張文興 岳曉嵐 鄧強(qiáng) 陳文祥 張周位 黃苑齡 譚微 何海

摘要：抗性微生物對(duì)重金屬的溶解、絡(luò)合等作用，提高了重金屬在土壤中的生物可利用性，從而增強(qiáng)植物對(duì)重金屬的吸收富集；其次，抗性微生物分泌的植物激素可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)、擴(kuò)大生物量，進(jìn)一步提高重金屬污染土壤植物修復(fù)的效率。為此，對(duì)抗性微生物在強(qiáng)化重金屬污染土壤中植物修復(fù)的作用機(jī)制和實(shí)際應(yīng)用方面進(jìn)行了綜述，并分析目前存在的不足及今后的研究方向，以期為發(fā)展和提高抗性微生物強(qiáng)化植物修復(fù)措施提供理論基礎(chǔ)和修復(fù)新途徑。

關(guān)鍵詞：抗性微生物；土壤重金屬污染；生物可利用性；促生；植物修復(fù)

中圖分類號(hào)：X53文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A論文編號(hào)：cjas2020-0104

Enhancing Phytoremediation of Heavy Metal Contaminated Soil by Resistant Microorganisms： Research Progress

Zhang Wenxing1，2， Yue Xiaolan1， Deng Qiang1，2， Chen Wenxiang1， Zhang Zhouwei1，2， Huang Yuanling1，2， Tan Wei1， He Hai1

（1Guizhou General Laboratory of Geology and Mineral Resources， Guiyang 550018， Guizhou， China； 2Guizhou Engineering Research Center for Comprehensive Utilization of Precious Metals Mineral Resources， Guiyang 550018， Guizhou， China）

Abstract： The dissolution and complexation of heavy metals by resistant microorganisms can improve the bioavailability of heavy metals in soil， thus enhancing the absorption and enrichment of heavy metals by plants. In addition， plant hormones secreted by resistant microorganisms can promote plant growth， expand biomass， and further improve the efficiency of phytoremediation in heavy metal contaminated soil. Therefore， the mechanism and practical application of resistant microorganisms in strengthening phytoremediation in heavy metal contaminated soil were reviewed， and the shortcomings and future research directions were analyzed to provide a theoretical basis and a new way to develop and improve the phytoremediation measures of resistant microorganisms.

Keywords： Resistant Microorganisms； Heavy Metal Contaminated Soils； Bioavailability； Plant Growth Promoting； Phytoremediation

0引言

重金屬在土壤中不易被化學(xué)或生物降解、遷移轉(zhuǎn)化能力弱且溶解度低，絕大多數(shù)以沉淀態(tài)形式存在，因此重金屬污染土壤是一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的過程，容易通過食物鏈在動(dòng)植物和人體內(nèi)不斷積累，對(duì)人體的生命健康構(gòu)成巨大的威脅[1-3]。由于農(nóng)田污水灌溉、化肥與農(nóng)藥大量施用、礦山開采與金屬冶煉等人類活動(dòng)，使重金屬及其化合物排放到環(huán)境中造成嚴(yán)重的全球性土壤重金屬污染。因此，重金屬污染土壤的修復(fù)工作成為了當(dāng)前各國(guó)重點(diǎn)關(guān)注的研究?jī)?nèi)容。

