（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽 110001）

狼瘡抗凝物（lupus anticoagulant，LA）是一組能與帶負(fù)電荷的磷脂或磷脂蛋白復(fù)合物結(jié)合的免疫球蛋白，在體外能延長磷脂依賴的凝血試驗(yàn)時(shí)間［1］。目前檢測LA常用的方法為活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、改良的稀釋蝰蛇毒時(shí)間（dilute Russell viper venom time，DRVVT）及二氧化硅凝固時(shí)間（silica clotting time，SCT）檢測法，通常以篩選試驗(yàn)、混合試驗(yàn)和確認(rèn)試驗(yàn)傳統(tǒng)的三步法來判讀是否存在LA。本研究擬通過APTT即刻糾正試驗(yàn)（APTT法）、SCT法及DRVVT法的篩選和確認(rèn)試驗(yàn)檢測血漿中的LA，旨在評估3種方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料：根據(jù)實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)（laboratory information system，LIS）及電子病歷，回顧分析2019年2月至2020年1月于我院就診的通過SCT法、DRVVT法及APTT法檢測LA的1 240例樣本，排除凝血因子缺乏、含因子抗體、凝血酶時(shí)間異常、應(yīng)用抗凝藥物及紅細(xì)胞壓積非正常者。篩選出通過SCT法及DRVVT法檢測LA陽性332例（A組），同時(shí)應(yīng)用DRVVT法、SCT法及APTT法檢測LA135例（B組），同時(shí)應(yīng)用3種方法檢測且LA持續(xù)陽性（至少間隔12周檢測LA陽性≥2次）87例（C組）。其中，抗磷脂綜合征（antiphospholipid syndrome，APS）38例，非APS 49例。

1.1.2 儀器與試劑：法國思塔高公司STA-R-Evolution儀器及相關(guān)配套試劑用于APTT檢測；美國實(shí)驗(yàn)儀器公司TOP-750及相關(guān)配套試劑用于SCT和DRVVT檢測。

1.1.3 標(biāo)本制備：采取靜脈血2.7 mL，置于含有0.3 mL枸櫞酸鈉（0.109 mol/L）的負(fù)壓試管中，充分混勻。2 000～2 500g、10 min離心2次，獲得乏血小板血漿（血小板計(jì)數(shù)＜10×109/L），用于LA檢測，離心1次乏血小板血漿用于APTT檢測。

1.2 方法

1.2.1 APTT即刻糾正試驗(yàn)：分別即刻檢測患者血漿（a）、正常血漿（b）、患者血漿和正常血漿1∶1相同體積混合后血漿（c）的APTT。計(jì)算羅斯納指數(shù)（Rosner index，RI）值=［（APTTc-APTTb）/APTTa］×100%。RI≥11.0%為未糾正，即血漿含有抑制物；RI＜11.0%為糾正，即血漿凝血因子缺乏。

1.2.2 LA檢測：用SCT和DRVVT 2種方法進(jìn)行篩選和確認(rèn)檢測，檢測結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)化比值（normalized ratio，NR）表示。SCT NR和DRVVT NR＜1.2為LA陰性，SCT和DRVVT任一種方法的NR≥1.2即為LA陽性。

1.2.3 臨床診斷：動(dòng)、靜脈血栓由計(jì)算機(jī)斷層掃描、多普勒超聲、肺灌注顯像、血管造影或磁共振成像確定。病態(tài)妊娠根據(jù)2006年悉尼修訂的Sapporo標(biāo)準(zhǔn)確定［2］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0及GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及作圖。非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以M（P25～P75）表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。應(yīng)用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線統(tǒng)計(jì)參數(shù)的診斷效能。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A組SCT法和DRVVT法檢測LA陽性率和符合率比較

SCT法和DRVVT法陽性率（74.4%和78.3%）間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05），2種方法在NR分別＞1.2、1.5和2.0時(shí)的符合率（52.7%、48.3%和45.9%）亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05），見表1。

表1 SCT法和DRVVT法檢測LA的符合率Tab.1 LA coincidence rate detected by SCT method and DRVVT method

2.2 B組各亞組RI的比較及對LA陽性的診斷分析

2.2.1 SCT NR、DRVVT NR和RI的相關(guān)性：B組的135例樣本SCT NR、DRVVT NR和RI均為非正態(tài)分布，Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，SCT NR與DRVVT NR、RI的相關(guān)系數(shù)分別為0.732、0.509（P＜ 0.01）。DRVVT NR和RI相關(guān)系數(shù)為0.516（P＜ 0.01）。

