李建平，足木熱木·吐爾遜，常曉春，郝曉燕，陳 果，高升旗，孫良斌，黃全生

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所/新疆農(nóng)作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】玉米等高等植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成一系列生理或發(fā)育機(jī)制來響應(yīng)環(huán)境中的各種脅迫[1]。這些生理或發(fā)育機(jī)制在生化水平上涉及許多重要的生化代謝途徑的調(diào)節(jié)；在分子水平上涉及包括逆境脅迫信號(hào)的傳遞與基因轉(zhuǎn)錄控制等一系列過程[2]。但是，植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫的調(diào)控機(jī)制是異常復(fù)雜的[3]。利用分子生物學(xué)方法和手段探索作物的耐旱機(jī)制，改善作物本身的抗旱能力，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)新的遺傳資源成為培育耐旱新品種的重要環(huán)節(jié)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1982年Hetherington等首次在豌豆(Pisumsativum)中發(fā)現(xiàn)1個(gè)CDPKs[4]。隨后在植物、原生動(dòng)物中相繼發(fā)現(xiàn)了CDPKs的存在[5]。在擬南芥(Arabidopisthaliana)中目前已發(fā)現(xiàn)34個(gè)CDPKs[6]，水稻中有31個(gè)成員[7]，玉米(Zeamays)中有40個(gè)CDPKs[8]。除此之外，在其它植物中，例如：馬鈴薯[9](Solanum)、番茄[10](Lycopersiconesculuentum)、小麥[11](Triticumaestivum)和棉花[12](Gossypiumraimondii)中也相繼發(fā)現(xiàn)了CDPKs家族。在玉米中，目前已發(fā)現(xiàn)40個(gè)玉米鈣依賴蛋白激酶(ZmCDPK)，其中ZmCDPK1、ZmCDPK7、ZmCDPK9、ZmCDPK10、ZmCDPK11、ZmCDPK22、ZmCDPK28和ZmCDPK34等基因相繼被克隆，并且研究發(fā)現(xiàn)這些CDPKs基因在接收鹽、ABA和H2O2等脅迫信號(hào)后轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[13]。玉米CDPK基因可能參與玉米生物非生物脅迫信號(hào)途徑，但是其功能及信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制目前尚不清晰，還有待深入研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】部分ZmCDPK基因成員如ZmCDPK38目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道，是否響應(yīng)非生物脅迫及其在非生物脅迫中發(fā)揮什么樣的功能有待發(fā)掘和研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究以ZmCDPK38作為研究對(duì)象，從生物信息學(xué)角度和基因表達(dá)特性2個(gè)方面對(duì)該基因的功能進(jìn)行判斷，為研究該基因的功能提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

玉米自交系B73種子由中國(guó)農(nóng)科院作物科學(xué)研究所王國(guó)英課題組提供。

Trizol總RNA提取試劑購(gòu)自Invitrogene公司；第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自全式金生物科技有限公司。Real-time PCR試劑盒購(gòu)置ABI公司，其它普通化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)。

1.2 方 法

1.2.1 ZmCDPK38的序列比對(duì)及聚類遺傳分析

ZmCDPK38的氨基酸序列多重比對(duì)分析通過在線軟件Multalin(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)進(jìn)行。系統(tǒng)進(jìn)化分析基于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)與MEGAX軟件的ClustalW功能，采用NJ算法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，Boot Strap參數(shù)設(shè)為500，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。

1.2.2 ZmCDPK38氨基酸結(jié)構(gòu)域及Motif保守序列

ZmCDPK38氨基酸結(jié)構(gòu)域分析基于NCBI蛋白結(jié)構(gòu)CCD在線工具進(jìn)行。利用MEME(http://meme-suite.org/)在線軟件分析玉米CDPK家族結(jié)構(gòu)域保守序列。

1.2.3 基因表達(dá)

