吳 金 羅 凱 夏 險 李夢玲 涂俊銘

一株野生羊肚菌的分離鑒定及原種培養(yǎng)基的篩選

吳 金 羅 凱 夏 險 李夢玲 涂俊銘*

（湖北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，特色野菜良種繁育與綜合利用技術(shù)湖北省工程研究中心，湖北 黃石 435002）

對野外茅草林下采集到的一株野生羊肚菌（菌株命名為Y1）進行分離純化，通過經(jīng)典分類方法結(jié)合分子生物學(xué)方法進行品種鑒定，并基于菌絲生長速度、菌絲密度及菌核數(shù)量從9種不同培養(yǎng)基配方中篩選最佳原種培養(yǎng)基。結(jié)果為：Y1的子實體菌蓋呈黃色，上有凹凸不平的網(wǎng)格，菌柄呈白色、中空，形似羊肚菌；在顯微鏡下觀察，菌絲體呈黃色，菌絲粗壯，菌絲結(jié)構(gòu)明顯，與羊肚菌屬形態(tài)特征相似；ITS序列比對顯示Y1與羊肚菌屬中的黃色羊肚菌類群同源性高達99%，初步鑒定該野生菌株為羊肚菌Mes-19；篩選出的最優(yōu)原種培養(yǎng)基配方為麥粒75%、土壤23%、石灰1%、過磷酸鈣1%。

羊肚菌；分離純化；品種鑒定；ITS序列；原種培養(yǎng)基

羊肚菌（）隸屬子囊菌亞門（Ascomycotinon），盤菌綱（Discomycetes），盤菌目（Pezizales），羊肚菌科（Morchellaceat），羊肚菌屬（）[1]。又稱羊肚菜、包谷菌，因其菌蓋表面有許多不規(guī)則的凹陷和褶皺，外形似羊肚而得名[2]。羊肚菌食用和藥用價值較高[3]，子實體肉質(zhì)鮮美脆嫩，營養(yǎng)豐富，富含氨基酸，含有機鍺，具有抗癌作用，對肌瘤細胞有明顯抑制作用[4]。

近年來，羊肚菌栽培規(guī)模發(fā)展迅速[5]，本研究通過分離一株野生菌株（圖1），運用經(jīng)典分類鑒定方法，結(jié)合ITS序列比對分析、遺傳進化分析，最終確定其分類學(xué)地位。同時，篩選最優(yōu)原種培養(yǎng)基配方，為當(dāng)?shù)厥秤镁a(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)。

圖1 野生菌株子實體

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試野生子實體于2019年4月9日采自湖北省黃石市陽新縣黃顙口鎮(zhèn)黃顙口村一片茅草下。

培養(yǎng)基配方，PDA培養(yǎng)基（1 000 mL）為土豆200 g、蔗糖20 g、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1 g、瓊脂25 g；液體培養(yǎng)基（1 000 mL）為土豆200 g、蔗糖20 g、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1 g。

原種培養(yǎng)基配方設(shè)9個，分別為：①麥粒75%、土壤23%、石灰1%、過磷酸鈣1%；②全麥粒100%；③棉籽殼80%、麥麩15%、白砂糖3%、石灰2%；④棉籽殼90%、木屑8%、土2%；⑤玉米芯50%、木屑30%、米糠15%、石膏1%、過磷酸鈣1%、土3%；⑥小麥80%、棉籽殼19%、石膏粉1%；⑦棉籽殼75%、木屑8%、麥麩12%、石灰1%、腐殖土4%；⑧小麥50%、麥麩5%、棉籽殼43%、石膏1%、石灰1%；⑨木屑65%、小麥20%、土壤10%、石膏1.5%、石灰1.5%、磷酸二氫鉀1%、硫酸鎂1%。

1.2 實驗方法

1.2.1 原種培養(yǎng)基配制

將各配方原料攪拌混合均勻，控制含水量在65%～70%。將混合好的原料裝入規(guī)格為17 cm×36 cm的聚丙烯袋中，每袋裝料量為500 g。套環(huán)，蓋蓋，翻折袋口，置于121 ℃下滅菌38 min，冷卻備用。