早期的物理和化學(xué)修復(fù)方法（諸如客土法、添加化學(xué)固化劑等）因成本費(fèi)用過高、對(duì)大面積的污染土壤修復(fù)效果差還會(huì)導(dǎo)致二次污染已被新型修復(fù)技術(shù)取代。植物修復(fù)技術(shù)[4-6]因其成本低、對(duì)環(huán)境友好、原位修復(fù)等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞[7-8]。然而，隨著研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)用于重金屬污染土壤修復(fù)的植物通常因植物矮小、生物量低、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等不足，更重要的是超積累植物對(duì)固定態(tài)和沉淀態(tài)的重金屬（如鉛）無法吸收等缺點(diǎn)，限制了超積累植物在實(shí)際生產(chǎn)中的大面積應(yīng)用[9-15]。為了增強(qiáng)植物對(duì)土壤中重金屬的吸收富集效能，研究者在重金屬污染的土壤中添加天然或人工合成的螯合劑、化學(xué)合成表面活性劑[16-19]等化學(xué)物質(zhì)以增強(qiáng)土壤中有效態(tài)重金屬的含量，進(jìn)而提高土壤中重金屬的生物可利用性，遺憾的是修復(fù)成本較高，對(duì)環(huán)境可能會(huì)造成二次污染。人們發(fā)現(xiàn)，被重金屬污染的土壤中的微生物，由于長(zhǎng)期受到重金屬的脅迫而對(duì)重金屬產(chǎn)生一定的抗性[20-24]，而抗性微生物對(duì)重金屬的溶解作用在土壤污染修復(fù)中有多種用途：一方面抗性微生物憑借自身的代謝活動(dòng)和代謝產(chǎn)物能夠促進(jìn)沉淀態(tài)重金屬的溶解、絡(luò)合，提高了沉淀態(tài)重金屬在土壤中的生物可利用性，從而增強(qiáng)植物尤其是超積累植物對(duì)重金屬的吸收、富集；另一方面抗性微生物分泌的多種植物激素能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)、擴(kuò)大其生物量、進(jìn)一步提高重金屬污染土壤植物修復(fù)的效率[25-26]。為此，對(duì)抗性微生物在強(qiáng)化重金屬污染土壤中植物修復(fù)的作用機(jī)制和實(shí)際應(yīng)用方面進(jìn)行了綜述，并分析目前存在的不足及今后的研究方向，以期為發(fā)展和提高抗性微生物強(qiáng)化植物修復(fù)措施提供理論基礎(chǔ)和修復(fù)新途徑。

1抗性微生物的分離篩選和鑒定

抗性微生物普遍存在于重金屬污染土壤、植物根際土壤和植物根莖葉等組織中，其分離和篩選通常采用稀釋培養(yǎng)法和純培養(yǎng)法[27-29]，進(jìn)一步通過選擇性培養(yǎng)基（例如抗鎘培養(yǎng)基、抗鉛培養(yǎng)基、產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基等）分離篩選法獲得具有重金屬抗性和植物促生特性的專屬菌株。

經(jīng)分離篩選過的抗性細(xì)菌需要進(jìn)行鑒定，傳統(tǒng)鑒定法[30]常用革蘭氏染色法和芽孢染色法觀察細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)，再配合葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)、產(chǎn)吲哚試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)來鑒定細(xì)菌到屬；另外一種廣泛使用的鑒定法是微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定[31-32]，通過對(duì)菌體總的DNA進(jìn)行提取，利用細(xì)菌16Sr DNA通用引物對(duì)供試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得的擴(kuò)增序列與Gen Bank DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast分析，利用多序列比對(duì)軟件進(jìn)行比對(duì)，在通過分子進(jìn)化遺傳學(xué)軟件生成系統(tǒng)發(fā)育樹，與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的16Sr DNA序列進(jìn)行相似性比較分析，可快速而準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

任廣明等[33]通過傳統(tǒng)微生物分離篩選方法從鉛鋅礦區(qū)重金屬污染土壤中分離出1株具有鉛抗性的細(xì)菌PZ-1，經(jīng)形態(tài)、生理生化以及16Sr DNA序列分析，鑒定PZ-1為芽孢桿菌屬的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。

王亮[28]從蜈蚣草的根部組織中分離出兩株內(nèi)生細(xì)菌PRE01和PRE05，通過16Sr DNA測(cè)序分析，PRE01被鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens），具有高釩抗性；PRE05被鑒定為節(jié)桿菌屬細(xì)菌（Arthrobacter ginsengisoli），多被開發(fā)為植物促生菌。

何琳燕等[34]從重金屬Cd污染嚴(yán)重的鉛鋅銀礦區(qū)中找到了龍葵植物（超積累植物），并從龍葵植物根際土壤中，通過選擇性培養(yǎng)基的分離篩選得到兩株鎘抗性細(xì)菌，經(jīng)16Sr DNA序列比對(duì)分析，該2株抗性細(xì)菌均分屬于革蘭氏陽(yáng)性的芽孢桿菌屬。

2抗性微生物強(qiáng)化重金屬污染土壤植物修復(fù)機(jī)理

抗性微生物強(qiáng)化植物修復(fù)重金屬污染土壤主要有2種形式，一是通過自身代謝產(chǎn)物活化沉淀態(tài)重金屬，增強(qiáng)植物對(duì)有效態(tài)重金屬的吸收富集量，增加植物體內(nèi)重金屬的濃度，減少土壤中重金屬含量；二是提高植物對(duì)重金屬的耐受性和植物自身的生物量，進(jìn)一步促進(jìn)植物吸收有效態(tài)重金屬，從而達(dá)到強(qiáng)化植物修復(fù)的目的。

