邢福國，李 旭，張晨曦

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯運管控重點實驗室/農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

黃曲霉(Aspergillusflavus)是一種廣泛分布的腐生好氧真菌，屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)、曲霉屬(Aspergillus)，是僅次于煙曲霉(A.fumigatus)的曲霉病誘發(fā)菌[1]。黃曲霉可以寄生于花生、玉米、大米等主要糧食作物及堅果、香料、中藥材等經(jīng)濟作物。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計，黃曲霉是全球谷物最主要的污染真菌之一[2]。我國是黃曲霉污染的重災(zāi)區(qū)，抽樣調(diào)查顯示我國多個省份的儲藏玉米和花生中都檢出了黃曲霉菌[3]。更重要的是黃曲霉侵染過程產(chǎn)生多種有毒次生代謝產(chǎn)物，如黃曲霉毒素(aflatoxins，AFs)、環(huán)匹阿尼酸(cyclopiazonic acid)、黃曲霉震顫素(aflaterm)等，其中黃曲霉毒素是毒性最高、產(chǎn)量最大、污染范圍最廣泛的真菌毒素[4]。真菌毒素的發(fā)生嚴重損害作物品質(zhì)和經(jīng)濟價值，危及人畜健康和食品安全。

黃曲霉毒素是一類二氫呋喃香豆素衍生物，根據(jù)在紫外光照射下產(chǎn)生的熒光不同主要分為B族(藍色，AFB1和AFB2)和G族(綠色，AFG1和AFG2)[5]。黃曲霉毒素因為其高毒性和高致癌性而廣受關(guān)注，研究表明：長期暴露于黃曲霉毒素會導(dǎo)致人和牲畜的免疫抑制、營養(yǎng)代謝不良、不孕、先天畸形、內(nèi)分泌紊亂、以及嚴重的肝細胞癌變[6]。同時，黃曲霉毒素也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的理化性質(zhì)最穩(wěn)定的真菌毒素，一旦污染發(fā)生，很難通過物理或化學(xué)的手段去除，并會通過代謝和加工過程在食物或飼料中富集，嚴重威脅人畜健康[5-6]。

黃曲霉在農(nóng)作物生長、收獲、運輸、貯藏、加工等不同階段都可能侵染，而這些過程的不同光照、溫度、水活度、宿主等環(huán)境差異均會影響黃曲霉毒素產(chǎn)量。研究不同環(huán)境因素對黃曲霉毒素合成的影響對黃曲霉毒素污染防控具有重要意義。本文概述了光照、溫度、水活度、碳氮源、pH值、氧化脅迫對黃曲霉毒素合成的影響及調(diào)控途徑，并總結(jié)相應(yīng)的黃曲霉毒素污染防控措施，旨在為進一步解析黃曲霉毒素產(chǎn)生機制和更好的防控真菌毒素污染提供一定幫助。

1 黃曲霉毒素的生物合成

1.1 生物合成過程

黃曲霉毒素的生物合成過程非常復(fù)雜，但經(jīng)過眾多研究人員的長期研究，已基本解析清楚。黃曲霉毒素合成過程包括27個酶促反應(yīng)，以乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A為合成底物，在聚酮合酶AflC(polyketide synthase，PKS)的催化下形成聚酮骨架，再經(jīng)過多步的加氧、脫氫、甲基轉(zhuǎn)移等修飾過程，最終形成了高度氧化的黃曲霉毒素[7]。已知的黃曲霉的生物合成過程見圖1。

圖1 黃曲霉毒素的生物合成過程

最新的研究發(fā)現(xiàn)，從HOMST到最終的黃曲霉毒素B1之間還有兩個中間產(chǎn)物[8]。而根據(jù)基因簇功能推測，在VERA和DMST之間還有一個中間產(chǎn)物未被確認[7-8]。

1.2 合成基因簇

黃曲霉合成基因簇約80 kbp，位于3號染色體端粒上，為54號基因簇，包含30個基因，在黃曲霉和寄生曲霉中相對保守，同源性在90%～99%[7]。整個合成基因簇的絕大多數(shù)基因功能已基本解析清楚，hypC是最后被確認的基因簇結(jié)構(gòu)基因，位于aflC和aflD之間，負責(zé)催化NAA到NOR的酶促反應(yīng)[9]。

黃曲霉毒素合成結(jié)構(gòu)基因的最直接調(diào)控元件是簇內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子AflR和轉(zhuǎn)錄激活子AflS。AflR對黃曲霉毒素合成過程是必須的，AflR至少能夠與17個黃曲霉毒素基因簇結(jié)構(gòu)基因的啟動子區(qū)結(jié)合，回文序列5′-TCG(N5)CGA-3′是AflR最主要的識別序列，同時也能結(jié)合5′-TTAGGCCTAA-3′及5′-TCGCAGCCCGG-3′[10-11]。此外，AflR還能識別其自身啟動子的5′-TTAGGCCTAA-3′區(qū)域，說明AflR可能激活自身轉(zhuǎn)錄表達，而黃曲霉毒素的合成可能存在著自反饋調(diào)控機制[12]。aflS是毒素基因簇內(nèi)的轉(zhuǎn)錄激活子，aflS敲除突變體導(dǎo)致多個毒素合成基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，而過量表達aflS促進了毒素合成基因的表達及AFB1合成[13-14]。aflS的轉(zhuǎn)錄水平同樣被AflR調(diào)控。AflR和AflS以蛋白復(fù)合物發(fā)揮對合成基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，4分子AflS搭配1分子AflR。當(dāng)AflS表達量不足以形成復(fù)合物時，毒素合成基因簇結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄也會下調(diào)[13,15]。

