徐鑫，姜偉高，梁華兵，王曉婉，劉松青，王春臺(tái)

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院&武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&生物技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074)

由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是水稻最嚴(yán)重的病害之一[1].稻瘟病在水稻的整個(gè)生育期都可以發(fā)生，每年可造成10%～20%水稻減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)40%～50%，甚至顆粒無收[2].稻瘟病在全球各地稻區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重威脅著水稻的增產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)[3].長期的實(shí)踐證明，利用水稻自身對(duì)稻瘟病的宿主抗性，借助單個(gè)抗性基因或聚合多個(gè)抗性基因以提高水稻抗性，從而來培育抗稻瘟病水稻品種，被普遍認(rèn)為是當(dāng)前最為經(jīng)濟(jì)、有效且安全的措施[4].由于稻瘟病菌群體普遍存在高度變異性，培育的單一抗性基因抗稻瘟病水稻品種通常在種植幾年后會(huì)喪失對(duì)稻瘟病的抗性[5].目前解決該問題的主要辦法就是聚合多個(gè)抗性基因，從而使得水稻品種獲得具有持久性的稻瘟病廣譜抗性，因此在遺傳資源中挖掘新的稻瘟病抗性基因尤為重要.

通過圖位克隆、全基因組序列分析和轉(zhuǎn)錄組分析等方法，研究人員對(duì)稻瘟病抗性基因進(jìn)行廣泛研究，現(xiàn)已確定了大量的抗稻瘟病相關(guān)抗性基因[6].截至目前為止，研究人員已成功鑒定了100多個(gè)主要稻瘟病抗性基因，30個(gè)基因已經(jīng)完成分子克隆[7].稻瘟病抗性基因Pita2與Pita來源于同一抗性供體品種即菲律賓秈稻Tadukan[8]，兩個(gè)基因聚集并定位于水稻12號(hào)染色體的著絲粒區(qū)域.Pita很早就被克隆[9]，并在分子水平上研究了與相應(yīng)無毒基因AVR-Pita的相互作用[10]，在生產(chǎn)實(shí)踐上得到了廣泛應(yīng)用.Pita2對(duì)稻瘟病菌生理小種的抗譜比Pita更廣，擁有更大的應(yīng)用前景[11]，但由于染色體著絲粒區(qū)域存在高度重復(fù)序列和抑制重組的特性，Pita2的研究工作一直進(jìn)展很慢.

通常，在病原微生物侵染植物后，被侵染的植物體部位與病原體會(huì)相互作用產(chǎn)生信號(hào)，并將信號(hào)傳導(dǎo)到其他組織，進(jìn)而誘發(fā)植物體產(chǎn)生一系列防衛(wèi)防御反應(yīng).目前許多研究表明，水楊酸(Salicylic Acid,SA)和茉莉酸(Jasmonic Acid,JA)在植物體免疫應(yīng)答抗病信號(hào)途徑中具有重要的調(diào)控作用[12].一方面，在植物免疫應(yīng)答過程中，SA主要在系統(tǒng)獲得性抗性(Systemic Acquired Resistance,SAR)過程起到重要作用——即病原菌在成功侵染寄主植物后，寄主體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量SA，導(dǎo)致病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis Related Protein,PR)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物的抗病性[13].NH1和WRKY45是SA信號(hào)途徑的主要調(diào)控因子，過表達(dá)OsNH1或其同源基因后，成功激活SAR反應(yīng)后增加水稻的抗病性；若缺失OsNH1則SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不能被正常激活[14].此外，SA及其衍生物苯并噻二唑(BTH)可誘導(dǎo)OsWRKY45的表達(dá)，大量研究表明OsWRKY45的過表達(dá)可顯著增強(qiáng)水稻的抗病性，但該基因的沉默大大減弱了BTH誘導(dǎo)的稻瘟病抗性[15].另外一方面，水稻中JA可誘導(dǎo)OsPR1a,OsPR1b,OsPR2等PR基因的表達(dá)[16].OsAOS2是JA的合成相關(guān)基因，過表達(dá)該基因可以使PR基因表達(dá)上調(diào)，并且增強(qiáng)水稻抗病性.

