步 營，何 瑋，胡顯杰,2，朱文慧,*，李學(xué)鵬,*，劉 賀，畢 蕾，季廣仁

(1.渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034；3.撫順獨(dú)鳳軒骨神生物技術(shù)股份有限公司，遼寧 撫順 113122；4.錦州筆架山食品有限公司，遼寧 錦州 121007)

我國是世界上最大的貝類養(yǎng)殖國，貝類養(yǎng)殖已經(jīng)成為沿海海水養(yǎng)殖業(yè)的支柱之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年我國海水養(yǎng)殖貝類總產(chǎn)量1 463.51萬t，占貝類總產(chǎn)量的91.93%，其中，蛤類占海水養(yǎng)殖貝類總產(chǎn)量的27.88%[1]。藍(lán)蛤(Aloididaealoidi)是盛產(chǎn)于我國沿海的一種低值海洋貝類，隸屬于軟體動(dòng)物門瓣鰓綱(Lamellibranchia)、海螂目(Myoida)、藍(lán)蛤科(Aloidiidae)，在我國南北方均有分布[2]。藍(lán)蛤個(gè)體較小，食用價(jià)值不大，常被作為一種很好的對(duì)蝦活餌料。藍(lán)蛤肉營養(yǎng)豐富，粗蛋白含量較高，是制備海鮮調(diào)味料的優(yōu)質(zhì)原料[3]。

生物酶解技術(shù)反應(yīng)溫和、過程可控，通過該技術(shù)獲得蛋白水解物，已經(jīng)成為開發(fā)海鮮調(diào)味料的關(guān)鍵技術(shù)。普通酶解法存在著酶解時(shí)間較長、效率低、酶解液苦腥味重且鮮味不足等問題，Cheret等[4]研究發(fā)現(xiàn)，超高壓處理對(duì)海鱸魚中的鈣蛋白酶活性存在雙重作用。Giannoglou等[5]研究發(fā)現(xiàn)，超高壓處理(100～450 MPa，20～40 ℃)能夠改變酶活性，影響蛋白酶的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。這些研究說明：高壓處理對(duì)蛋白質(zhì)水解的影響與處理壓力和酶二者都存在著關(guān)聯(lián)，高壓處理后的酶解產(chǎn)物在產(chǎn)物的種類與數(shù)量上都和常壓酶解條件下的不同[6]。所以利用超高壓技術(shù)處理改良酶解產(chǎn)物，可以實(shí)現(xiàn)有目標(biāo)的定性改良產(chǎn)品風(fēng)味的目的。但目前關(guān)于超高壓酶解如何影響酶解液風(fēng)味、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和外源蛋白酶酶活的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

鑒于此，通過研究超高壓處理對(duì)藍(lán)蛤酶解液風(fēng)味和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，分析超高壓處理與藍(lán)蛤酶解液風(fēng)味物質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，研究結(jié)果希望能為高品質(zhì)海鮮調(diào)味料的生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)蛤(鮮活)，錦州市林西水產(chǎn)市場(chǎng)；風(fēng)味蛋白酶(500MG)、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(11039)，均為食品級(jí)，北京市諾維信投資有限公司；0.05 mol/L氫氧化鈉、標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；檸檬酸(分析純)，福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司；乳酸(分析純)、L-蘋果酸(分析純)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；丁二酸(分析純)、十二烷基磺酸鈉(SDS)(分析純)，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP.L 2-600/0.6型超高壓設(shè)備，天津華泰森淼公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；Biofuge stratos型臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)，美國Thermo Fisher公司；Kjeltec 8400型全自動(dòng)定氮儀，瑞典Foss公司；SA 402B型電子舌，日本Insent公司；7890N-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、1100型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；固相微萃取裝置、固相微萃取手柄、20 mL頂空樣品瓶，美國Supelco公司；970CRT型熒光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；S-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，日本日立公司；UV-2550型紫外可見光分光光度計(jì)，島津儀器(蘇州)有限公司；IRTRACE-100型傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品制備

1.3.1.1 酶解液的制備

不同壓力處理酶解液的制備：取一定量的藍(lán)蛤肉，按質(zhì)量比1∶1加水，用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至7.0，按藍(lán)蛤肉質(zhì)量的0.2%添加復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶(質(zhì)量比1∶1)，分別在150、200、250、300 MPa的壓力下給壓60 min(分別以UP150、UP200、UP250、UP300表示)，然后50 ℃水浴加熱，酶解4 h后100 ℃滅酶10 min，冷卻過濾，離心(8 178 r/min，20 min)取上清液，-40 ℃冷凍，備用。