此外，黃曲霉合成基因簇上還有兩個基因功能并不完全清楚，aflT編碼一個MFS家族真菌轉(zhuǎn)運蛋白，蛋白定位在黃曲霉毒素小體內(nèi)，因此推測AflT與毒素的外泌和運輸相關(guān)，但aflT突變體并不影響黃曲霉毒素產(chǎn)量[16]。hypD編碼一個膜結(jié)合蛋白，hypD敲除突變體的AFB1和孢子產(chǎn)量均顯著下降，表明HypD參與真菌發(fā)育和毒素合成過程[17]。黃曲霉毒素合成過程和合成基因簇的研究為后續(xù)的調(diào)控機制解析及毒素抑制和降解工作奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。

2 環(huán)境因素對產(chǎn)黃曲霉毒素的影響

2.1 光照的影響

光照是最重要的環(huán)境信號之一，不同的波長、強度、光照時間都顯著影響絲狀真菌的生長、發(fā)育及次級代謝產(chǎn)物合成過程。早期光照相關(guān)的研究主要集中于光照對于真菌產(chǎn)孢和形態(tài)發(fā)育的影響，特別是對真菌有性生殖和無性生殖的調(diào)節(jié)。近幾年，關(guān)于光照調(diào)控真菌次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究也越來越多[18]。紅光促進紅曲霉中多種次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，而藍光只能促進γ-米諾丁酸的產(chǎn)生[19]；UV-A能夠減少炭黑曲霉中赭曲霉毒素的產(chǎn)生，而625 nm紅光和740 nm遠紅光抑制韋氏曲霉中赭曲霉毒素合成[20-21]。最新研究表明：455 nm和470 nm的藍光能夠顯著抑制黃曲霉和寄生曲霉生長，并抑制黃曲霉毒素基因簇表達和黃曲霉毒素合成，而綠光、黃光和紅光對黃曲霉毒素合成過程沒有顯著影響[22]。

在黃曲霉上，真菌可以感知近紫外光、藍光、綠光、紅光和遠紅光。曲霉屬真菌中，已報道有11個光受體和多個信號級聯(lián)系統(tǒng)參與到光信號調(diào)控過程[18]。這些光信號調(diào)控系統(tǒng)中，Velvet復(fù)合體是最核心的調(diào)控元件。VeA-LaeA-VelB形成三聚體復(fù)合物，與不同光受體蛋白，如紅光受體FphA發(fā)生互作，感知不同光信號，進而進入核內(nèi)調(diào)控相關(guān)發(fā)育和次生代謝相關(guān)基因的表達[23-25]。復(fù)合體核心調(diào)控因子是全局性調(diào)控因子VeA，影響黃曲霉生長、發(fā)育、多個次生代謝過程。對于黃曲霉毒素生物合成過程，VeA是必須的，黃曲霉和寄生曲霉的veA敲除突變體不產(chǎn)毒素，幾乎完全抑制了aflR和aflS的表達，還影響了大多數(shù)的黃曲霉毒素合成基因簇基因表達[24-25]。除VeA之外，LaeA和VelB也正調(diào)控毒素合成和毒素基因簇轉(zhuǎn)錄[25]。這些研究均有力地證明了Velvet復(fù)合體是光信號調(diào)控黃曲霉毒素合成的關(guān)鍵。另外，紅光和藍光信號受體調(diào)控可能通過了HOG途徑(high osmolarity glycerol pathway)，多個MAPK激酶的表達受到不同光信號的影響，同時也表明了光信號和水活度、氧化應(yīng)激等不同環(huán)境因子之間也可能存在著交叉的影響和調(diào)控。

