朱利芹 馮瑩 曹惠芳 杜楠

(1.上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200040；2.淮安市第一人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇 淮安 223300)

結(jié)直腸癌屬于臨床常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤，早期臨床表現(xiàn)不典型，伴隨腫瘤組織不斷增大而出現(xiàn)排便習(xí)慣改變、腹瀉、便血、便秘等臨床癥狀，在疾病晚期病患可出現(xiàn)貧血以及體質(zhì)量下降等全身性臨床癥狀，對(duì)病患生命安全產(chǎn)生嚴(yán)重威脅[1]。有報(bào)道[2]指出，miRNA異常表達(dá)在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中具有重要意義，其中miRNA具備抑癌基因或者癌基因的能力，受到臨床重點(diǎn)關(guān)注。MicroRNA(miRNAs微小PaqA)是一種單鏈非編碼RNA分子，廣泛存在于人類(lèi)、動(dòng)物、植物的細(xì)胞中，其長(zhǎng)度約19～24 nt，通過(guò)與靶基因序列特異性相互作用在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)，作為一類(lèi)新型基因調(diào)節(jié)劑與結(jié)直腸癌的關(guān)系相當(dāng)密切[3]。X射線修復(fù)交叉補(bǔ)充因子6(XRCC6)抑制吉西他濱誘導(dǎo)的DNA損傷和多種癌細(xì)胞凋亡，參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)和重組[4]。MiR-1207-3p通過(guò)纖維連接蛋白調(diào)節(jié)前列腺癌中的雄激素受體，但miR-1207-3p在結(jié)直腸癌中的作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討miR-1207-3p靶向XRCC6對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29凋亡的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料 上?？道噬锟萍加邢薰咎峁┑膍iRNA cDNA第一鏈合成試劑盒；哈爾濱?；锟萍加邢薰咎峁┑膍iR-1207-3p SYBRGreen miRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒；生工生物工程(上海)股份有限公司提供的miR-1207-3p mimics和miR-1207-3p inhibitor；齊一生物科技(上海)有限公司提供的Luciferase熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒；漢恒生物科技(上海)有限公司提供的LipoFiter3轉(zhuǎn)染試劑；Sigma公司提供的蛋白裂解液；北京索萊寶科技有限公司提供的青鏈霉素混合液；北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供的2×SDS蛋白電泳上樣緩沖液；美國(guó)Bimake公司提供的蛋白酶抑制劑Cocktail；美國(guó)Hyclone公司提供的RPMI-1640培養(yǎng)基；英國(guó)Abcam公司提供的XRCC6，Cleaved-Casp3，Cleaved-Casp9，TUBULIN抗體；美國(guó)Gbico公司提供的胎牛血清；中科院上海生命科研所提供的HT-29細(xì)胞；生工生物工程(上海)股份有限公司提供的PBS。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29維持在含有100 μg/mL鏈霉素、10%熱滅活的胎牛血清以及100 U/mL青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為潮濕37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29進(jìn)行LipoFiter3轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染，將脂質(zhì)體與miR-1207-3p mimics或inhibitor相混合20 min后，滴入HT-29細(xì)胞。

1.2.2Western blot 進(jìn)行10%SDS-PAGE的電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，隨后將PVDF膜進(jìn)行封閉1 h，封閉環(huán)境為0.01%Tween-20和5%脫脂奶粉的Tris緩沖鹽水。然后在4℃下與目的蛋白的抗體溫育過(guò)夜，使用ECL Plus Western印跡檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)特定蛋白質(zhì)進(jìn)行觀察，將PVDF膜在室溫下與綴合有HRP的相應(yīng)二抗孵育1 h。

1.2.3qRT-PCR 用細(xì)胞刮將結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29刮入EP管中，用PBS洗3次，對(duì)MCF7的miRNA進(jìn)行miRNA快速提取，將純化好的總miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用miR-1207-3p的正向和反向引物進(jìn)行qRT-PCR。MiR-1207-3p上游引物序列為5′-TCAGCTGGCCCTCATTTC-3′，內(nèi)參U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為5′-GAAATGAGGGCCAGCTGA-3′，內(nèi)參U6下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。1 μL 10×miScript通用引物溶液，1μL 10×miScript配對(duì)引物溶液，最后用9.5 μL DEPC水補(bǔ)足25 μL混合液。將7500Real-Time PCR儀(Biosystems)設(shè)置擴(kuò)增條件：95℃×10 min，然后將95℃×15 s、56℃×30 s，72℃×35 s過(guò)程進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最終將產(chǎn)物放置于-20℃保存。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.2.4Annexin V染色 將結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29置于37℃5%CO2和1%O2的缺氧室中靜置16～18 h，隨后在低氧或含氧量正常的條件下培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29 2 h，在指定的氧條件下用1 μm阿糖胞苷處理16～18 h，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，使用Annexin V-FITC-A進(jìn)行染色。