常壓處理酶解液的制備：原料不經(jīng)過超高壓處理，其他同上。

1.3.1.2 藍(lán)蛤蛋白的提取

將藍(lán)蛤肉(常壓處理、超高壓處理)攪碎，加入2倍體積的20 mmol/L的Tris-HCl(pH值7.2)，高速均質(zhì)1次(5 500 r/min，90 s)，在5 000 r/min條件下離心15 min。取上清液按高速均質(zhì)離心過程反復(fù)2次，在最后一次沉淀中加入2倍體積20 mmol/L Tris-HCl-NaCl緩沖液(含0.6 mol/L NaCl，pH值7.2)，高速(5 500 r/min)均質(zhì)30 s之后，5 000 r/min離心15 min，取上清液置于-80 ℃冰箱冷凍備用(整個(gè)提取過程在0～4 ℃條件下進(jìn)行)[7]。

1.3.2酶處理及酶活的測(cè)定

1)酶液的配置：參照曹輝[8]和Hernández-Ledesma等[9]的方法并改進(jìn)，準(zhǔn)確稱取復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶各0.50 g，用磷酸緩沖溶液(pH值7.0)溶解，然后定容至100 mL(0～4 ℃下進(jìn)行)，裝入高壓蒸煮袋中，密封，冷藏備用。

2)超高壓處理：壓力分別為150、200、250、300 MPa，給壓時(shí)間為60 min；水相保壓，內(nèi)腔溫度保持在0～4 ℃(冰水混合物)。

3)酶液的制備：將處理好的酶液，在50～55 ℃的溫度下加熱30 min，過濾，冷藏待測(cè)，以不經(jīng)超高壓處理的樣品為對(duì)照組。

4)酶活測(cè)定：參考肖麗[10]方法進(jìn)行。

1.3.3游離氨基酸的測(cè)定

參考GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定》[11]。對(duì)游離氨基酸的味道強(qiáng)度值(TAV)[12]進(jìn)行計(jì)算，見式(1)。

TAV=C/T。

(1)

式(1)中，C，滋味物質(zhì)的絕對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)值，mg/100g；T，滋味物質(zhì)的味道閾值，mg/100g。

1.3.4核苷酸的測(cè)定

色譜條件[13]：C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相0.05 mol/L磷酸二氫鉀-甲醇溶液(pH值4.5)，臨用前超聲脫氣；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；紫外檢測(cè)器波長254 nm；時(shí)間20 min。洗脫程序：0～7 min，體積分?jǐn)?shù)100%甲醇；7～10 min，體積分?jǐn)?shù)100%甲醇；10～17 min，體積分?jǐn)?shù)85%甲醇-體積分?jǐn)?shù)25%磷酸二氫鉀；17～20 min，體積分?jǐn)?shù)100%甲醇。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)、5′-肌苷酸(IMP)各0.01 g，用超純水溶解，定容到100 mL，得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。取標(biāo)準(zhǔn)使用液1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL，加入超純水定容至10 mL，混勻，配制質(zhì)量濃度梯度分別為10、20、40、60、80、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。進(jìn)樣20 μL，于254 nm處測(cè)量峰高和峰面積，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，取平均值。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品處理：稱取5 g藍(lán)蛤酶解液加入15 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的高氯酸，勻漿后于4 ℃、8 674 r/min離心10 min，取上清液。沉淀中加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的高氯酸，相同條件勻漿離心。合并2次上清液，用5 mol/L KOH調(diào)pH值至6.75，超純水定容至50 mL，吸取1 mL樣品稀釋液，0.22 μm濾膜過濾。

1.3.5鮮味評(píng)價(jià)方法

味精當(dāng)量(EUC)[14]的計(jì)算見式(2)。

w(EUC)=∑w(ai)bi+

(2)