1.2.3.1ZmCDPK38基因在玉米不同組織中的表達(dá)分析：分別提取玉米的根、莖、葉、雄穗和雌穗的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.3.2ZmCDPK38基因在不同非生物脅迫條件下的表達(dá)分析：花盆中16 h光照/8 h黑暗下生長(zhǎng)的玉米幼苗待長(zhǎng)至三葉期時(shí)進(jìn)行脅迫處理：(1)溫度脅迫：幼苗分別移至4和42℃處理，正常條件下生長(zhǎng)的幼苗作為對(duì)照，在不同處理時(shí)間段整株采樣，每次取樣5株，生物學(xué)重復(fù)3次；(2)鹽脅迫：三葉期幼苗從花盆中取出，洗去根部殘留培養(yǎng)基質(zhì)并盡量避免傷根，將幼苗于Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中水培3 d后移至含250 mM NaCl的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)，于不同時(shí)間段取樣，每次取樣5株，生物學(xué)重復(fù)3次；(3)干旱處理：三葉期幼苗從花盆中取出，洗去根部殘留培養(yǎng)基質(zhì)并盡量避免傷根，將幼苗于Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中水培3 d后移至含10%PEG6000的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)，于不同時(shí)間段取樣，每次取樣5株，生物學(xué)重復(fù)3次。所有樣品經(jīng)提取總RNA及反轉(zhuǎn)錄后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析在不同非生物脅迫條件下ZmCDPK38基因的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmCDPK38的蛋白序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化

研究表明，玉米ZmCDPK38基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為1 719 bp，編碼512個(gè)氨基酸。該氨基酸序列在NCBI進(jìn)行blast后發(fā)現(xiàn)擬南芥CDPK28(AtCDPK28)、擬南芥CDPK18(AtCDPK18)、大豆CDPK28(GmCDPK28)、玉米CDPK28(ZmCDPK28)、高粱CDPK18(SbCDPK18)、辣椒CDPK16(CbCDPK16)及煙草CDPK28 (NtCDPK28)與其序列同源性較高，ZmCDPK38與其它7個(gè)CDPK的序列相對(duì)較為保守，均具有典型的蛋白激酶區(qū)域。蛋白激酶活性調(diào)控區(qū)域由20～30個(gè)氨基酸殘基組成，富含堿性氨基酸。遺傳進(jìn)化及序列一致性分析結(jié)果顯示，ZmCDPK38除了與ZmCDPK28親緣關(guān)系較近，序列一致性高達(dá)90.43%，與高粱SbCDPK18的親緣關(guān)系同樣較近，序列一致性為87.28%。與其它物種的CDPK氨基酸序列一致性依次為GmCDPK28(82.30%)、AtCDPK18(80.84%)、CbCDPK16(79.68%)、AtCDPK28(78.83%)及NtCDPK28(73.23%)。圖1，圖2

2.2 ZmCDPK38的蛋白結(jié)構(gòu)域

研究表明，ZmCDPK38包含CDPKs家族典型的4個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域即N-端可變域、蛋白激酶域、自抑制域和類鈣調(diào)素結(jié)合域。其中，在類鈣調(diào)素結(jié)合域中含有2個(gè)EF hands, 在蛋白激酶域包含Ser/Thr蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。圖3

研究表明，3個(gè)Motif氨基酸的保守序列分別為：Motif1(VDFEEFVAATLHVHQLVEHDTEKWKSLSQ)Motif2(VRQMLKVAAECHLHGLVHRDMKPENFLFK)Motif3(VKREVKILKALQGHENVVHFY NAFEDDNY)，在8個(gè)CDPK中具有高度保守性。圖4

2.3 ZmCDPK38在不同組織中的表達(dá)模式

研究表明，該基因在所有組織中均有表達(dá)，但轉(zhuǎn)錄水平存在顯著差異，其中該基因在葉片中的表達(dá)高于其它組織，其次是在莖部；在根、雌穗和雄穗的表達(dá)水平顯著低于其它組織，根中的轉(zhuǎn)錄水平略高于雌穗和雄穗。圖5