在前期研究中，利用Co39 × Reiho(Pita2抗性親本的Co39近等基因系材料)的2031株F2群體，根據(jù)日本晴的參考序列，將Pita2定位于水稻12號(hào)染色體10.79～10.85 Mb靠近著絲粒的區(qū)域約75 kb范圍內(nèi).但由于目的區(qū)段與水稻日本晴及9311的基因組存在較大差異，無法通過常規(guī)的電子定位和長距離PCR等技術(shù)進(jìn)行分離和克隆[17].本研究擬通過構(gòu)建并篩選該基因供體品種的Fosmid文庫，構(gòu)建Pita2候選區(qū)域的物理圖譜并互補(bǔ)驗(yàn)證候選基因.進(jìn)一步從本實(shí)驗(yàn)室前期在武陵山區(qū)收集的稻瘟病菌生理小種庫中，篩選出基因型接近、對(duì)Pita2致病性完全相反的菌株組對(duì)水稻進(jìn)行離體接種，擬通過檢測(cè)接種稻瘟病菌前后相關(guān)防御基因的表達(dá)量變化，分析在抗病過程中Pita2基因與水稻抗病信號(hào)通路的關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 Fosmid文庫構(gòu)建

用CTAB法提取PiNo.4植株(Pita2抗性親本)的基因組DNA，經(jīng)酶切處理回收總長度25～50 kb的條帶.將回收的片段進(jìn)行末端平滑化和磷酸化處理，再連接到pCC1FOS(EPICENTRE)載體上.4 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后涂布平板.根據(jù)效價(jià)公式，titer(CFU/mL)=(克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)×103μL/mL)/所用稀釋未擴(kuò)增文庫的量(μL)，得出文庫的滴度為(2.7～4.3)×105CFU/mL.構(gòu)建的文庫預(yù)計(jì)總共獲得克隆為10萬多個(gè)，其平均插入片段為35 kb，按照大小約為430 Mb的日本晴水稻基因組，該文庫覆蓋基因組約為8.0～11.4倍.

1.2 真菌材料和疾病的評(píng)估

稻瘟病菌菌株來自本實(shí)驗(yàn)室在武陵山區(qū)收集的病菌生理小種庫.菌株在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后，滅菌的去離子水清洗，然后在藍(lán)光環(huán)境下培養(yǎng)7 d(25 ℃，高濕度).用分生孢子懸浮液[(2～3)×105分生孢子/mL]噴灑接種4～5葉期幼苗.接種后在濕度培養(yǎng)箱(25 ℃，100%相對(duì)濕度)中培養(yǎng)30 h，再將水稻幼苗移至溫室，當(dāng)其出現(xiàn)病斑10 d后對(duì)其進(jìn)行復(fù)查.在調(diào)查發(fā)病情況時(shí)，選擇病斑長度最長的植株.

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

處理后的日本晴水稻種子在N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基上28 ℃光照培養(yǎng)6 d之后，在水稻胚的一端長出淺黃色致密的愈傷組織；用含有候選基因的農(nóng)桿菌侵染生長狀態(tài)良好的愈傷組織，在28 ℃暗培養(yǎng)3 d后，置于篩選培養(yǎng)基上培育至長出新的愈傷組織；將新生長出的愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上，28 ℃光照培養(yǎng)，根據(jù)分化狀態(tài)再選擇性地進(jìn)行分化繼代工作.最后將分化出來的小苗移植到生根培養(yǎng)基上2周左右.