式(2)中，w(EUC)，味精當(dāng)量，g/100g；w(ai)，鮮味氨基酸(Asp、Glu)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g/100g；bi，鮮味氨基酸相對(duì)于味精的相對(duì)鮮度系數(shù)(Glu為1.000，Asp為0.077)；w(aj)，呈味核苷酸(IMP、AMP)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g/100g；bj呈味核苷酸相對(duì)于IMP的相對(duì)鮮度系數(shù)(IMP為1.00，AMP為0.18)；1 218，協(xié)同作用系數(shù)。

1.3.6有機(jī)酸的測(cè)定

色譜條件[15]：C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相為0.01 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(pH值2.8)、甲醇(體積比95∶5)，臨用前超聲波脫氣；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測(cè)器波長205 nm；時(shí)間15 min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、乳酸各0.01 g，溶于超純水，定容到100 mL。取標(biāo)準(zhǔn)使用液0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 mL，加入超純水定容至10 mL，混勻。進(jìn)樣10 μL，于205 nm處測(cè)量峰高和峰面積，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，取平均值。以有機(jī)酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品處理：取5 g樣品加入0.25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%高氯酸，混勻靜置20 min，9 143 r/min冷凍離心10 min，吸取1 mL上清液，用0.45 μm濾膜過濾。

1.3.7電子舌測(cè)定

參照吳浩等[16]方法并改進(jìn)。將藍(lán)蛤酶解液按體積比稀釋10倍，0.45、0.22 μm的濾膜過濾，取80 mL樣液置于電子舌測(cè)試杯中，對(duì)苦、鮮及其回味進(jìn)行測(cè)定。以參比液(30 mmol/L KCl和0.3 mmol/L酒石酸)為空白對(duì)照。

1.3.8GC-MS測(cè)定

樣品萃取[17]：取5 mL樣液，裝入固相微萃取小瓶，加入轉(zhuǎn)子，密封，50 ℃水浴平衡10 min，插入固相微萃取針頭，推動(dòng)手柄，纖維頭為頂空狀態(tài)，吸附30 min，進(jìn)樣。

色譜條件：Agilent 7890N型氣相色譜儀，HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；載氣為氦氣，流速1.5 mL/min；不分流模式進(jìn)樣；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0 ℃，保持4 min，以5 ℃/min的速率上升至90 ℃，保持5 min，再以升溫速率5 ℃/min上升至230 ℃，保持3 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊(EI源)，電子能量70 eV；色譜-質(zhì)譜接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z30～550 u。

1.3.9藍(lán)蛤蛋白SDS-PAGE測(cè)定

參考秦軍委等[18]的方法改進(jìn)后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3.10藍(lán)蛤蛋白內(nèi)源熒光測(cè)定

用20 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(含0.6 mol/L NaCl，pH值7.2)將樣品質(zhì)量濃度調(diào)整到0.25 mg/mL，采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度。測(cè)定條件：激發(fā)波長295 nm，狹縫均為5 nm，掃描速度1 000 nm/min，掃描范圍250～350 nm，靈敏度為2，以緩沖溶液為空白對(duì)照。

1.3.11藍(lán)蛤蛋白紫外光譜測(cè)定

用20 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(含0.6 mol/L NaCl，pH值7.2)將樣品質(zhì)量濃度調(diào)整到0.1 mg/mL，采用紫外可見光分光光度計(jì)測(cè)定光譜。測(cè)定條件：掃描范圍200～340 nm，以緩沖溶液為空白對(duì)照[19]。

1.3.12藍(lán)蛤蛋白傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

取適量樣品(凍干粉末)與100 mg KBr(質(zhì)量比1∶100)混合，研磨，壓片。使用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1進(jìn)行檢測(cè)，分辨率4 cm-1，室溫20 ℃，累計(jì)掃描10次，記錄數(shù)據(jù)[19]。

1.3.13藍(lán)蛤蛋白掃描電鏡觀察

取適量藍(lán)蛤蛋白粉粘貼在樣品銅臺(tái)(銅臺(tái)事先貼好5 mm×3 mm×1 mm電鍍膠)，離子濺射儀鍍膜噴金，電鏡觀察。測(cè)試條件為加速電壓10 kV，能量分辨率Mn Kα 132 eV[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)，采用軟件SPSS 19.0進(jìn)行ANOVA分析和正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異顯著，采用Origin 9.1軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超高壓處理對(duì)酶活的影響