2.1抗性微生物促進(jìn)植物富集重金屬機(jī)制

抗性微生物通過絡(luò)合、氧化還原等多種方式改變重金屬的狀態(tài)，降低重金屬的毒害作用，提高植物對(duì)重金屬的有效吸收。王連生[35]和錢曉莉等[36]研究表明，假單胞菌屬細(xì)菌可將鈷胺素轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆挵匪?，甲基鈷胺素可作為甲基的供體，在三磷酸腺苷（ATP）和特定還原劑共同存在的條件下，重金屬離子（Pb、Cd等）與甲基絡(luò)合形成甲基鉛、甲基鎘等易于被植物吸收的絡(luò)合物，例如甲基鈷胺素在酶促影響下將汞絡(luò)合形成易被植物吸收的甲基汞，CH3-Co-R+Hg→CH3Hg++H2OCo-R。

Wan等[37]研究表明，植物在重金屬脅迫下會(huì)產(chǎn)生諸如過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子自由基（O2-）等活性氧（ROS），會(huì)以氧化作用損壞植物根系細(xì)胞。由于植物根系細(xì)胞合成的氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)與活性氧接觸發(fā)生氧化反應(yīng)，將導(dǎo)致永久性的新陳代謝紊亂，但是接種抗氧化酶活性內(nèi)生菌的植物，能在重金屬的氧化脅迫下具有很高的耐受能力，植物生長(zhǎng)旺盛，表明抗氧化酶活性內(nèi)生菌能分解活性氧，降低重金屬對(duì)植物的毒害，同時(shí)，植物的旺盛生長(zhǎng)可提高對(duì)重金屬的富集。

此外，植物修復(fù)重金屬污染土壤的關(guān)鍵，很大程度上依賴于重金屬的生物可利用性，即有效態(tài)重金屬濃度，而抗性微生物通過代謝活動(dòng)可分泌甲酸和乙酸等多種可溶解土壤中重金屬的有機(jī)酸，還可形成金屬螯合物和生物表面活性劑等多種代謝產(chǎn)物可活化植物根際土壤中的沉淀態(tài)重金屬，擴(kuò)大植物對(duì)有效態(tài)重金屬的吸收富集量，進(jìn)一步強(qiáng)化植物修復(fù)重金屬污染土壤的效能。鄧平香等[38]研究發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌在生長(zhǎng)代謝過程中能夠產(chǎn)生多種低分子量有機(jī)酸，包括蘋果酸、檸檬酸、草酸、乙酸等，該有機(jī)酸可將沉淀態(tài)ZnO、CdO活化，易被植物吸收富集，例如，在Cd超積累植物-東南景天的根系土壤中接種熒光假單胞菌，其地上部生物量增加較大，Cd積累量增加明顯，顯著提高了植物修復(fù)的效率。

2.2抗性微生物促進(jìn)植物生長(zhǎng)機(jī)制

在長(zhǎng)期遭受重金屬污染的土壤中，抗性微生物可幫助植物獲取必需的諸如氮、磷、鐵等營(yíng)養(yǎng)成分，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，同時(shí)，植物根際環(huán)境也為抗性微生物提供多種氨基酸、糖類、有機(jī)酸等適于微生物生長(zhǎng)、繁殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

Montanez等[39]研究表明，在植物細(xì)胞組織內(nèi)有多種可產(chǎn)生固氮酶的抗性內(nèi)生菌，幫助植物形成高效固定空氣和土壤中氮素營(yíng)養(yǎng)成分的體系，充分展現(xiàn)固氮效應(yīng)。Cocking等[40]研究發(fā)現(xiàn)，在缺乏氮素環(huán)境中，擁有固氮能力的抗性內(nèi)生細(xì)菌生存、繁殖能力較強(qiáng)，對(duì)植物的促生作用發(fā)揮更大的優(yōu)勢(shì)，如果是在長(zhǎng)期缺少氮素的環(huán)境中，接種能自生固氮的抗性內(nèi)生細(xì)菌于植物根際，在一定程度上能夠提高植物對(duì)氮素的積累，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。磷、鐵等是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中不可或缺的必需元素，雖然磷在土壤中總含量比較高，但供植物吸收的有效磷含量比較低，阻礙了植物的生長(zhǎng)；此外，鐵在土壤中主要以氧化物、氫氧化物、碳酸鹽和磷酸鹽等沉淀態(tài)三價(jià)鐵的形式存在，不利于植物吸收，抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育。Nautiyal等[41]研宄表明，將抗性內(nèi)生細(xì)菌接種到根際土壤，大部分抗性內(nèi)生細(xì)菌通過絡(luò)合、離子交換和分泌有機(jī)酸等方式，溶解植物根際中大量的礦質(zhì)磷，提升磷的生物有效性，促使植物對(duì)磷的吸收。Ma等[42]研究發(fā)現(xiàn)，抗性內(nèi)生細(xì)菌能夠分泌親和性很高的鐵載體，通過絡(luò)合三價(jià)鐵保證鐵的有效供應(yīng)。特別地，當(dāng)重金屬在植物細(xì)胞組織內(nèi)過量積累時(shí)，便會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)過程產(chǎn)生致命的打擊，并阻礙微量鐵元素的攝取，在此條件下，將植物根際接種產(chǎn)生鐵載體的抗性微生物能夠絡(luò)合Fe3+，并促使該絡(luò)合物被植物根系吸收，有利于植物生長(zhǎng)。