1.4 qPCR分析

用TRIzol法對(duì)接種前后水稻葉片提取RNA，在DNase處理后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成cDNA.用Actin引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條帶大小符合預(yù)期.以cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共36個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，制備1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物.內(nèi)參基因與目的基因同時(shí)擴(kuò)增，每個(gè)樣品3次技術(shù)重復(fù).qPCR在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，采用2-△△Ct算法分析計(jì)算結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 Pita2物理圖譜的構(gòu)建和候選基因的預(yù)測(cè)

通過對(duì)本課題組前期篩選出的分子標(biāo)記的進(jìn)一步驗(yàn)證，挑選出8對(duì)特異性分子標(biāo)記，進(jìn)行PiNo.4文庫的篩選，獲得覆蓋Pita2候選區(qū)域的3個(gè)Fosmid克隆，構(gòu)建了Pita2區(qū)域基于抗性親本PiNo.4的物理圖譜(圖1)，并對(duì)該區(qū)域的候選基因進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)(表1).

圖1 稻瘟病抗性基因Pita2的物理圖譜以及候選基因的分布Fig.1 The physical map of the rice blast resistance gene Pita2 with the candidate ORF

表1 Pita2候選基因功能預(yù)測(cè)Tab.1 The function prediction of the Pita2 candidate genes

2.2 Pita2候選基因的互補(bǔ)驗(yàn)證

通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增來分析Pita2候選基因表達(dá)情況，確認(rèn)有5個(gè)具有表達(dá)的基因(Pi-ta2-Seq4，Pi-ta2-Seq5，Pi-ta2-Seq6，Pi-ta2-Seq8和Pi-ta2-Seq9).選用這些基因進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,經(jīng)鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因植株培育至四葉期后，采摘?jiǎng)θ~，離體接種稻瘟病菌生理小種race007.觀察統(tǒng)計(jì)10 d后接種情況如圖2所示，與陰性對(duì)照Nip(“日本晴”品種，表現(xiàn)為稻瘟病感病表型)相比，含有候選基因Pi-ta2-Seq5、Pi-ta2-Seq6、Pi-ta2-Seq8和Pi-ta2-Seq9的植株表現(xiàn)出與Nip相近的病斑情況——表現(xiàn)出感病表型.而含有候選基因Pi-ta2-Seq4植株表現(xiàn)出與陽性對(duì)照PiNo.4一致的病斑情況——表現(xiàn)出對(duì)稻瘟病極強(qiáng)的抗病性，揭示了候選基因Pi-ta2-Seq4就是稻瘟病抗性基因Pita2.

圖2 轉(zhuǎn)基因T1陽性植株接種稻瘟病菌race007Fig.2 The symptom of the T1 progeny inoculated with M.oryzae race 007

2.3 Pita2介導(dǎo)的抗性反應(yīng)中相關(guān)防御基因表達(dá)量檢測(cè)

從前期在武陵山區(qū)收集的稻瘟病病菌生理小種庫中，篩選出了一組遺傳距離相近、對(duì)PiNo.4致病性差異較大的菌株13014和13015進(jìn)行離體接種.NIP(粳稻，水稻標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序品種)、LTH(麗江新團(tuán)黑谷，秈稻，稻瘟病易感品種)、Co39(粳稻，稻瘟病易感品種)、Pita2供體品種PiNo.4繁種移栽培育至4～5葉期后，采摘?jiǎng)θ~或下一葉，離體接種稻瘟病菌13014和13015.觀察統(tǒng)計(jì)接種10 d后情況如圖3所示，與感病植株Nip、LTH、Co39相比，PiNo.4對(duì)稻瘟病菌13014的侵染表現(xiàn)出感病情況，然而PiNo.4對(duì)稻瘟病13015的侵染則表現(xiàn)出抗病情況.這兩組菌表現(xiàn)的致病性結(jié)果與篩選菌株時(shí)所用的致病性分析結(jié)果完全吻合，可以作為研究防御基因變化接種使用的稻瘟病菌.