圖1表示不同壓力處理后風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶活的變化。風(fēng)味蛋白酶在壓力250 MPa(60 min)的條件下酶活最高，其酶活力為1 843.95 U/g，比常壓增大了728.66 U/g，是常壓的1.65倍，結(jié)果差異顯著；復(fù)合蛋白酶在壓力250 MPa(60 min)條件下酶活雖然與常壓相比差異不顯著，但其酶活力卻為最高(19 615.59 U/g)，是常壓的1.07倍，說明超高壓處理能改變風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶活。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由圖1可知，隨著壓力的增大，風(fēng)味蛋白酶酶活呈先上升后下降的趨勢(shì)，尤其在300 MPa時(shí)，其活性迅速下降，低于常壓酶活。進(jìn)一步證明：在一定的壓力范圍內(nèi)可以激活酶的活性，但是高于一定的壓力又會(huì)抑制酶的活性。施加壓力，風(fēng)味蛋白酶三級(jí)結(jié)構(gòu)可能被改變，酶活性中心暴露，其物化特性和化學(xué)反應(yīng)速度被激活或抑制[21]。

綜合來看，在250 MPa、60 min的條件下可提高復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的酶活。較之復(fù)合蛋白酶，超高壓對(duì)風(fēng)味蛋白酶的酶活激活作用更強(qiáng)(差異顯著)，這也可能會(huì)改善酶解液的風(fēng)味。

2.2 不同超高壓處理對(duì)游離氨基酸的影響

表1是不同壓力處理?xiàng)l件下酶解液的游離氨基酸組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)。由表1可知，超高壓處理后的酶解液中游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)都要高于常壓處理組，且絕大多數(shù)游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在200 MPa(60 min)時(shí)有最大值。對(duì)比常壓酶解液和不同超高壓處理的酶解液可知，不同壓力處理組總游離氨基酸(TAA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和必需氨基酸(EAA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于常壓酶解液，而EAA/TAA幾乎無變化。這說明超高壓處理可以提高酶解液中氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而不改變其比例。

表1 不同壓力處理對(duì)藍(lán)蛤酶解液游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

結(jié)合TAV值可知，當(dāng)TAV>1時(shí)，表示該物質(zhì)對(duì)樣品的呈味起主要貢獻(xiàn)，且數(shù)值越大，影響越顯著[22]。各處理組除Gly、Ser、Thr、Pro和Leu外，其他游離氨基酸TAV均大于1，其中鮮味氨基酸(Glu、Ala)TAV均大于6；因此，Glu和Ala對(duì)酶解液的呈味有重要影響，且影響顯著[23]?？辔栋被?Lys、Met、Val、Ile、Leu、His、Phe)TAV均小于4。Ala的TAV大于6，是甜味氨基酸中TAV值最大的，Ala作為提鮮的協(xié)同游離氨基酸，也有重要貢獻(xiàn)。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，可以推測(cè)超高壓處理可能使酶切位點(diǎn)暴露，增加水解度，從而提高酶解液中的游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，改善酶解液的風(fēng)味。

氨基酸通常呈現(xiàn)鮮味、甜味、苦味和硫味等不同滋味。圖2表示不同壓力處理對(duì)藍(lán)蛤酶解液中5類呈味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。從圖2可以看出，鮮味、甜味、苦味、咸味、酸味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈先上升后下降的趨勢(shì)，在200 MPa(60 min)出現(xiàn)峰值，分別為873、1 187、988、369、438 mg/100 g，占總游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的34.32%、46.66%、38.84%、14.50%、17.22%。其中鮮味、甜味、苦味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，咸味、酸味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，且超高壓處理組的5類呈味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于常壓處理組。由此推斷，相較于常壓酶解，超高壓處理對(duì)酶解液滋味成分的貢獻(xiàn)較大，可改善酶解液滋味。

鮮味氨基酸：Glu、Asp、Gly、Ala；甜味氨基酸：Gly、Ala、Ser、Thr、Pro、Arg；苦味氨基酸：Lys、Met、Val、Ile、Leu、Try、His、Phe；咸味氨基酸：Glu、Asp；酸味氨基酸：Glu、Asp、His。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 不同超高壓處理對(duì)核苷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