抗性微生物還可產(chǎn)生生長(zhǎng)素（IAA）、細(xì)胞分裂素等植物激素，將其接種于植物本身，可促使種子萌發(fā)，增大植物生物量。Ma等[43]對(duì)分離篩選出的抗性內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，該細(xì)菌產(chǎn)生長(zhǎng)素（IAA）濃度顯著，高達(dá)69.4 mg/L，可直接促使細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖和細(xì)胞分離來增進(jìn)植物生長(zhǎng)。此外，植物在重金屬脅迫下會(huì)產(chǎn)生不利于植物生長(zhǎng)的乙烯，而一部分抗性內(nèi)生細(xì)菌通過產(chǎn)生ACC脫氨酶將乙烯合成前體ACC，在將前體ACC分解成氨和α-丁酮酸，并運(yùn)用分解得到的氨為氮源，從而促使根系的伸長(zhǎng)和植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物的抗逆性和耐受能力，同時(shí)降低乙烯的合成。Zhang等[44]研究表明，分離篩選出具有ACC脫氨酶活性的抗性內(nèi)生細(xì)菌，能夠降低植物因重金屬脅迫產(chǎn)生的乙烯濃度，有利于油菜生長(zhǎng)。Alvin等[45]研究發(fā)現(xiàn)，抗性微生物通過代謝活動(dòng)產(chǎn)生抗生素等代謝產(chǎn)物，阻礙其他病原微生物的生長(zhǎng)繁殖，加強(qiáng)宿主植物阻擋病害的能力，確保植物的生理健康，從而促使植物生長(zhǎng)旺盛。

3抗性微生物強(qiáng)化植物修復(fù)土壤的應(yīng)用

王旭梅等[46]通過實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)，從Pb污染的土壤中篩選出2株產(chǎn)酸能力強(qiáng)、對(duì)鉛有較強(qiáng)抗性的細(xì)菌，并對(duì)細(xì)菌活化沉淀態(tài)鉛（PbCO3）的環(huán)境因子進(jìn)行分析研究，結(jié)果表明，2株抗性細(xì)菌對(duì)沉淀態(tài)鉛（PbCO3）都有很強(qiáng)的活化效能。葉和松[47]從污染土壤中篩選出對(duì)重金屬鉛鎘和抗生素具有抗性，且能產(chǎn)生物表面活性劑的菌株，該菌株能活化土壤中沉淀態(tài)鉛鎘（PbCO3、CdCO3），使土壤中可交換態(tài)鉛鎘濃度增加。通過盆栽試驗(yàn)、水培試驗(yàn)表明，接該菌處理的植物地上部和根部中鎘或鉛濃度增加。