2 結(jié) 果

2.1MiR-1207-3p與XRCC6的相關(guān)性 采用TargetScan生物軟件分析后，發(fā)現(xiàn)miR-1207-3p處于16～22的位置與XRCC6的3′端非編碼區(qū)有1處高度匹配，見(jiàn)圖1。將 XRCC6的3′端非編碼區(qū)做 UC 非匹配突變，并選取一種野生型的XRCC6作為對(duì)照，通過(guò)luciferase assay，MT-XRCC6 3′UTR報(bào)告活性降低(t=14.730，P<0.001)。見(jiàn)圖2。

圖1 TargetScan生物軟件在線分析miR-1207-3p與XRCC6相關(guān)性

圖2 利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)miR-1207-3p靶向XRCC6基因

2.2過(guò)表達(dá)miR-1207-3p后XRCC6蛋白和HT-29細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白的表達(dá)量 為進(jìn)一步證實(shí)miR-1207-3p靶向XRCC6與HT-29細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，對(duì)miR-1207-3p的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染miR-1207-3p mimics進(jìn)HT-29細(xì)胞后，其相對(duì)表達(dá)量顯著增加(t=17.730，P<0.001)；XRCC6 的表達(dá)量采用Western Blot 檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白 Cleaved-Casp3、Cleaved-Casp9的表達(dá)量上升，XRCC6 的表達(dá)量下降，HT-29 細(xì)胞凋亡水平上升(t=34.180，P<0.001)。見(jiàn)圖3～圖5。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-1207-3p mimcs后miR-1207-3p的表達(dá)水平

圖4 過(guò)表達(dá)miR-1207-3p時(shí)XRCC6和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

圖5 過(guò)表達(dá) miR-1207-3p 時(shí) HT-29 細(xì)胞凋亡水平

3 討 論

結(jié)直腸癌作為臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，主要發(fā)生在患者腸黏膜上皮細(xì)胞，受到遺傳或者環(huán)境因素影響后產(chǎn)生惡性變化，不僅具有較高的患病率及復(fù)發(fā)率，同時(shí)癌細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較大，不僅對(duì)患者消化系統(tǒng)造成一定傷害，同時(shí)可能牽連患者肺臟、骨骼、淋巴與肝臟受損，直接危及生命安全[5]。

miRNA屬于微小RNA分子，可在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮多種調(diào)節(jié)作用。由于miRNA具有較高的特異性、保守性以及穩(wěn)定性等特點(diǎn)，因此在研究疾病發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后方面具有積極意義[6]。在人體內(nèi)，它通過(guò)與靶基因mRNA分子3′端非編碼區(qū)結(jié)合，抑制靶基因的翻譯，負(fù)調(diào)控靶基因的蛋白水平[7]。研究[8]表明它在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、血管形成、腫瘤發(fā)生等許多重要病理生理過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。在腫瘤方面，研究[9]發(fā)現(xiàn)miRNA與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移微環(huán)境形成、浸潤(rùn)甚至治療耐受等有密切關(guān)系。近年來(lái)，研究[10]表明miRNA與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，由于相關(guān)的靶基因?qū)δ[瘤的作用不同，不同miRNA在腫瘤中表達(dá)情況也存在差異，因而可以根據(jù)這種表達(dá)差異來(lái)判斷miRNA對(duì)腫瘤的調(diào)控作用。

本研究通過(guò)TargetScan分析，發(fā)現(xiàn)MiR-1207-3p由位于8q24易感基因位點(diǎn)的PVT1非蛋白編碼基因編碼，能夠靶向結(jié)合XRCC6的3′端非編碼區(qū)的16～22的區(qū)域。研究還發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌細(xì)胞 HT-29 凋亡水平與miR-1207-3p相關(guān)，miR-1207-3p過(guò)表達(dá)，HT-29凋亡水平上升，細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白CleavedCasp3、Cleaved-Casp9的表達(dá)量顯著上升，XRCC6的表達(dá)量下降，分析原因：miR-1207-3p所致的XRCC6表達(dá)量下降導(dǎo)致游離Bax的增多，造成XRCC6-Bax復(fù)合體的減少，導(dǎo)致Bax進(jìn)入線粒體引發(fā)了細(xì)胞凋亡，XRCC6 通過(guò)C-末端接頭結(jié)構(gòu)域中賴氨酸殘基的乙?；M(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，導(dǎo)致Bax的釋放，XRCC6的乙?；芙M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；傅恼{(diào)節(jié)，兩組相反的酶主要參與染色質(zhì)重塑。

綜上所述，miR-1207-3p可通過(guò)抑制XRCC6表達(dá)量來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29的凋亡。