2.2.2 B組各亞組的RI值比較：將B組分為SCT陽性/DRVVT陽性組（66例）、僅SCT陽性組（14例）、僅DRVVT陽性組（19例）、LA陰性組（36例）4個(gè)亞組。各組RI值的中位數(shù)分別為34.05（21.05～38.72），16.05（9.38～26.65），12.65（7.95～22.73），12.95（8.20～18.13）。如圖1所示，SCT陽性/DRVVT陽性組與僅SCT陽性組、僅DRVVT陽性組、LA陰性組RI值均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜ 0.05，P＜ 0.01，P＜ 0.01），而后三者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 B組不同亞組RI比較Fig.1 Comparison of RI in different subgroups of group B

2.2.3 RI在不同NR診斷LA陽性的ROC曲線分析

RI對應(yīng)不同的NR診斷LA陽性的效能也不相同，當(dāng)NR≥2.0時(shí)，RI診斷LA陽性效能最高。見圖2、表2。

圖2 不同NR值時(shí)RI診斷LA陽性的ROC曲線Fig.2 ROC curve of RI for diagnosing LA positive with different NR values

2.3 3種檢測方法診斷APS的ROC曲線分析

C組87例樣本均為LA持續(xù)陽性，其中，38例診斷為APS，其他49例診斷為非APS。38例APS患者中，男8例，女30例，中位年齡33（11～76）歲。見表3、圖3。

3 討論

抗磷脂抗體（antiphospholipid antibody，APL）與血栓形成、病態(tài)妊娠、產(chǎn)科并發(fā)癥和皮膚表現(xiàn)有關(guān)［3］。當(dāng)臨床表現(xiàn)有血栓形成或病態(tài)妊娠且試驗(yàn)室檢查有持續(xù)性APL存在時(shí)，可診斷為APS［2］。LA在APS的診斷和治療中起著非常重要的作用，在APL譜中，相較于抗心磷脂抗體（anticardiolipin antibody，ACL）和抗β2糖蛋白（β2glycoprotein，β2GP）-Ⅰ抗體，LA與臨床事件的相關(guān)性最佳，因此，LA檢測越來越受到臨床重視。但LA的異質(zhì)性以及不同的檢測試劑和儀器等差異問題導(dǎo)致很難建立金標(biāo)準(zhǔn)。目前，還沒有單一的檢測系統(tǒng)能檢測到所有的LA［4］。為了增加檢測LA的敏感性，3個(gè)國際指南［5-7］都建議采取2種不同途徑的試驗(yàn)方法，APTT和DRVVT是國際上最常使用的2種檢測方法［8］，文獻(xiàn)指出SCT也可作為LA檢測的備選方法。本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測LA采用SCT法和DRVVT法，APTT糾正試驗(yàn)只是用于區(qū)分內(nèi)源途徑及共同途徑因子缺乏和抑制物。

表2 RI在不同NR診斷LA陽性的ROC曲線分析Tab.2 ROC curve analysis of RI diagnosing LA positive with different NR

表3 3種檢測方法診斷APS的ROC曲線分析Tab.3 ROC curve analysis of the three detection methods for diagnosing APS

圖3 3種方法診斷APS的ROC曲線Fig.3 ROC curve of three methods for diagnosing APS

本研究中，SCT法和DRVVT法檢測LA的陽性率雖無顯著差異，但二者聯(lián)合檢測可提高LA的陽性率，且隨著NR逐漸升高，SCT法和DRVVT法的陽性符合率逐漸降低。AVERINA等［9］在1項(xiàng)關(guān)于評估SCT法在具有各種APS癥狀的臨床人群診斷準(zhǔn)確性的研究中，用SCT法和DRVVT法在123個(gè)健康供體中計(jì)算參考臨界值，將高于第99百分位的值定義為陽性臨界值，第97.5百分位的95%CI的下限定義為邊界臨界值，采用2種方法陽性臨界值的符合率低于采用邊界臨界值時(shí)的符合率。本研究結(jié)果與既往文獻(xiàn)一致。