2.2 溫度的影響

溫度是調(diào)控真菌生長和次生代謝產(chǎn)物形成的重要因素之一，也是調(diào)控黃曲霉毒素形成的關(guān)鍵環(huán)境條件，直接影響黃曲霉毒素產(chǎn)量。對大多數(shù)絲狀真菌來說，最適的次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生溫度略低于其最適生長溫度[7,18]。黃曲霉和寄生曲霉在12～34 ℃產(chǎn)毒，而在36 ℃時基本停止產(chǎn)毒，最適產(chǎn)毒溫度為20～30 ℃[5,18]。最適產(chǎn)毒溫度也會根據(jù)水活度和培養(yǎng)基質(zhì)等其他因素的差異而發(fā)生改變，Arrus等[26]以巴西堅果為培養(yǎng)基，水活度為0.97時，25 ℃達到最大的黃曲霉毒素產(chǎn)量；而在粳米上，33 ℃時AFB1的產(chǎn)量最高[27]。多個轉(zhuǎn)錄組分析和RT-qPCR實驗結(jié)果表明，溫度對黃曲霉合成基因簇基因的轉(zhuǎn)錄表達有著顯著影響，黃曲霉毒素合成基因簇調(diào)控基因和大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因在相對低溫的條件下被誘導(dǎo)表達。在30 ℃時，aflR和aflS表達水平分別比37 ℃高5倍和24倍，可見溫度可能通過影響合成基因簇特異性調(diào)控因子AflR和AflS的轉(zhuǎn)錄水平進而影響結(jié)構(gòu)基因的表達以及毒素產(chǎn)量[28]。此外，AflS是AflR的激活子，低溫導(dǎo)致了更高的AflS/AflR比例，從而進一步促進了毒素合成結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄[15,28]。到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)其他轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控蛋白響應(yīng)溫度變化，也沒有發(fā)現(xiàn)溫度感應(yīng)的相關(guān)受體，溫度變化的信號如何傳遞到AflR和AflS也是未知的，溫度如何調(diào)控黃曲霉毒素合成還需要進一步解析。

2.3 水活度的影響

水活度是食品或農(nóng)作物中自由水的含量，微生物只能利用自由水進行代謝，水活度是影響食品微生物生長和次生代謝的關(guān)鍵環(huán)境因素。同樣，不同水活度條件也影響黃曲霉毒素的生物合成。一般來說，較低的水活度抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生，高水活度條件促進黃曲霉毒素產(chǎn)生[5,18,27]。大部分黃曲霉和寄生曲霉在水活度低于0.90時，生長就會受到抑制，黃曲霉毒素產(chǎn)量顯著降低[29]。Lahouar等[30]從高粱上分離的一株黃曲霉在水活度低于0.94時就停止產(chǎn)毒，表明水活度對黃曲霉毒素的調(diào)控有著菌株特異性。此外，水活度也常常和溫度、光照、基質(zhì)、培養(yǎng)時間等環(huán)境條件相互作用，共同調(diào)節(jié)真菌毒素的產(chǎn)生[5,27]。玉米貯藏過程發(fā)現(xiàn)，貯藏5～7 d，在水活度0.98時適宜黃曲霉毒素產(chǎn)生；而貯藏10～12 d，水活度0.93～0.95時，黃曲霉毒素污染最嚴重[31]?；ㄉ献钸m的產(chǎn)毒條件為0.98，而粳米在水活度0.96時黃曲霉毒素產(chǎn)量最高[27]。Gallo等[32]發(fā)現(xiàn)在杏仁培養(yǎng)基上，水活度0.96和28 ℃條件AFB1產(chǎn)量最高。進一步對相關(guān)基因的表達檢測發(fā)現(xiàn)，在最適水活度條件下，黃曲霉合成基因簇基因表達水平最高，尤其是aflS和aflR的轉(zhuǎn)錄水平受水活度影響明顯。Zhang等[33]發(fā)現(xiàn)在水活度0.99條件下黃曲霉毒素和孢子產(chǎn)量均明顯高于水活度0.93，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示隨著水活度的提高，16個黃曲霉合成基因簇基因表達顯著增強，參與滲透勢調(diào)節(jié)的HOG途徑關(guān)鍵調(diào)控因子SakA轉(zhuǎn)錄明顯提高。筆者團隊近期也發(fā)現(xiàn)，最適的水活度條件能夠提高激酶SakA和轉(zhuǎn)錄因子AtfB的轉(zhuǎn)錄表達，推測水活度條件可能通過“激酶SakA-轉(zhuǎn)錄因子AtfB-AFs合成基因簇”的調(diào)控途徑影響黃曲霉毒素合成，具體的調(diào)控機制還有待進一步實驗確認。

在食品和糧食貯藏過程中，水活度是影響真菌毒素的關(guān)鍵因素，也是貯藏可控條件之一。解析水活度調(diào)節(jié)黃曲霉產(chǎn)毒的機制有助于建立抑制黃曲霉生長和產(chǎn)毒的綜合防控體系，具有重要意義。

2.4 碳源與氮源的影響

碳源、氮源、脂質(zhì)、氨基酸、微量元素等營養(yǎng)元素能夠影響黃曲霉毒素的產(chǎn)生，其中碳源和氮源營養(yǎng)對黃曲霉毒素合成的影響最顯著。

