劉琪，毛敏敏，阮永明

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321000)

大蠟螟是蜂群的主要害蟲之一，是一種極具破壞性的昆蟲，會攻擊和破壞蜂巢。其幼蟲不僅取食蜂蠟，還會在蜂巢內(nèi)留下大量隧道，這給養(yǎng)蜂業(yè)造成嚴重傷害[1]。由于蜜蜂對糧食生產(chǎn)有巨大貢獻，大蠟螟對其造成的傷害已給全球糧食和營養(yǎng)安全構(gòu)成威脅，已引起廣泛關(guān)注與擔憂[2-3]。而作為一種低毒、易降解、具有選擇性等多種優(yōu)勢的天然殺蟲劑，植物精油受到廣泛關(guān)注[4]。

植物精油是一類廣泛存在于植物體內(nèi)、易于揮發(fā)、具有芳香氣味的油狀液體的總稱，有的種類具有殺蟲滅菌的效果。但由于植物精油易于揮發(fā)，且對溫度、光照及空氣的影響極為敏感，極易分解變質(zhì)[5]，致使其殺蟲效果不穩(wěn)定，利用率降低，經(jīng)濟投入較高，極大影響了植物精油殺蟲劑的田間推廣應(yīng)用，納米精油殺蟲劑的出現(xiàn)可改善這種狀況。

微米乳液也被稱為納米乳液或細乳液，納米乳劑是微細的水包油分散體，其液滴尺寸為10～200 nm[6]。乳化液是一個熱力學(xué)不穩(wěn)定的兩相體系，由至少2種不相溶的液體和乳化劑組成，其中一種液體以小液滴的形式分散在另一種液體中[7]。納米乳是亞穩(wěn)態(tài)體系，其穩(wěn)定性取決于合成或制備的方法[8]，制備方法有高能乳化和低能乳化2種。

研究表明，精油是通過吸入、攝入或皮膚吸收進入昆蟲體內(nèi)的，精油可能會干擾昆蟲的生理和神經(jīng)系統(tǒng)[9-10]。乙酰膽堿酯酶(AchE)、羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶，其活性會因為外源物質(zhì)的侵入而發(fā)生變化(抑制或增強)，是反映該外源物對害蟲控制效果的指標之一[11-13]。

本文選擇更為穩(wěn)定的精油納米配方，對比納米乳液和粗乳液生物活性的強弱，測定納米乳劑對AchE、CarE和GST活力的影響，探討其作用模式。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試昆蟲

供試大蠟螟取自浙江省金華市農(nóng)科院蜜蜂所。在人工氣候箱(RXZ智能型，寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司)內(nèi)培養(yǎng)，在(30±1)℃溫度、相對濕度50%～60%的全暗條件下進行室內(nèi)人工飼養(yǎng)，取3齡大蠟螟幼蟲進行試驗。

1.1.2 供試試劑

α-松油烯(純度99%)、γ-松油烯(純度99%)、異松油烯(純度99%)、松油烯-4-醇(純度99%)、1,8-桉葉素(純度99%)均購自云南森美達生物科技有限公司；吐溫80(純度100%)購自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒、AchE活性檢測試劑盒、CarE活性檢測試劑盒、GST活性檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 納米乳液制備

水包油精油納米乳液由混配精油(α-松油烯、γ-松油烯、異松油烯、松油烯-4-醇、1,8-桉葉素體積比為25∶45.5∶20∶5∶4.5)、表面活性劑吐溫80和水組成。首先，將混配精油與表面活性劑吐溫80以體積比為1∶1(F1)、1∶2(F2)、1∶3(F3)混合，加入水得到3種配方，使用混勻儀混勻得到粗乳液；使用高速攪拌器以1 000 rmp速度持續(xù)攪拌60 min，以確保精油粒子以納米乳的形式穩(wěn)定而精細地分散在乳液中。

1.2.2 乳液液滴測量

用納米粒度Zeta電位分析儀測定精油納米乳液配方、精油粗乳液的液滴粒徑大小及多分散性指數(shù)(PDI)。PDI是納米乳液體系中液滴粒徑均勻性和穩(wěn)定性的量度。PDI<0.3表明納米乳液的粒徑分布較窄，可為所制備的納米乳液提供長期穩(wěn)定性。

1.2.3 精油納米乳液和精油粗乳液觸殺活性

選擇穩(wěn)定性強的配方作為觸殺活性測量藥劑，采用不同處理劑量的精油納米乳液和精油粗乳液進行觸殺處理，每組20頭，重復(fù)3次。以純水為對照組，24 h后統(tǒng)計死亡率，求毒力回歸方程。

1.2.4 酶活性測量

設(shè)5個混配精油濃度，T1～T5分別為12.89、25.77、51.54、103.08、206.16 μg·larva-1，對大蠟螟幼蟲進行觸殺處理，CK為空白對照組，24 h后測定其體內(nèi)AchE、CarE、GST的活性變化。酶活性按照樣本蛋白濃度計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 液滴大小