2.4 ZmCDPK38基因在不同非生物脅迫條件下的表達(dá)

研究表明，ZmCDPK38在高溫條件下的轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生較明顯的變化，在高溫處理24 h后表達(dá)水平下調(diào)明顯，故該基因并未受高溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。鹽脅迫條件下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，ZmCDPK38的轉(zhuǎn)錄受到誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，在處理3 h后達(dá)到峰值，轉(zhuǎn)錄水平是對(duì)照的3.2倍。盡管隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量有所下降，但是表達(dá)水平仍高于對(duì)照，因此，可以初步判斷該基因的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)。另外在干旱脅迫條件下，ZmCDPK38的轉(zhuǎn)錄水平隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)不斷上調(diào)，并且在脅迫6 h后表達(dá)量達(dá)對(duì)照的9.5倍，該基因的表達(dá)受到干旱脅迫的誘導(dǎo)。圖6

3 討 論

玉米等植物為適應(yīng)各種外界環(huán)境刺激形成了復(fù)雜的逆境脅迫信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，其中Ca2+被認(rèn)為作為植物特有的第二信使主要參與植物非生物脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)，Ca2+通過鈣結(jié)合蛋白介導(dǎo)將脅迫信號(hào)傳遞到調(diào)控通路的下游，鈣依賴蛋白激酶(CDPK)作為鈣結(jié)合蛋白之一在植物抵抗逆境脅迫的調(diào)控反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[14]。從玉米中分離得到了ZmCDPK38基因，利用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因分析后發(fā)現(xiàn)它與其它6個(gè)物種的CDPK家族成員在氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)上存在較大的相似性，具有CDPK家族典型的類鈣調(diào)素結(jié)合域，這也是CDPKs和其他類型蛋白激酶存在區(qū)別的區(qū)域[15]。ZmCDPK38基因的表達(dá)具有組織特異性，這一表達(dá)特性也存在與其它物種中的CDPKs，例如小麥TaCDPK13基因在葉、幼穗以及未成熟的種子中表達(dá)，而在根、莖中則未見表達(dá)[11]；擬南芥AtCPK17和AtCPK34基因主要在花粉管形成期表達(dá)，并參與調(diào)控花粉管的生長(zhǎng)[16]；水稻OsCDPK6基因在花粉管形成階段轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[17]。研究表明，當(dāng)植物受到生物脅迫或非生物脅迫時(shí)，CDPKs基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變，并且不同CDPK基因分別對(duì)不同脅迫產(chǎn)生應(yīng)答。例如擬南芥受鹽和干旱脅迫后，AtCDPK1和AtCDPK2基因表達(dá)上調(diào)，而在低溫脅迫下，其基因表達(dá)均沒有顯著變化；AtCDPK4 和AtCDPK11基因受ABA誘導(dǎo)表達(dá)，正向調(diào)節(jié)ABA介導(dǎo)的信號(hào)途徑，而AtCPK12基因在ABA信號(hào)途徑中則作為負(fù)向調(diào)控因子[18]。水稻OsCDPK7基因在冷、鹽、干旱脅迫條件下的表達(dá)發(fā)生改變，水稻耐低溫、鹽和干旱脅迫的程度與OsCDPK7基因的表達(dá)水平有密切關(guān)系[19]。ZmCDPK38同樣對(duì)不同的非生物脅迫產(chǎn)生一定的應(yīng)答反應(yīng)，在研究中，ZmCDPK38主要響應(yīng)干旱和鹽脅迫，但在高溫和低溫脅迫下表達(dá)沒有顯著變化，暗示該基因在玉米應(yīng)對(duì)干旱和高鹽脅迫的反應(yīng)中扮演一定的角色。但是，ZmCDPK38基因是否在玉米中發(fā)揮耐旱和耐鹽具備實(shí)際功能有待深入研究。

4 結(jié) 論

ZmCDPK38與ZmCDPK28及高粱等6個(gè)其它植物物種的CDPK的氨基酸序列具有較高的一致性，遺傳進(jìn)化關(guān)系上較近。氨基酸序列包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域，具有CDPKs家族氨基酸的典型特征，Ser/Thr蛋白激酶結(jié)構(gòu)域相對(duì)保守。ZmCDPK38基因雖然在玉米的不同組織均有表達(dá)，但是表達(dá)水平具有組織特異性，在葉片的表達(dá)水平高于根、莖、雄蕊和雌蕊。在不同非生物脅迫下，ZmCDPK38基因的表達(dá)差異顯著，其表達(dá)受干旱及鹽脅迫誘導(dǎo)，而不受低溫和高溫的誘導(dǎo)。