碳源代謝過程為黃曲霉毒素合成提供了基本碳單位，糖代謝的終產(chǎn)物(乙酰輔酶A)是黃曲霉毒素合成的最主要的起始單位，從底物供給水平上影響了毒素合成[7]。不同作物和食品中的碳源差異直接影響黃曲霉毒素污染程度。筆者團隊以玉米、大米、花生為基質(zhì)培養(yǎng)黃曲霉，轉(zhuǎn)錄組和蛋白組聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，不同作物基質(zhì)中的碳源(淀粉含量)差異是影響不同基質(zhì)產(chǎn)毒量的最主要原因[34]。進一步，Yu等[35]發(fā)現(xiàn)一個和蔗糖利用相關(guān)的基因簇與黃曲霉毒素合成基因簇緊密相連，基因簇的物理位置關(guān)系佐證了蔗糖對黃曲霉毒素合成的誘導(dǎo)。因此，對黃曲霉碳代謝的研究是解析黃曲霉毒素發(fā)生規(guī)律的重要組成內(nèi)容。不同碳源類型影響毒素產(chǎn)量。簡單糖，如葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖等有利于黃曲霉毒素的形成，而淀粉、山梨糖、乳糖、纖維素等復(fù)雜多糖抑制毒素合成[5, 7]。碳代謝阻遏途徑(carbon catabolic repression，CCR)是調(diào)控黃曲霉適應(yīng)不同碳源，選擇利用最適碳源的關(guān)鍵系統(tǒng)[36-37]。CreA是CCR途徑的核心轉(zhuǎn)錄因子，負責(zé)啟動下游多個水解酶的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控真菌的碳源利用過程[36-37]。CreA除了通過底物供給水平的調(diào)控影響黃曲霉毒素合成，還可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控毒素合成基因簇的表達[37]。creA敲除突變體在完全培養(yǎng)基上毒素產(chǎn)量顯著下降，而沒食子酸通過抑制CreA的表達影響毒素合成基因簇表達和毒素產(chǎn)量[37-38]。由此可見，CreA正調(diào)控黃曲霉合成基因簇的表達。對構(gòu)巢曲霉雜色曲霉素合成基因簇上多個基因的啟動子區(qū)分析，發(fā)現(xiàn)多個可與CreA結(jié)合的保守結(jié)構(gòu)域5′-SYGGRG-3′[37-39]，推測黃曲霉毒素合成基因簇也有類似的保守結(jié)合位點。根據(jù)上述信息，我們認為CreA是調(diào)控黃曲霉毒素合成的重要轉(zhuǎn)錄因子，是聯(lián)接碳代謝和黃曲霉毒素合成的重要節(jié)點。此外，CCR途徑包括多個調(diào)控蛋白，如激酶Snf1和SchA、磷酸酶Reg1、泛素化酶CreD、去泛素化酶CreB和CreC等，均可通過多個翻譯后修飾過程影響CreA活性[36-37]，并可能進一步通過CreA調(diào)控毒素合成過程。筆者團隊初步研究也發(fā)現(xiàn)Snf1和Reg1正調(diào)控黃曲霉毒素合成和毒素基因簇轉(zhuǎn)錄表達。碳源代謝、CCR途徑與黃曲霉毒素合成過程有著復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，而相關(guān)研究還較少，需要更多研究才能闡明碳代謝與毒素合成之間的復(fù)雜關(guān)系。

2.5 pH值的影響

pH值是影響真菌次生代謝過程的另一個重要環(huán)境因素，合成不同次生代謝產(chǎn)物均有其最適的pH值范圍。一般來說，環(huán)境條件偏酸時，真菌次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量提高，在黃曲霉、寄生曲霉、構(gòu)巢曲霉、赭曲霉、純綠青霉上都有著類似的表型[5,18]。黃曲霉毒素合成的最適pH值在3.4～5.5之間[5]。Nancy等[46]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基pH值等于4.0時，黃曲霉毒素是原培養(yǎng)基毒素產(chǎn)量的10倍；而將pH值從4.0提高到8.0，寄生曲霉和構(gòu)巢曲霉的產(chǎn)毒量均顯著下降。寄生曲霉中的研究還發(fā)現(xiàn)，pH值低于6.0時，B族黃曲霉毒素的產(chǎn)量會提高；而較高pH值條件則誘導(dǎo)G族黃曲霉毒素的生物合成[46-47]。PacC是曲霉屬真菌響應(yīng)pH值變化的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，堿性條件下PacC表達水平提高[48-49]。在堿性條件下，PacC被水解加工后激活，轉(zhuǎn)運到細胞核，與靶標基因的啟動子區(qū)結(jié)合，堿性pH值相關(guān)基因被激活轉(zhuǎn)錄，同時抑制酸性pH值相關(guān)基因表達[49]。寄生曲霉中aflR啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)PacC可能的結(jié)合位點，推測堿性條件下PacC可能作為轉(zhuǎn)錄的負調(diào)控因子結(jié)合于aflR啟動子區(qū)，抑制aflR轉(zhuǎn)錄表達[50]。但在構(gòu)巢曲霉上敲除pacC卻導(dǎo)致其雜色曲霉素產(chǎn)量顯著降低[51]?？梢奝acC對毒素的合成調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，可能與其他調(diào)控因子共同作用完成。除了PacC，絲狀真菌pH調(diào)控途徑還發(fā)現(xiàn)其他6個調(diào)控蛋白，均有著能感應(yīng)pH值信號的Pal結(jié)構(gòu)域，這些調(diào)控因子功能和作用機制還未解析[49]，需要更多相關(guān)研究才能完全解開pH值變化與黃曲霉毒素合成過程之間的關(guān)聯(lián)。