對3種配方進行混勻攪拌和高速攪拌，形成粗乳液和納米乳液，測定其液滴粒徑大小。在高速攪拌乳化過程中，通過能量輸入來增強納米乳液的穩(wěn)定性，吐溫80的濃度在其中發(fā)揮了重要作用。由表1可知，3種配方經(jīng)過普通混勻和高速攪拌后，高速攪拌的納米乳液外觀比粗乳液更為均勻澄澈。熱力學(xué)穩(wěn)定循環(huán)后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)3納米乳液沒有分離階段，盡管如此，最好還是選擇新配制的納米乳液備用；F3由于其液滴最小且粒徑分布均勻而被選擇進一步應(yīng)用研究。

表1 攪拌方式對粒徑大小的影響

2.2 F3納米乳液與粗乳液觸殺活性

由表2可知，F(xiàn)3的納米乳液和粗乳液對大蠟螟均有一定觸殺作用，對大蠟螟觸殺毒力的半數(shù)致死劑量(LD50)分別為28.991、514.056 μg·larva-1，說明精油納米乳液的觸殺活性極顯著強于精油粗乳液，可見精油納米乳液具有進一步開發(fā)為殺蟲劑的潛能。

表2 不同乳液對大蠟螟幼蟲觸殺毒力

2.3 AchE活性測定

由圖1可知，受精油納米乳液的影響，大蠟螟體內(nèi)AchE活力被抑制，且隨著精油納米乳液處理劑量的增加，抑制作用整體呈增加趨勢；T2處理的大蠟螟體內(nèi)AchE活力回升，且與其相鄰處理濃度對比差異顯著，表明大蠟螟體內(nèi)AchE活力在受到精油納米乳液脅迫后，表現(xiàn)為先被抑制后被激活的特性。T3～T5處理的大蠟螟體內(nèi)AchE活力顯著低于對照組，且組間差異顯著。在206.16 μg·larva-1最大處理劑量下，精油納米乳液對大蠟螟體內(nèi)AchE酶活力的抑制率最高，達48.81%。

柱間無相同小寫字母表示組間差異顯著(圖2～3同)。

2.4 CarE活性測定

由圖2可知，受到精油納米乳液的影響，大蠟螟體內(nèi)CarE活力被抑制，隨著精油納米乳液處理劑量的增加，抑制作用整體呈增加趨勢。T1處理的大蠟螟體內(nèi)CarE活力呈激活狀態(tài)；T2處理有所下降，與其相鄰組對比差異顯著，表明大蠟螟體內(nèi)CarE活力受到精油納米乳液的脅迫，表現(xiàn)為先被激活后被抑制。之后隨著處理劑量的增加，大蠟螟體內(nèi)CarE活力逐步降低，且顯著低于對照組。在206.16 μg·larva-1最大處理劑量下，精油納米乳液對大蠟螟體內(nèi)CarE活力的抑制率達41.92%。

圖2 不同劑量精油納米乳液處理對大蠟螟體內(nèi)CarE活力的影響

2.5 GST活性測定

由圖3可知，隨著精油納米乳液處理劑量的增加，大蠟螟體內(nèi)GST活力有所變化。T1處理的大蠟螟體內(nèi)GST活力受到抑制；T2～T4處理的GST活力被激活；T5處理GST活力受到抑制，精油納米乳液對GST活力的抑制率為19.97%。由此可知，大蠟螟體內(nèi)GST活力隨著精油納米乳液劑量的增加，無明顯的變化規(guī)律。

圖3 不同劑量精油納米乳液處理對大蠟螟體內(nèi)GST活力的影響

3 討論

納米乳液不僅在動力學(xué)上穩(wěn)定，且物理性質(zhì)也穩(wěn)定，在較長一段時間內(nèi)都沒有明顯的絮凝或聚結(jié)[14]。本試驗表明，高速攪拌乳化形成的納米乳液液滴直徑小、分布均勻。在納米乳液的液滴大小中，表面活性劑在乳液中的濃度也發(fā)揮了重要作用，納米乳液粒徑的大小隨著乳液中吐溫80濃度的增加而減小。在納米乳液形成過程中，吉布斯自由能大于零，這是熱力學(xué)不穩(wěn)定的系統(tǒng)，表面活性劑作為乳化劑，通過降低納米乳液制備所需的自由能量，降低油/水界面的張力，因此，可通過調(diào)節(jié)乳液中表面活性劑的濃度來得到更為穩(wěn)定的納米乳液[15]。

本文中測得的納米乳液和粗乳液對大蠟螟的LD50分別為28.991、514.056 μg·larva-1，可見殺死同樣數(shù)量的大蠟螟，納米乳液的精油濃度更低。由此表明，納米乳液可顯著降低所需的精油濃度，并且揮發(fā)精油的接觸毒性和持久性更高。

精油納米乳液對大蠟螟體內(nèi)乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶活力具有顯著的抑制作用，隨著處理劑量的增加，抑制作用整體呈現(xiàn)增加的趨勢。在最大處理劑量206.16 μg·larva-1下，精油納米乳液對大蠟螟體內(nèi)AchE、CarE活力的抑制率分別為48.81%、41.92%，相比對照差異顯著；而GST活力與劑量的增加無明顯的變化規(guī)律，且組間差異不顯著。所以推測AchE、CarE是精油納米乳液的作用靶標，對GST活性的影響不是引起中毒的原因。因昆蟲體內(nèi)對外源物質(zhì)反應(yīng)機制復(fù)雜多樣，所以精油納米乳液對害蟲的作用機制還需進一步探究。