張嵐，劉法昱，吳楠

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院，遼寧省口腔疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 1.院內(nèi)感染管理辦公室；2.口腔頜面外科，沈陽(yáng) 110002）

PRDM家族蛋白廣泛存在于嚙齒動(dòng)物、靈長(zhǎng)類、鳥類和兩棲動(dòng)物體內(nèi)。其中一部分能夠影響表觀遺傳，其蛋白鋅指結(jié)構(gòu)可以識(shí)別DNA、RNA和蛋白；另一部分PRDM家族成員可以影響原始生殖細(xì)胞特化、癌癥發(fā)生、造血、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等［1-2］。

據(jù)文獻(xiàn)［3］報(bào)道，PRDM在靈長(zhǎng)類中包含17個(gè)成員，在嚙齒動(dòng)物、鳥類、兩棲動(dòng)物中有16個(gè)，而在真菌與植物中未被檢測(cè)到。同時(shí)，這些成員各不相同［4］。最近的研究［5-7］發(fā)現(xiàn)，沉默PRDM14基因可以抑制乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移；PRDM13可以通過(guò)某種機(jī)制發(fā)揮抑癌作用；PRDM16會(huì)影響癌癥的發(fā)生。PRDM15通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控WNT和MAPK-ERK信號(hào)維護(hù)小鼠胚胎干細(xì)胞初始狀態(tài)。然而，PRDM15在腫瘤中的作用機(jī)制尚不明確，因此，本研究擬探討PRDM15在頭頸鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）中的表達(dá)及其對(duì)HNSCC患者臨床預(yù)后的影響，旨在為深入研究其在HNSCC發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中的作用和尋找精確、高效的生物標(biāo)志物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

100例標(biāo)本均來(lái)自2014年至2015年于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)并經(jīng)病理確診為HNSCC的患者。其中，男58例，女42例；年齡范圍32～70歲。病灶和正常組織均保存完整，癌旁組織為距癌灶3 cm外且無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn)的組織。將HNSCC組織設(shè)為C組，癌旁組織設(shè)為N組。

1.2 免疫組化染色

根據(jù)染色強(qiáng)度和所觀察到陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量按照百分比計(jì)算分?jǐn)?shù)。判別陽(yáng)性細(xì)胞的標(biāo)志為切片中細(xì)胞核染色深淺，從淡黃至棕褐色且以大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的顏色為準(zhǔn)計(jì)分。無(wú)顏色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計(jì)為0分、1分、2分和3分。某類細(xì)胞的5個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)量即為陽(yáng)性細(xì)胞百分比。0～5%、＞5%～25%、＞25%～50%、＞50%～75%、＞75%分別計(jì)為0分、1分、2分、3分和4分，每張切片隨機(jī)取5個(gè)400倍視野，每個(gè)視野均進(jìn)行染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積。評(píng)分為0分、1～4分、5～8分、9～12分依次計(jì)為陰性（-）、弱陽(yáng)性（+）、中度陽(yáng)性（++）和強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.3 Western blotting檢測(cè)

用冷PBS清洗新鮮組織標(biāo)本3次，去除血細(xì)胞。放入500 μL冷RIPA裂解液，用剪刀將組織剪碎，置于冰上研磨并靜置20 min后，4 ℃，12 000g離心20 min。吸上清，去除沉淀。取上清，利用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，取30 μg總蛋白在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離。將硝酸纖維素膜在轉(zhuǎn)移溶液中平衡10 min并用TTBS洗滌3次，每次持續(xù)5 min，轉(zhuǎn)膜，在含有5%脫脂牛奶中常溫封閉2 h，并在4 ℃下用anti-PRDM15或者anti-GAPDH孵育過(guò)夜，TBST清洗膜，室溫下二抗孵育1 h。ECL底物發(fā)光檢測(cè)蛋白表達(dá)。用Image J軟件對(duì)蛋白表達(dá)條帶光密度值進(jìn)行測(cè)量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間差異比較應(yīng)用Two-tailed Student’st檢驗(yàn)。組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HNSCC組織中PRDM15蛋白的表達(dá)水平

