，3種大豆籽粒中脂肪積累規(guī)律基本相似，其濃度從鼓粒后10 d開始逐漸上升，并于鼓粒后40 d達到頂峰，完全成熟后則略有下降。3種大豆籽粒中脂肪含量在鼓粒前期差異不大，但后期差異明顯。鼓粒后40 d，普通大豆籽粒脂肪濃度顯著高于大粒大豆和小粒大豆，分別高出10%和20%，鼓粒后50 d，則顯著高出8.8%和23%(P< 0.05)。但鼓粒后10 d，小粒大豆、普通大豆和大粒大豆籽粒中脂肪濃度，相當于完全成熟后籽粒中脂肪濃度的91%、76%和87%，即籽粒發(fā)育前期小粒大豆和大粒大豆的脂肪積累速率明顯高于普通大豆。圖6

2.6 籽粒大小與大豆籽粒蛋白質(zhì)、脂肪和可溶性糖積累的關(guān)系

研究表明，大豆籽粒蛋白質(zhì)(Yp)、脂肪(Yo)和可溶性糖濃度(Yf)與籽粒大小的關(guān)系可以分別用以下一元二次回歸函數(shù)估計。表1

Yp=11.485+1.017X-0.024X2(R2=0.946，P< 0.001).

Yo=51.603-1.392X+0.038X2(R2=0.913，P< 0.001).

Yf=39.992-2.255X+0.073X2(R2=0.908，P< 0.001).

式中，X代表大豆籽粒百粒重。

在籽粒干物質(zhì)快速積累期(0～20 d)，3種大豆籽粒干物質(zhì)重與籽粒中可溶性糖和蛋白質(zhì)濃度呈顯著(P< 0.05)正相關(guān)關(guān)系，可溶性糖濃度與蛋白質(zhì)濃度也表現(xiàn)出顯著(P< 0.05)正相關(guān)關(guān)系。

在鼓粒中后期(30～50 d)，3種大豆籽粒內(nèi)可溶性糖濃度與籽粒干物質(zhì)重均呈顯著(P< 0.05)負相關(guān)關(guān)系。普通大豆和大粒大豆籽粒中脂肪濃度與干物質(zhì)重呈顯著(P< 0.05)正相關(guān)關(guān)系。大粒大豆籽粒中脂肪濃度與可溶性糖和蛋白質(zhì)濃度均呈顯著(P< 0.05)負相關(guān)關(guān)系，蛋白質(zhì)與可溶性糖濃度則呈顯著(P< 0.05)正相關(guān)關(guān)系。小粒大豆的蛋白質(zhì)、脂肪和可溶性糖濃度相關(guān)關(guān)系未達到顯著差異水平。表2

表1 大豆籽粒大小與籽粒蛋白質(zhì)、脂肪和可溶性糖濃度回歸分析Table 1 Regression of seed protein, oi and soluble sugar concentration with seed size

表2 鼓粒不同時期籽粒干物質(zhì)重、蛋白質(zhì)、脂肪和可溶性糖濃度相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation analysis in soybean chemicals in different seed filling stage

3 討 論

大豆籽粒灌漿前期是產(chǎn)量形成的關(guān)鍵時期[16]，研究表明，3種大豆在鼓粒0～20 d期間籽粒干物質(zhì)重均快速增加，但增長速率明顯不同。此時期小粒大豆籽粒所積累干物質(zhì)達到最終干物質(zhì)重的82%，而普通大豆和大粒大豆分別只有49%和66%，即鼓粒0～20 d是小粒大豆籽粒灌漿的“線性增長期”。協(xié)調(diào)好此時期大豆光合產(chǎn)物生產(chǎn)和運輸是確保小粒大豆籽粒干物質(zhì)積累及其最終粒重的關(guān)鍵。由于鼓粒0～20 d期間，豆莢類型和數(shù)量已經(jīng)確定，而且3種大豆的葉片光合速率無明顯差異，表明“庫強”的大小成為光合產(chǎn)物積累速率的主要限制因素[17]。研究中3種大豆“庫強”大小表現(xiàn)為小粒大豆<大粒大豆<普通大豆，而此時期籽粒中光合產(chǎn)物積累速度則表現(xiàn)為小粒大豆>大粒大豆>普通大豆。籽粒大小不同大豆籽粒灌漿策略有所不同，小粒大豆前期光合產(chǎn)物積累速率快，伴隨著較高的可溶性糖含量，而且葉片光合速率峰值早，后期葉片光合速率顯著低于普通大豆和大粒大豆，籽粒干物質(zhì)增加緩慢，小粒大豆的“庫強”反饋調(diào)節(jié)“源端”的光合產(chǎn)物輸出能力，提高該段時期大豆光合產(chǎn)物供應(yīng)能力有利于該類型大豆產(chǎn)量的提高[18-19]。而普通大豆和大粒大豆類型葉片光合速率峰值出現(xiàn)的較晚，前期和后期光合產(chǎn)物積累均衡，普通大豆和大粒大豆“庫強”對“源端”的負反饋相對較低[20]。這種現(xiàn)象也體現(xiàn)在灌漿過程中籽?？扇苄蕴菨舛鹊钠贩N間差異，表明在籽粒灌漿過程中“源”和“庫”的調(diào)節(jié)地位不同，鼓粒后期“庫強”對普通大豆和大粒大豆的調(diào)控地位更加突出[21]。