APTT即刻糾正試驗(yàn)通常用于區(qū)分凝血因子缺乏和抑制物。本研究B組樣本中，SCT陽性/DRVVT陽性組的RI明顯高于其他組，說明APTT法的RI對LA的診斷是有價(jià)值的，與文獻(xiàn)［10］報(bào)道一致，但該文獻(xiàn)也指出，很難將低活性的LA陽性樣本從陰性樣本中分離出來。本研究發(fā)現(xiàn)，僅SCT陽性組、僅DRVVT陽性組與LA陰性組的RI值無顯著差異，也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。因此，由于稀釋效應(yīng)，混合試驗(yàn)陰性不能排除弱陽性LA［6］。LA陰性組RI中位數(shù)是12.95，大于本研究采用的臨界值11.0［11］，可以解釋為APL譜中除了LA，還包括抗β2GP-Ⅰ抗體和ACL等其他APL，雖然它們所占比例較低。因此，血漿中不含LA而含有抗β2GP-Ⅰ抗體或ACL也可能導(dǎo)致APTT即刻糾正試驗(yàn)陽性。沒有單一的混合試驗(yàn)解釋可以100%敏感或特異地區(qū)分因子缺乏或抑制物［11-12］。由于SCT法和DRVVT法的存在，如果單純從檢測LA的角度看，APTT即刻糾正試驗(yàn)似乎是可有可無的。CLSI 2014更進(jìn)一步優(yōu)化并重新排列了篩查、確認(rèn)和混合試驗(yàn)的順序，混合試驗(yàn)僅在初始試驗(yàn)不明確的情況下才進(jìn)行，因可能導(dǎo)致假陰性報(bào)告，在沒有證據(jù)表明凝血時(shí)間延長的其他原因的樣本中，應(yīng)省略混合試驗(yàn)。但有研究［13］認(rèn)為，盡管較為罕見，但LA的輔助因子效應(yīng)在沒有混合試驗(yàn)的情況下不能得到驗(yàn)證，且僅靠綜合試驗(yàn)不能檢測到這種現(xiàn)象。關(guān)于混合試驗(yàn)在LA分析中還存在更多爭議［14］，而在沒有能力使用SCT和DRVVT等方法檢測LA的實(shí)驗(yàn)室，APTT即刻糾正試驗(yàn)仍是一種比較有效的檢測手段，且成本低廉。

3個(gè)國際指南并未明確判斷LA強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)AVALORO等［8］報(bào)道，以NR 1.2～＜1.5為弱陽性，1.5～＜2.0為中等陽性，≥2.0為強(qiáng)陽性。在本研究中，當(dāng)NR分別≥1.2、1.5、2.0時(shí)，RI診斷LA陽性的最佳臨界值分別為22.2、23.9、26.5，這與KUMANO等［10］認(rèn)定的LA陽性組的RI中位值為24.0相似。RI診斷LA陽性的ROC-AUC隨RI臨界值的增高而增高，與RATZINGER等［15］的研究結(jié)果，即對LA敏感的APTT試劑的混合試驗(yàn)RI診斷LA陽性ROC-AUC為0.83相似，但該研究未將NR分層比較。

1項(xiàng)隊(duì)列研究［16］發(fā)現(xiàn)，高水平的LA與APS的臨床事件相關(guān)，該研究用SCT法和DRVVT法對APS進(jìn)行了診斷，NR臨界值分別為1.91和1.61，有較好的特異性，后者更敏感。目前未見用APTT即刻糾正試驗(yàn)的RI診斷APS的報(bào)道。本研究顯示，3種方法中，APTT法診斷APS的敏感度最高。盡管指南將DRVVT法描述為更特異地檢測LA而特別強(qiáng)調(diào)其使用，但有文獻(xiàn)［6，17］顯示，APTT法比DRVVT法具有更好的性能、更少的假陰性和假陽性結(jié)果。

綜上所述，本研究通過APTT即刻糾正試驗(yàn)、SCT法及DRVVT法的篩選和確認(rèn)試驗(yàn)檢測了血漿中的LA，旨在評估3種方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。由于LA的異質(zhì)性、方法的局限性，使其檢測具有挑戰(zhàn)性，因此，要充分了解LA檢測的儀器、方法、試劑性能及APS本質(zhì)，為臨床診斷APS提供有力證據(jù)。作為1項(xiàng)回顧性研究，本研究的樣本量較小，信息采集可能還存在缺陷，可能存在回顧性信息偏倚，今后需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)本研究結(jié)果。