圖3 四種水稻植株接種不同稻瘟病菌的感病情況Fig.3 Four rice cultivars inoculated with different rice blast fungus

對(duì)接種稻瘟病菌株13014和13015前后水稻中稻瘟病相關(guān)的防御基因(WRKY45、PR1b、NPR1和AOS2)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示.PiNo.4植株中WRKY45基因本底表達(dá)水平比其他易感植株高，在接種稻瘟病菌13014和13015后，易感株WRKY45基因均無明顯變化；在PiNo.4植株中WRKY45基因呈顯著下調(diào)，說明該信號(hào)通路可能受到抑制.在SA信號(hào)通路中，WRKY45和OsNH1基因獨(dú)立表達(dá)，互不干涉[18].PiNo.4株中OsNH1基因在接種稻瘟病菌后呈顯著上調(diào)，表明PiNo.4植株通過基因OsNH1介導(dǎo)SA免疫信號(hào)通路.位于OsNH1下游的OsPR1b在接種稻瘟病菌13014后顯著下調(diào)，說明該基因的表達(dá)受到稻瘟病菌的抑制；在接種稻瘟病菌13015后上調(diào)，表明稻瘟病菌13015不足以抑制OsPR1b的表達(dá).在接種稻瘟病菌13014和13015后，PiNo.4植株中OsAOS2表達(dá)量均出現(xiàn)顯著上調(diào)的現(xiàn)象，表明稻瘟病菌的侵染成功激活了水稻中JA抗病信號(hào)通路.上述稻瘟病相關(guān)防御基因的表達(dá)量表明PiNo.4植株在稻瘟病菌侵染后均成功激活了SA和JA抗病信號(hào)通路，但在接種了稻瘟病菌13014的PiNo.4植株中，SA信號(hào)通路的OsPR1b受抑制，下游免疫信號(hào)途徑受抑制，表現(xiàn)出感病癥狀；而接種了稻瘟病菌13015的植株中，OsPR1b表達(dá)上調(diào)，能成功激活下游抗病基因，從而產(chǎn)生抗病反應(yīng)，與離體接種的實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全吻合.

圖4 接種前后與抗病防御相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.4 Expression level of defense-related genes before and after inoculation

3 結(jié)語

在前期研究中利用近等基因系群體，通過HEGES系統(tǒng)和SNPs測(cè)序?qū)CR標(biāo)記進(jìn)行研究，成功分離Pita和Pita2基因，對(duì)Pita2進(jìn)行了精細(xì)定位.鑒于該區(qū)段與日本晴序列差異很大，通過常規(guī)長片段PCR克隆的方法很難得到目的基因，本研究通過構(gòu)建基于抗性親本 PiNo.4的Fosmid 文庫，篩選了覆蓋目標(biāo)約75 kb區(qū)段的3個(gè)Fosmid克隆，構(gòu)建了基于抗性親本的物理圖譜.通過候選基因的互補(bǔ)驗(yàn)證，確定了候選基因Pita2-Seq4就是稻瘟病抗性基因Pita2.賈育林課題組在抗性親本Katy克隆了Ptr基因，發(fā)現(xiàn)其特異性地參與Pita/Pita2介導(dǎo)的抗稻瘟病過程，Ptr的突變消除了Pita2相關(guān)的AVR-Pita和Pita2特異性AVR基因的識(shí)別.同時(shí)Ptr與Pita2的抗譜也高度相似，推測(cè)其可能就是Pita2[19].Ptr與候選基因Pita2-Seq4的日本晴同源基因一致，因此本研究通過在Pita2標(biāo)準(zhǔn)抗性親本中的基因克隆及互補(bǔ)驗(yàn)證，確定Ptr和Pita2為同一基因.

一組稻瘟病菌基因型接近、對(duì)Pita2致病性相反的菌株對(duì)Pita2抗性水稻進(jìn)行離體接種，結(jié)果表明Pita2基因在稻瘟病菌侵染后均成功激活了SA和JA抗病信號(hào)通路，但主要是通過參與水稻SA信號(hào)通路，從而賦予水稻抗性.