大豆籽粒中蛋白質(zhì)和脂肪含量是衡量大豆籽粒品質(zhì)的重要指標之一。研究發(fā)現(xiàn)，3種大豆籽粒中蛋白質(zhì)積累整體上均表現(xiàn)出鼓粒前期較低，籽粒成熟后達到最高值的趨勢，該結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。例如Kim等[22]發(fā)現(xiàn)，百粒重為11和22 g的2個大豆品種籽粒中蛋白質(zhì)濃度隨著籽粒的成熟而不斷增加。但研究發(fā)現(xiàn)，普通大豆籽粒中蛋白質(zhì)濃度在整個鼓粒期都顯著低于小粒大豆和大粒大豆，這或許與不同品種對營養(yǎng)器官的氮元素再利用能力的差異有關(guān)[23-24]。Chung等[24]認為蛋白質(zhì)濃度高的大豆品種在籽粒灌漿后期對營養(yǎng)器官的氮元素再利用能力更強，同時這種較高比例氮素再利用會降低光合產(chǎn)物持續(xù)供應(yīng)能力造成產(chǎn)量及與碳相關(guān)化合物含量的下降。Poeta等[25]指出，大豆鼓粒后期葉片面積較大且衰老迅速的品種雖然產(chǎn)量低但籽粒中蛋白質(zhì)含量較高。研究發(fā)現(xiàn)小粒大豆和大粒大豆的產(chǎn)量要低于普通大豆，而蛋白質(zhì)含量相對較高，進一步證實了這種觀點。鑒于大豆籽粒大小與蛋白質(zhì)濃度都屬于數(shù)量遺傳性狀，兩者之間的關(guān)系較為復(fù)雜[26-27]，在育種工作中培育出產(chǎn)量高同時籽粒蛋白質(zhì)濃度高的品種仍具挑戰(zhàn)性。

大豆籽粒脂肪濃度在籽粒鼓粒期的變化趨勢與蛋白質(zhì)類似，只是在籽粒成熟時略有下降，這與前人研究結(jié)果一致，如劉中奇等[28]通過對不同熟期的3個大豆品種脂肪積累規(guī)律的研究發(fā)現(xiàn)，各品種脂肪積累總體上是先穩(wěn)定上升，在接近成熟時略有下降，這是因為籽粒不斷增加的干物質(zhì)為兩者的合成提供了原料和能量[29]。

已有研究表明，大豆籽粒脂肪和蛋白質(zhì)濃度的變化與籽粒內(nèi)其他化學(xué)物質(zhì)，特別是光合產(chǎn)物的變化密切相關(guān)[30]；豆科作物鼓粒初期，氨基酸合成蛋白質(zhì)需要大量來自光合產(chǎn)物的C架[31]；提高鼓粒期大豆同化產(chǎn)物供應(yīng)能力有利于提高籽粒內(nèi)蛋白質(zhì)的積累[32-33]。研究發(fā)現(xiàn)，在鼓粒0～20 d期間，籽粒蛋白質(zhì)濃度與可溶性糖濃度和干物質(zhì)重呈顯著(P< 0.05)正相關(guān)關(guān)系，表明籽粒內(nèi)的可溶性糖是合成蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)。穩(wěn)定同位素14CO2標記技術(shù)示蹤光合C在籽粒內(nèi)的代謝證明，40%標記的C會經(jīng)過蘋果酸代謝途徑用來合成蛋白質(zhì)[34]。功能性蛋白質(zhì)的單拷貝基因表達量往往與籽粒中其他物質(zhì)含量密切相關(guān)[29]。普通大豆成熟籽粒中的蛋白質(zhì)含量顯著低于小粒大豆和大粒大豆，同時脂肪含量高。這種結(jié)果可能與籽粒形成后期普通大豆營養(yǎng)器官氮素轉(zhuǎn)移量相對較低，但光合產(chǎn)物供應(yīng)和運輸能力強有關(guān)，相關(guān)機制有待于深入探討。

4 結(jié) 論

粒重不同大豆籽粒蛋白質(zhì)、脂肪和可溶性糖含量差異明顯，大粒大豆籽粒中可溶性糖含量最高；小粒大豆和大粒大豆籽粒蛋白質(zhì)含量顯著高于普通大豆；而普通大豆籽粒中脂肪含量顯著高于小粒大豆和大粒大豆。粒重不同大豆籽粒干物質(zhì)積累規(guī)律具有明顯差異，鼓粒前期是小粒大豆籽粒干物質(zhì)積累的快速期和關(guān)鍵期，對籽粒的物質(zhì)積累至關(guān)重要。鼓粒后期對普通大豆和大粒大豆的物質(zhì)積累同樣重要，特別是對普通大豆籽粒中蛋白質(zhì)和脂肪的積累。