2.6 氧化脅迫作用

環(huán)境條件的變化會改變真菌細胞的活性氧狀態(tài)(reactive oxygen species，ROS)平衡，但過高的活性氧水平可能損傷細胞的蛋白、脂質(zhì)和DNA。為了避免活性氧爆發(fā)帶來的損害，真菌有著復(fù)雜的氧化脅迫抵御系統(tǒng)。多個轉(zhuǎn)錄因子在真菌遭受氧化脅迫時誘導(dǎo)表達，并激活下游相關(guān)酶促反應(yīng)[52]。事實上，對黃曲霉產(chǎn)生菌來說，黃曲霉毒素和其中間產(chǎn)物(NOR、VerA、OMST等)都是被高度氧化的分子，黃曲霉毒素合成也被認為是黃曲霉降低活性氧水平、抵御氧化脅迫的一種有效方式[53]。此前研究已證明，培養(yǎng)過程加入雙氧水，適當(dāng)提高真菌活性氧水平，能促進黃曲霉毒素的產(chǎn)量提高；而施用抗氧化劑，例如肉桂醛、丁香酚、抗壞血酸等，都能夠在一定程度抑制黃曲霉毒素合成[5,54-55]。

已有大量研究解析了氧化脅迫調(diào)控黃曲霉毒素合成的機制。研究表明：過氧化氫酶基因catA和超氧化物歧化酶基因mnsSOD與黃曲霉毒素合成基因簇基因aflA、aflM和aflP的啟動子區(qū)均包含了4個氧化應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(AtfB、SrrA、AP-1和MsnA)的結(jié)合位點，推測氧化應(yīng)激相關(guān)酶和毒素合成酶的表達共轉(zhuǎn)錄[53]。因此，可能的調(diào)控機制為：黃曲霉毒素產(chǎn)生菌受到氧化脅迫時，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子被激活，表達水平提高，從而促進下游氧化應(yīng)激酶類的轉(zhuǎn)錄，同時也增強了黃曲霉毒素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄表達和黃曲霉毒素的合成。AtfB是CREB/ATF家族蛋白，被認為是能同時調(diào)控抗氧化酶和毒素合成酶的最重要共調(diào)節(jié)子，能夠與毒素合成基因簇上的多個CRE位點(5′TG/TACGTC/AA3′)結(jié)合，從而激活毒素合成基因轉(zhuǎn)錄[56-57]。體外的ChIP和EMSA實驗也證明，AtfB確實與7個黃曲霉毒素合成基因的啟動子區(qū)互作結(jié)合[57]。鋅指類轉(zhuǎn)錄因子AtfA能夠與AtfB互作，共同調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，AtfA正調(diào)控合成基因簇[58]。有趣的是單獨敲除一個氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子，往往導(dǎo)致毒素產(chǎn)量提高。如突變體Δap-1和突變體ΔmsnA的黃曲霉毒素B1產(chǎn)量均提高[56]。推測這些突變體對活性氧的敏感度提高，反而促進了黃曲霉毒素的合成。該結(jié)果也進一步佐證了黃曲霉毒素在黃曲霉產(chǎn)生菌中發(fā)揮的抗氧化作用。綜合多個研究的結(jié)果表明，AtfA、AtfB、SrrA、AP-1和MsnA組成氧化脅迫響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)黃曲霉產(chǎn)生菌受到氧化脅迫時，刺激信號通過多個轉(zhuǎn)錄因子組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響真菌的氧化應(yīng)激響應(yīng)過程和黃曲霉毒素合成過程。

壓力激活的蛋白激酶途徑和促分裂原激活的蛋白激酶途徑(SAPK/MAPK)是傳遞氧化應(yīng)激信號、激活上述轉(zhuǎn)錄因子的重要環(huán)節(jié)[56]。SAPK/MAPK信號途徑在酵母、絲狀真菌以及高等真核生物中都高度保守，由三個激酶、兩步磷酸化過程組成[56]。磷酸信號從上游MAP3K和MAP2K依次傳遞到MAPK，并由MAPK磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子的絲氨酸/蘇氨酸殘基，進而激活下游靶標蛋白[56]。除了氧化應(yīng)激，MAPK通路也參與滲透脅迫和溫度響應(yīng)過程[59-60]。此外，氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子不僅僅被MAPK途徑影響，同時也被cAMP-PKA途徑調(diào)控。而調(diào)控細胞cAMP水平的PkaA、PkaC、PkaR等因子可與MAPK激酶SakA和MpkC互作。因此，cAMP-PKA途徑與MAPK途徑關(guān)系密切[61]。碳代謝也與cAMP信號途徑相耦聯(lián)，同時碳代謝相關(guān)信號也會影響MAPK通路的磷酸信號傳遞[61]?？梢?，光照、水活度(滲透勢)、溫度、碳源等環(huán)境因子之間有著復(fù)雜的互相影響和交叉調(diào)控過程，MAPK磷酸信號傳遞途徑是聯(lián)結(jié)不同環(huán)境信號刺激的共同通路，而這種機制也部分的解釋了不同的環(huán)境變化卻導(dǎo)致同樣表型的原因。