表2是不同壓力處理下酶解液中IMP和AMP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。IMP一般與其他物質(zhì)起協(xié)同增鮮、增香的作用[25]。由表2可知，5種酶解液中IMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)在250 MPa最高，為176.30 μg/100 g，說明超高壓處理可以改善酶解液風(fēng)味。對(duì)比超高壓處理組和常壓處理組，隨著壓力的增加，IMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先下降后上升的趨勢(shì)；UP250和UP300組IMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)高于常壓處理組，差異顯著(P<0.05)。

表2 不同壓力處理對(duì)藍(lán)蛤酶解液核苷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

酶解液中AMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于IMP，各處理組差異顯著(P<0.05)。其中250 MPa時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為4.03 mg/100 g。在300 MPa時(shí)AMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)最小，且小于常壓，為2.48 mg/100 g。這可能是高壓抑制酶活，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞導(dǎo)致。

2.4 不同超高壓處理對(duì)EUC的影響

呈味氨基酸與呈味核苷酸可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，顯著提高食品的鮮味，為了更加全面地評(píng)價(jià)藍(lán)蛤酶解液的鮮味，可采用EUC評(píng)價(jià)鮮味強(qiáng)度[26]。常壓、UP150、UP200、UP250、UP300組的EUC值大小分別為0.41、0.43、0.47、0.53、0.44 g/100 g。味精呈味閾值為0.03 g/100 g，各組酶解液EUC值均高于味精呈味閾值，且超高壓處理組大于常壓組。因此，可利用超高壓酶解工藝提取藍(lán)蛤中的呈味物質(zhì)，為后期生產(chǎn)味精替代品提供了一定的理論支撐。

2.5 不同超高壓處理對(duì)有機(jī)酸質(zhì)量濃度的影響

表3表示不同壓力處理對(duì)藍(lán)蛤酶解液中有機(jī)酸質(zhì)量濃度的影響，差異顯著(P<0.05)。從表3可以看出，與常壓組相比，乳酸質(zhì)量濃度隨著壓力的增大而減少，在150 MPa出現(xiàn)最大值(3.75 mg/mL)；琥珀酸質(zhì)量濃度隨著壓力的增大而增加，在300 MPa出現(xiàn)最大值(8.77 mg/mL)，即施加不同壓力，乳酸質(zhì)量濃度減少，琥珀酸質(zhì)量濃度增加。結(jié)合TAV值可得，乳酸和琥珀酸TAV值均大于1，說明有機(jī)酸單獨(dú)存在時(shí)，在酶解液中呈味貢獻(xiàn)大，尤其是琥珀酸。琥珀酸及其鈉鹽(如琥珀酸二鈉，又稱干貝素)，是海產(chǎn)品中重要的呈鮮物質(zhì)。琥珀酸二鈉是被批準(zhǔn)的唯一的有機(jī)酸類增味劑，已被廣泛使用[27]。結(jié)合游離氨基酸和核苷酸結(jié)果可得，藍(lán)蛤酶解呈味物質(zhì)為有機(jī)酸和游離氨基酸，其中琥珀酸TAV值遠(yuǎn)大于游離氨基酸和核苷酸，說明在貝類酶解液中琥珀酸為主要呈味物質(zhì)。有研究表明：低質(zhì)量濃度的琥珀酸對(duì)谷氨酸鈉有相乘作用，并且可以提高產(chǎn)品喜好度[28]，本研究酶解液中谷氨酸和琥珀酸相互作用，可以提高酸解液的鮮味值并提高產(chǎn)品喜好度。超高壓酶解可能是通過增加酶解液中的琥珀酸含量來提高酶解液的鮮味值。

表3 不同壓力處理對(duì)藍(lán)蛤酶解液有機(jī)酸質(zhì)量濃度的影響

2.6 電子舌結(jié)果分析

電子舌通過模擬人的味覺識(shí)別系統(tǒng)，可以在量化感官數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上評(píng)價(jià)體系的一致性，更能具體地反映藍(lán)蛤酶解液的滋味輪廓。圖3表示不同壓力對(duì)藍(lán)蛤酶解液電子舌鮮味值影響的雷達(dá)圖。從圖3可以看出，超高壓處理組的鮮味值要大于常壓組，且隨著壓力的增大，電子舌鮮味值呈先上升后下降的趨勢(shì)，且在250 MPa(60 min)時(shí)出現(xiàn)最大值，為13.64，進(jìn)一步證明超高壓對(duì)改善水產(chǎn)品酶解液風(fēng)味有顯著效果。