盛下放等[48]從重金屬污染的土壤中分離篩選出兩株能產(chǎn)生生長(zhǎng)素的Cd抗性微生物，該抗性微生物可以溶解不被植物吸收的沉淀態(tài)鎘，并促使油菜的生長(zhǎng)和對(duì)有效態(tài)Cd的吸收富集。DELL’AMICO等[49]研究發(fā)現(xiàn)，Cd抗性微生物也可以增進(jìn)油菜的生長(zhǎng)，提升油菜對(duì)土壤中有效態(tài)Cd的吸收能力。王亮[28]研究表明，從植物細(xì)胞組織中可以分離篩選出多種能產(chǎn)生生長(zhǎng)激素和細(xì)胞分裂素等植物激素的植物內(nèi)生細(xì)菌，包括假單胞菌、金黃色葡萄球菌、固氮螺菌和固氮菌等，這些植物激素與赤霉素一起誘發(fā)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。例如，接種固氮螺菌的植物根尖具有較大的細(xì)胞膜活力，而且吲哚乙酸和吲哚-3丁酸濃度值較高，同時(shí)加強(qiáng)了三羧酸循環(huán)和糖酵解能力，增進(jìn)植物根系生長(zhǎng)。此外，接種熒光假單胞菌的植物根際對(duì)鉛具有抗性能力，并排泄吲哚乙酸到植物體內(nèi)，通過調(diào)節(jié)植物內(nèi)分泌平衡來促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

施積炎等[50]研究發(fā)現(xiàn)，根際土壤微生物通過自身代謝活動(dòng)產(chǎn)生鐵載體、有機(jī)酸和生物表面活性劑等代謝產(chǎn)物與重金屬絡(luò)合，將降低重金屬對(duì)植物的毒害作用，同時(shí)加強(qiáng)植物對(duì)有效態(tài)重金屬的吸收富集，進(jìn)而增進(jìn)植物的生長(zhǎng)。KASHEFI K等[51]研究表明，根際土壤細(xì)菌通過離子交換、絡(luò)合、配位、氧化還原等作用，改變重金屬的價(jià)態(tài)和存在形態(tài)，提高抗性微生物的適應(yīng)性，有利于植物吸收有效態(tài)重金屬。

綜上，抗性微生物強(qiáng)化植物修復(fù)重金屬污染土壤主要表現(xiàn)為，抗性微生物通過自身的代謝活動(dòng)產(chǎn)生有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物，活化或溶解沉淀態(tài)重金屬，促使植物對(duì)有效態(tài)重金屬的吸收，從而達(dá)到修復(fù)土壤的目的；另一方面，抗性微生物通過產(chǎn)生生長(zhǎng)素等植物激素，增進(jìn)植物根系生長(zhǎng)，促使植物生物量加大，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物對(duì)重金屬的吸收，達(dá)到強(qiáng)化植物修復(fù)土壤的目的。

4展望

抗性微生物對(duì)重金屬的溶解、絡(luò)合等作用，提高了重金屬在土壤中的生物可利用性，增進(jìn)植物對(duì)重金屬的吸收富集；其次，抗性微生物產(chǎn)生的植物激素，能促使植物生長(zhǎng)、擴(kuò)大其生物量、進(jìn)一步提高重金屬污染土壤植物修復(fù)的效率。然而，抗性微生物能否適應(yīng)多變的環(huán)境，例如土壤pH、鹽濃度、溫度等的變化，使土壤中重金屬由沉淀態(tài)轉(zhuǎn)化為離子態(tài)，重金屬濃度增加，影響抗性微生物的存活性；此外，目前的研究主要建立在單一重金屬污染的基礎(chǔ)上，而實(shí)際的重金屬污染土壤往往是多種類重金屬、復(fù)合污染的特點(diǎn)，在植物根際接種一種抗性微生物并不能達(dá)到理想化的修復(fù)效果，需要進(jìn)一步綜合研究；再者，抗性微生物能否市場(chǎng)化，對(duì)于多變的環(huán)境、多種重金屬污染，仍具有穩(wěn)定的、廣泛的、存活率高的抗性和促生功能，有待從實(shí)驗(yàn)室到投入農(nóng)業(yè)應(yīng)用進(jìn)行深入研究。

根據(jù)存在的不足，可以明確今后的研究重點(diǎn)和方向：首先，在實(shí)驗(yàn)室階段可以做環(huán)境條件試驗(yàn)，針對(duì)土壤pH、鹽濃度、溫度等的環(huán)境變化，將抗性微生物篩選與理化修復(fù)相結(jié)合，比如添加化學(xué)固定劑調(diào)節(jié)pH，以篩選出適應(yīng)性較強(qiáng)的抗性微生物；其次，在多種重金屬污染土壤中，接種多種抗性微生物于超積累植物和具有抗性的植物中，研究多種抗性微生物的共存效果，以及修復(fù)效能的最大化；最后，從超積累植物組織、根際土壤、污染土壤中篩選出具有穩(wěn)定的、廣泛的、存活率高的抗性和促生功能的抗性微生物，使之具有市場(chǎng)化，為高效修復(fù)重金屬污染土壤提供材料。

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