光照、溫度、水活度、碳氮源、pH、氧化脅迫等環(huán)境條件會直接影響黃曲霉毒素合成基因簇表達，或通過相關(guān)調(diào)控因子間接影響毒素合成過程，見圖2。環(huán)境因子對黃曲霉毒素合成的影響是一個復(fù)雜的過程，眾多調(diào)控蛋白參與其中?，F(xiàn)階段的研究結(jié)果只能部分的解釋調(diào)控過程，很多調(diào)控機制還未解析。對相關(guān)調(diào)控機制的解析有助于在食品或農(nóng)作物儲藏、加工過程中減少或抑制黃曲霉毒素發(fā)生，有的放矢的防控黃曲霉毒素污染。

圖2 環(huán)境因子對黃曲霉毒素的調(diào)控機制

3 黃曲霉菌和黃曲霉毒素的防控策略

黃曲霉防控技術(shù)包含2個方面的研究，即主動預(yù)防(黃曲霉生長控制)和被動脫除(黃曲霉毒素脫除)。防控方法主要有物理法(吸附劑、光、輻射等)、化學(xué)法(氨氣熏蒸法、堿處理、臭氧降解、提取揮發(fā)油等)和生物法(微生物拮抗、微生物吸附和降解等)。

3.1 物理法

3.1.1吸附劑吸附

吸附劑主要利用其自身的孔狀結(jié)構(gòu)，將固相-氣相、固相-液相等二相體系中的吸附物富集于吸附劑表面，使黃曲霉毒素與被污染的農(nóng)產(chǎn)品分離[62]。目前，市面上黃曲霉毒素吸附劑主要包括硅鋁酸鹽類(膨潤土、黏土、沸石、蒙脫石、水合硅鋁酸鹽等)、酵母細胞壁、活性炭、新型復(fù)合吸附劑等[63]。研究表明，蒙脫土對AFB1具有很強的吸附能力。蒙脫土對牛奶中的黃曲霉毒素(5 μg/kg)去除效率達到80%，而不會影響牛奶的營養(yǎng)[64]。Magnoli等[65]對阿根廷3種蒙脫石在肉雞飼料中吸附AFB1的效果進行研究，發(fā)現(xiàn)飼料中添加蒙脫石能輕肉雞的中毒癥狀。李新等[66]比較了沸石粉與“沸石粉+酵母細胞壁”兩種吸附劑減輕肉雞黃曲霉毒素中毒的效果，發(fā)現(xiàn)沸石粉和“沸石粉+酵母細胞壁”均能在較低AFB1污染水平(1 mg/kg)下有效緩解其負面影響，但沸石粉對2 mg/kg的AFB1的緩解作用強于酵母細胞壁。但有些吸附劑在吸附毒素的過程中也會吸附很多營養(yǎng)物質(zhì)，并且有可能在動物體內(nèi)代謝過程中解吸附，黃曲霉毒素重新暴露，對動物造成危害。因此物理吸附法應(yīng)進一步優(yōu)化并明確吸附劑的代謝過程，降低解吸附率，盡可能減少吸附劑對營養(yǎng)物質(zhì)的吸附[67]。

3.1.2光調(diào)控

光調(diào)控技術(shù)可不同程度的抑制黃曲霉生長及其次級代謝產(chǎn)物合成，同時又具有操控性強、能耗低、輻射低、污染小等優(yōu)點，因此具有重要應(yīng)用潛力[68]。程翠利[67]研究了藍、黃、綠、紅光對黃曲霉及黃曲霉毒素的影響，發(fā)現(xiàn)藍光、黃光處理可顯著抑制黃曲霉菌落萌發(fā)和對還原糖與蛋白的吸收，其中藍光可造成黃曲霉細胞壁、細胞膜及細胞器表面損傷，增加線粒體數(shù)目，造成細胞內(nèi)環(huán)境紊亂。在毒素合成方面，藍光組可使AFB1、AFB2、CPA、STR、AFG1、AFG2分別下降 96.33%、91.56%、92.27%、90.74%、61.78%、28.22%；黃光組分別下降 89.00%、75.58%、92.27%、90.74%、61.78%、45.41%；而紅光和綠光卻能促進黃曲霉生長及毒素合成[67]。

3.1.3輻照降解

電子束輻照技術(shù)能夠產(chǎn)生低能或高能電子束射線，利用高能脈沖直接作用破壞活體生物細胞內(nèi)DNA或通過間接作用使小分子和水發(fā)生輻解[69]。因此可以殺滅黃曲霉菌或降解黃曲霉毒素。王瑞琦等[70-71]和李苑等[72]采用240 kGy的電子束處理花生粕，AFB1的降解率達57.49%(初始量為120.24 μg/kg)，同時花生粕中的粗蛋白、粗脂肪、氨基酸總量、總糖和灰分含量變化不大，還原糖、總黃酮含量還有所增加。輻照設(shè)備簡單，價格低廉，但是能量損耗巨大，高劑量的輻照也可能對操作人員帶來潛在的身體傷害，因此并未被廣泛應(yīng)用[69]。