圖3 不同壓力處理藍(lán)蛤酶解液的鮮味雷達(dá)圖

表4表示UP250超高壓處理組與常壓處理組的藍(lán)蛤酶解液苦味、鮮味及其回味值差異。從表4可以看出，經(jīng)過超高壓處理后，酶解液苦味及其回味降低，鮮味及其回味增加，進(jìn)一步證明超高壓對(duì)改善水產(chǎn)品酶解液風(fēng)味有顯著效果。

表4 苦味、鮮味及其回味結(jié)果

2.7 GC- MS結(jié)果分析

不同壓力處理組和常壓組的揮發(fā)性成分及相對(duì)含量如表5。由表5可知，鑒定出48種揮發(fā)性物質(zhì)，分別是醇類、醛類、酮類、酯類、酚類、芳烴類、烷烴類和其他類。其中常壓處理組檢測(cè)出35種揮發(fā)性化合物，UP150組有35種，UP200組有28種，UP250組有30種，UP300組有31種。

由表5可以看出，超高壓處理后，芳烴類化合物的種類和相對(duì)含量明顯增加，其中在超高壓處理組檢測(cè)到具有芳香氣味的苯乙烯。醛類閾值較低，具有清香、果香和堅(jiān)果香等特征風(fēng)味，是食品中重要的揮發(fā)性成分[29]。醛類物質(zhì)在超高壓處理前后數(shù)量減少，其中有惡臭的3-甲硫基丙醛變成了癸醛，苯甲醛含量減少，說明超高壓處理使得酶解液風(fēng)味得到改善。醛是脂肪熱降解的產(chǎn)物，醛類物質(zhì)種類與含量的減少可能是由于醛屬于不穩(wěn)定的中間體化合物，在施加不同壓力時(shí)，藍(lán)蛤肉和酶的結(jié)構(gòu)被破壞及分子內(nèi)部化學(xué)環(huán)境改變導(dǎo)致的。酮類作為另一種重要的呈味物質(zhì)，具有水果、草、油和花的香味，在水解產(chǎn)物也起著重要作用，主要是脂肪酸的自動(dòng)氧化或由Strecker反應(yīng)產(chǎn)生的氨基酸降解形成的[30]，適量的酮類貢獻(xiàn)甜的花香和果香風(fēng)味，而過量的酮類則會(huì)產(chǎn)生不良?xì)馕丁?/p>

表5 不同壓力處理藍(lán)蛤酶解液GC-MS結(jié)果分析

2.8 超高壓處理藍(lán)蛤蛋白SDS- PAGE分析

圖4為不同壓力處理藍(lán)蛤肌原纖維蛋白SDS-PAGE分析。200、100、50、43、35～38、32、18 kDa分別為重鏈肌球蛋白、副肌球蛋白、肌間線蛋白、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白、肌鈣蛋白和輕鏈肌球蛋白[31]。藍(lán)蛤蛋白主要由重鏈肌球蛋白、副肌球蛋白和肌鈣蛋白組成。隨著壓力的增大，重鏈肌球蛋白、副肌球蛋白條帶在300 MPa時(shí)變粗；肌鈣蛋白條帶變淺，并消失。這是因?yàn)榇蠓肿拥鞍踪|(zhì)不能進(jìn)入分離膠，經(jīng)高壓長時(shí)間處理，內(nèi)源酶被激活，藍(lán)蛤蛋白三、四級(jí)結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，加速蛋白質(zhì)降解，出現(xiàn)大分子的肽鍵斷裂及小分子化合物的降解，使大分子變小，小分子進(jìn)一步解離，進(jìn)而重鏈肌球蛋白、副肌球蛋白等蛋白質(zhì)的含量增大，條帶逐漸變粗，肌鈣蛋白含量減小，條帶變淺、消失[20]。結(jié)果表明：超高壓處理可以改變藍(lán)蛤蛋白三、四級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)氫鍵、二硫鍵、疏水作用和靜電作用發(fā)生變化，二聚酪氨酸聚集，從而蛋白質(zhì)發(fā)生聚集、交聯(lián)或解離。