采用Western blotting檢測(cè)20例HNSCC患者癌旁和癌組織中PRDM15蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，有9例癌組織中PRDM15蛋白表達(dá)高于癌旁組織，采用Image J分析PRDM15和GAPDH蛋白條帶的灰度值，校正后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1。

2.2 HNSCC癌中PRDM15的表達(dá)與定位

圖1 PRDM15蛋白在HNSCC組織中的表達(dá)Fig.1 PRDM15 protein expression in HNSCC

應(yīng)用免疫組化對(duì)100例HNSCC患者的癌旁及癌組織中PRDM15的表達(dá)及定位進(jìn)行檢測(cè)。PRDM15在HNSCC患者的癌旁組織中表達(dá)為陰性，在癌組織中高表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中有少量表達(dá)，見圖2。graphpad統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，PRDM15在癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖3。

2.3 PRDM15在HNSCC中的表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)免疫組化半定量分析方法，將47例PRDM15弱陽(yáng)性病例歸為低表達(dá)組，將53例PRDM15中度陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性病例歸為PRDM15高表達(dá)組。生存曲線分析顯示，PRDM15高表達(dá)的HNSCC患者生存時(shí)間與PRDM15低表達(dá)的患者相比明顯縮短（P=0.017），提示PRDM15可能是患者預(yù)后生存的重要生物學(xué)標(biāo)志物。見圖4。

圖2 免疫組化檢測(cè)HNSCC組織中PRDM15的表達(dá)和定位Fig.2 Immunohistochemical analysis of the expression and localization of PRDM15 in HNSCC

圖3 HNSCC組織中PRDM15的表達(dá)情況Fig.3 PRDM15 expression in HNSCC tissues

圖4 生存曲線分析Fig.4 Survival curve analysis

3 討論

HNSCC在頭頸部惡性腫瘤中最為常見，每年全世界病例在50萬(wàn)～60萬(wàn)以上，由此導(dǎo)致的死亡人數(shù)超過(guò)37萬(wàn)［8］。HNSCC腫瘤細(xì)胞侵襲能力較強(qiáng)，臨床上常見復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。雖然相關(guān)的診斷及治療方法不斷進(jìn)步，但35%～55%的HNSCC患者在確診后2年內(nèi)會(huì)出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其5年生存率為34%～68%［9-11］。

有文獻(xiàn)［12-14］報(bào)道，PRDM家族是調(diào)控表觀遺傳的蛋白，其家族成員的功能不盡相同，其中PRDM13、PRDM14、PRDM16與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。PRDM15作為MAPK-ERK和WNT通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，調(diào)節(jié)其信號(hào)上游因子的轉(zhuǎn)錄，從而保護(hù)胚胎干細(xì)胞的多能性［7］。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，PRDM15在癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明PRDM15可能與HNSCC的惡性增殖或腫瘤的形成有關(guān)，參與調(diào)節(jié)腫瘤生物學(xué)行為及惡性轉(zhuǎn)化。生存曲線分析結(jié)果顯示，與PRDM15低表達(dá)的HNSCC患者相比，PRDM15表達(dá)增高的HNSCC患者生存時(shí)間明顯縮短。

本研究首次發(fā)現(xiàn)PRDM15在HNSCC中表達(dá)明顯增高，高表達(dá)PRDM15的HNSCC患者生存時(shí)間明顯短于低表達(dá)患者。為后續(xù)對(duì)PRDM15在HNSCC發(fā)生、發(fā)展及其在腫瘤增殖和侵襲轉(zhuǎn)移中作用機(jī)制的深入研究提供了理論依據(jù)，并為實(shí)現(xiàn)HNSCC的精準(zhǔn)診療提供了新的治療靶點(diǎn)。

綜上，PRDM15可能是HNSCC患者組織細(xì)胞中的關(guān)鍵致病性癌基因，其表達(dá)水平與腫瘤的狀態(tài)息息相關(guān)，有可能成為HNSCC患者的一個(gè)新的預(yù)后和治療的生物標(biāo)志物。