3.2 化學(xué)法

3.2.1傳統(tǒng)化學(xué)降解

黃曲霉在強堿性條件下能迅速分解，破壞其內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，進而轉(zhuǎn)化為香豆素鈉鹽等[73]。趙國斌等[74]用氨氣熏蒸法降解黃曲霉，結(jié)果顯示該方法效果顯著，最高降解率達95.06%。李娟[75]使用強氧化劑次氯酸鈉能將花生中的AFB1含量降低至零，但該方法對花生品質(zhì)有較大影響。陳冉等[76]用臭氧處理被AFB1污染過的花生，脫毒效果顯著，但也會降低花生品質(zhì)。傳統(tǒng)的化學(xué)脫毒效果顯著，但因毒性強，污染大，會破壞營養(yǎng)品質(zhì)，對環(huán)境造成不可逆影響等缺點，所以逐漸被淘汰。

3.2.2植物精油抑制

植物精油是由一系列揮發(fā)性有機物如酚類、萜類、醛酮類、醇類、酸類及芳香族化合物組成的混合物，是一類油狀具有揮發(fā)性的芳香味物質(zhì)。主要來源于高等植物的葉、枝、木漿或樹皮組織，也廣泛見于苔蘚類植物[77]。很多植物精油具有較高的生物安全性，被美國食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定為“一般認為安全”(generally recognized as safe，GRAS)[78]。因植物精油在抗真菌方面具有高效，綠色、環(huán)保的優(yōu)勢而受到人們的廣泛關(guān)注。

植物精油可有效抑制黃曲霉的生長和黃曲霉毒素的合成，其主要原因可能是多種植物精油能夠破壞黃曲霉細胞內(nèi)發(fā)生一系列的氧化反應(yīng)，使菌體通過應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生過氧化物，使細胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生過氧化，細胞膜受損，最終使得黃曲霉細胞死亡[79]。也有報道稱，植物精油含有的酚類及萜烯類化合物可以有效破壞黃曲霉的遺傳物質(zhì)，使線粒體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，對黃曲霉的線粒體的有氧呼吸功能產(chǎn)生嚴重影響[80]。另外，植物精油也可以通過抑制黃曲霉菌絲及分生孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)，抑制黃曲霉的繁殖與生長和發(fā)育[81]。有報道稱，胡蘆巴油可有效抑制黃曲霉的生長，最小抑菌濃度為0.87 μg/mL，當(dāng)濃度為1 000 μg/mL時，對黃曲霉菌的抑制率可達100%[82]。分別將60 mg的肉桂精油、山蒼子精油、丁香精油處理20 g黃曲霉污染的玉米，密封熏蒸30 d后，玉米中AFB1脫毒率分別為81.86%，77.76%，68.25%，對黃曲霉菌抑制產(chǎn)毒具有良好的效果[83]。孜然精油使黃曲霉生長降低81.9%，AFB1合成量下降83.01%，胞內(nèi)總過氧化物含量減少33.75%，而且黃曲霉的菌絲和孢子都遭到了破壞[84]。羅勒精油也被報道可有效抑制黃曲霉的生長，當(dāng)羅勒精油的濃度在1 500～2 000 μg/kg時，稻谷中的黃曲霉生長完全受到抑制[85]。

目前植物精油的研究已經(jīng)不僅僅局限于植物精油本身，而是將其通過特殊處理如做成納米乳劑，固定化等方式提高其抑制黃曲霉生長以及毒素合成的活性，以達到更好的商業(yè)和工業(yè)應(yīng)用的目的。例如，杉木精油也具有抗真菌活性，被殼聚糖包埋后的杉木精油進一步提高了其抑制黃曲霉的效果[86]。

3.3 生物法

3.3.1微生物拮抗

對黃曲霉菌及毒素的防控研究中，報道的具有拮抗作用的菌株極多。但由于應(yīng)用場景主要為糧食和飼料，因此我們主要關(guān)注生物安全性相對高的菌株，如乳酸菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、木霉菌等。Zhao等[87]篩選到一株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)IAMU80070可有效抑制黃曲霉的生長，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌分泌的幾丁質(zhì)酶破壞了黃曲霉菌絲和孢子的細胞結(jié)構(gòu)，抑制了黃曲霉生長及產(chǎn)毒。金黎明等[88]采用單因素試驗和響應(yīng)面試驗對枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，成功將其對黃曲霉的抑菌能力提高了1.9倍。張學(xué)雯等[89]鑒定出解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)中具有抑菌活性的脂肽類抗生素分別為C14和C15的bacillocnycin。徐楊玉等[90]研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉(Trichodermaviride)的發(fā)酵液不僅能夠抑制黃曲霉生長還具有降解AFB1的作用。