M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

2.9 不同超高壓處理對(duì)藍(lán)蛤蛋白紫外光譜的影響

為了解不同壓力處理后藍(lán)蛤蛋白相關(guān)基團(tuán)的空間位置變化和推測(cè)分子的構(gòu)象變化，本研究進(jìn)行了紫外光譜測(cè)定，如圖5。結(jié)果表明：不同壓力處理后，藍(lán)蛤蛋白在200～340 nm，經(jīng)過150～250 MPa處理后的蛋白質(zhì)吸收峰減??；在300 MPa處理后，吸收峰增加。該現(xiàn)象發(fā)生的原因可能是當(dāng)壓力超過250 MPa時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，暴露在分子內(nèi)的基團(tuán)和區(qū)域增加，發(fā)色基團(tuán)暴露，所以紫外吸收峰增強(qiáng)[32-34]。此外，蛋白質(zhì)的最大吸收峰出現(xiàn)藍(lán)移。這些變化表明：超高壓處理后，蛋白質(zhì)的微環(huán)境和結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)向負(fù)向移動(dòng)或變性，使蛋白質(zhì)的吸收低于對(duì)照組。其次，與對(duì)照組相比，在超高壓處理期間，由于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)變化，使其在250～280 nm處幾乎沒有出峰。

圖5 不同壓力處理對(duì)藍(lán)蛤蛋白紫外吸收光譜的影響

2.10 不同超高壓處理對(duì)藍(lán)蛤內(nèi)源熒光的影響

芳香族氨基酸鏈在特定的激發(fā)光下發(fā)出熒光，是一種內(nèi)部熒光物質(zhì)，對(duì)過渡過程中的微環(huán)境極敏感，如圖6。圖6中色氨酸的特征吸收峰位于298 nm左右。結(jié)果表明：隨著壓力的增加，色氨酸的吸收波長呈上升的趨勢(shì)，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，在150～200 MPa時(shí)上升緩慢，250～300 MPa時(shí)上升迅速。內(nèi)源熒光結(jié)果證明：超高壓處理后，色氨酸殘基被疏水環(huán)境包圍，引起色氨酸暴露，使藍(lán)蛤蛋白表面色氨酸的數(shù)量增加。研究表明：超高壓導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同的構(gòu)象變化，增加了疏水微環(huán)境中色氨酸的殘留量。同時(shí)，超高壓可以改變蛋白質(zhì)分子空間排列，破壞疏水蛋白分子間的相互作用，導(dǎo)致疏水基團(tuán)暴露[34]，進(jìn)而促進(jìn)了蛋白質(zhì)的水解。

圖6 不同壓力處理對(duì)藍(lán)蛤蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響

2.11 不同超高壓處理對(duì)藍(lán)蛤蛋白紅外光譜的影響

1.常壓；2.150 MPa；3.200 MPa；4.250 MPa；5.300 MPa。

2.12 掃描電鏡結(jié)果分析

圖8表示不同壓力處理后藍(lán)蛤蛋白的掃描電鏡結(jié)果。由圖8可知，經(jīng)過不同壓力處理后蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)存在顯著差異。不經(jīng)超高壓處理的蛋白質(zhì)表面結(jié)構(gòu)致密，顆粒按大小分布，緊密連接，且大顆粒數(shù)量少，粒徑偏小。施加一定壓力后，蛋白質(zhì)表面小顆粒結(jié)構(gòu)消失，大顆粒結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，蛋白質(zhì)顆粒出現(xiàn)粘連，孔洞消失，裂紋出現(xiàn)，說明超高壓處理改變了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集、交聯(lián)、解離，這與SDS-PAGE和紅外光譜結(jié)果一致。

圖8 不同壓力處理藍(lán)蛤蛋白掃描電鏡照片

3 結(jié) 論

酶活研究發(fā)現(xiàn)：壓力150～250 MPa對(duì)風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶有激活作用，而300 MPa時(shí)則表現(xiàn)為抑制作用。通過對(duì)藍(lán)蛤酶解液滋味、氣味成分分析發(fā)現(xiàn)：超高壓酶解可提高藍(lán)蛤酶解液的鮮味，降低苦腥味，改變揮發(fā)性物質(zhì)的組成，從而達(dá)到增香的作用。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)：超高壓能破壞藍(lán)蛤蛋白質(zhì)三、四級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)變化。因此推測(cè)，超高壓處理可能是通過提高蛋白酶活性，破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，增加了蛋白質(zhì)水解度，促進(jìn)了呈味氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸等的釋放，改善了酶解液的風(fēng)味。