3.3.2細胞壁吸附

多種微生物對黃曲霉毒素具有吸附作用。目前多采用乳酸菌、酵母菌、糙皮側(cè)耳等益生菌菌體對AFB1進行處理，形成復(fù)合物，從而減輕AFB1對人和動物造成的危害[91-92]。這類益生菌的高效、對人畜無害、對環(huán)境友好的特點，在黃曲霉毒素污染防控方面受到了人們的廣泛關(guān)注。菌體能吸附AFB1的主要原因可能是細胞壁上肽聚糖和多糖等成分通過形成非共價鍵與AFB1結(jié)合[91-92]。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在PBS小腸緩沖液中的菌濃度達到1010CFU/mL時，可在5 min內(nèi)吸附99.3%的AFB1[93]。開菲爾乳桿菌(Lactobacilluskefir)在牛奶中繁殖到8.4×107CFU/mL時，24 h可以吸附82%的AFB1(1 μg/mL)[94]。杏鮑菇(Pleurotuseryngii)也被報道有吸附AFB1的能力。在28 ℃，pH值分別為3.7和7.4條件下，48 h杏鮑菇可完全吸附AFB1[95]。熱力學(xué)研究表明：這是一個自發(fā)的物理吸附過程，杏鮑菇菌絲對AFB1的去除率最高可達85.13%, 推測真菌細胞壁上的羧酸或磷酸鹽配體以及羥基和酰胺功能基團與AFB1分子形成了相對弱的非共價鍵[95]。

3.3.3微生物降解

在分離得到黃曲霉毒素降解微生物中，各種毒素降解酶起到了關(guān)鍵作用。目前分離純化出的酶包括錳過氧化物酶[96]，F(xiàn)420依賴型還原酶[97]，水解酶[98]，還原酶[99]和細胞色素P450酶[100]，有關(guān)降解途徑見圖3。漆酶(Lac)和錳過氧化物酶(MnP)能夠高效降解AFB1，相關(guān)研究最多，如杏鮑菇粗提物中含有高活性漆酶(4 U/g)和低活性錳過氧化物酶(0.4 U/g)，在pH值為8時，反應(yīng)3 d可以降解90% AFB1，反映出極好的應(yīng)用潛力[101]。在最新的研究中，白腐真菌色齒毛菌(Cerrenaunicolor)6884中分離純化出一種漆酶，在pH 7.0，45 ℃下與5 μg/mL AFB1反應(yīng)24 h，可全部降解AFB1，降解產(chǎn)物鑒定為AFQ[102]；寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)菌株CW117在24 h內(nèi)可全部降解45 μg/mL的AFB1，降解活性成分位于培養(yǎng)上清液，且降解活性隨著溫度的升高而升高，降解活性在90 ℃時仍保持穩(wěn)定，研究發(fā)現(xiàn)是漆酶和小分子氧化物共同對AFB1發(fā)揮降解作用，該菌株有著較大應(yīng)用前景[103]；緩慢葡萄球菌(Staphylococcuslentus)被報道可以抑制黃曲霉生長并降解AFB1，分別在高粱和花生中添加10 mL/kg和25 mL/kg的菌液，黃曲霉的生長受到完全抑制，而液體培養(yǎng)的緩慢葡萄球菌可以降解96.54%的AFB1，但并未檢測到特定降解產(chǎn)物[104]。

圖3 黃曲霉毒素降解途徑

4 結(jié)論與展望

黃曲霉廣泛侵染玉米、花生等農(nóng)產(chǎn)品，侵染后還會產(chǎn)生強毒性、高致癌性的黃曲霉毒素等真菌毒素，嚴重威脅了食品安全和人畜健康。因此，摸清黃曲霉及其毒素的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，開發(fā)綠色、安全、高效的真菌毒素防控技術(shù)和產(chǎn)品尤為重要。

黃曲霉毒素的產(chǎn)生受到宿主、光照、溫度、水活度等環(huán)境因素影響，當(dāng)環(huán)境無法達到真菌的產(chǎn)毒條件時，可能會降低真菌的產(chǎn)毒量甚至不產(chǎn)毒。因此，在不影響農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)及儲藏的情況下尋找一種最佳的防控真菌產(chǎn)毒的條件是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中追求的目標，如：光調(diào)控、輻照等。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用微生物組學(xué)發(fā)掘、分子生物學(xué)調(diào)控分析、遺傳學(xué)改造等多種生物技術(shù)進行黃曲霉及其毒素的生物防控已成為研究重點。且生物防治方法對農(nóng)產(chǎn)品的營養(yǎng)物質(zhì)損失較小，對環(huán)境污染少，防控特異性高，是具有較高防控效果和應(yīng)用前景的黃曲霉毒素防控策略。然而，目前國內(nèi)外黃曲霉及其毒素的生物防控技術(shù)還處于前期基礎(chǔ)研究階段，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用才剛剛起步。利用微生物防控黃曲霉、生物酶降解黃曲霉毒素的關(guān)鍵在于發(fā)掘出能分泌高活性抑菌物質(zhì)或解毒酶的菌株，并在實際應(yīng)用中構(gòu)建出一個有利于拮抗菌生長和脫毒酶反應(yīng)的環(huán)境。因此，通過各種生物技術(shù)來獲得更優(yōu)質(zhì)和適用范圍更廣的拮抗菌和解毒酶是今后研究的重點方向。