1.2.2 菌種分離與純化

菌株分離時，開紫外燈，確保操作區(qū)無菌；用經(jīng)75%酒精溶液浸泡的脫脂棉，對采集到的野生菌子實體進行表面消毒，再在培養(yǎng)皿中用無菌水清洗幾次；然后用在酒精燈火焰上滅菌，并經(jīng)冷卻的無菌解剖刀，在菌柄和菌蓋交界處切取0.3～0.5 cm2的正方形小方塊，接種到PDA固體平板培養(yǎng)基上。用封口膜把平板密封，并寫上標(biāo)簽，置于23 ℃下培養(yǎng)。3～5天后，平板培養(yǎng)基長出白色的絨毛狀菌絲，每天肉眼觀察有無污染情況，將未污染的菌絲轉(zhuǎn)接到試管中保藏。

1.2.3 菌株的鑒定

（1）菌絲DNA提取。將分離得到的菌種命名為Y1，接種到PDA平板培養(yǎng)基中，23 ℃下靜置培養(yǎng)7天后，挑取平板邊緣的菌絲，加入800 μL CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）提取液研磨成漿狀，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管后置于65 ℃水浴40 min。再加入800 μL體積比為24︰1的氯仿︰異戊醇溶液，搖勻靜置15 min后置于離心機12 000 r/min離心10 min；取上清液轉(zhuǎn)移至無菌離心管，加入1 mL 95%冰凍乙醇，用手輕搖2 min；放在－20 ℃冰箱冷凍至少30 min，取出放入離心機12 000 r/min離心10 min；棄上清液，沉淀加入1 mL 70%的乙醇，靜置5 min；再次12 000 r/min離心10 min，棄上清液，在潔凈工作臺中干燥，加入50 μL無菌水溶解，置于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹6]。

（2）PCR擴增與產(chǎn)物測序。引物采用真菌核糖體基因間隔區(qū)通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’[7]。PCR反應(yīng)體系：10×Taq buffer 2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）2 μL，DNA模板約50 ng，ITS1和ITS4（100 μmol/L）各1 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，ddH20補足到25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)。72 ℃末端延伸5 min，4 ℃保溫結(jié)束。2 uL樣品添加2 uL 6×Loading Buffer，取適量樣品進行檢測。膠濃度為1%，電壓120 V，電泳時間為20 min。最后用凝膠成像分析儀進行拍照檢測，點樣順序：M，Y1；收集的DNA樣品送到武漢天一輝遠測序公司測序。

（3）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。將測序后的羊肚菌ITS序列在GenBank進行同源比對，用BLAST進行序列比對，選取相似性較高的序列，采用軟件MEGA version 7.0[8]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，確定其分類學(xué)地位。

1.2.4 原種培養(yǎng)基的篩選

（1）原種菌絲培養(yǎng)。將生長良好的試管母種Y1接種到上述9個配方經(jīng)滅菌的原種培養(yǎng)基中，控制接種量大小相等，置于22 ℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每配方3次重復(fù)，每重復(fù)5袋。

（2）菌絲生長速度測定。每天觀察菌絲，記錄菌核數(shù)量、菌絲開始生長時間、菌絲密度及顏色變化，測定菌絲生長長度。菌絲生長速度(cm/d)=菌絲生長長度(cm)/生長天數(shù)(d)。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生菌株生境和形態(tài)學(xué)特征

在野外采到的大型野生羊肚菌子實體生境和形態(tài)特征如圖1。其外形似羊肚；菌蓋呈黃色，上有凹凸不平的網(wǎng)格，菌柄白色，中空；菇體長約10 cm；菌肉脆嫩，呈淺黃色。子實體生長于雨后的茅草林中，空氣濕度較大，地處長江中游南岸，東北臨長江，地跨東經(jīng)114°31′～115°30′，北緯29°30′～30°15′，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，四季分明，雨量充沛。

2.2 分離純化后野生菌株的菌落形態(tài)

野生菌株分離純化后的菌落形態(tài)如圖2。菌株分離后平板培養(yǎng)至第5天（圖2-A、B），菌絲呈白色、粗壯，菌落稠密且規(guī)則。菌株分離純化轉(zhuǎn)管后第6天（圖2-C），試管底部有少量的菌核，呈淺黃色；菌絲呈黃色，粗壯，最后進行保種。將純化后的試管種取一小塊轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)7天（圖2-D），菌絲呈圓球形、淺黃色，生物量多，錐形瓶壁上有一層菌皮，菌皮呈黃白色；培養(yǎng)液呈黃色，液體透明。

A為培養(yǎng)皿菌落正面；B為培養(yǎng)皿菌落反面；C為純化試管培養(yǎng)；D為液體搖瓶培養(yǎng)。

A、B、C是菌絲分離純化后的Y1在平板上直接放在40×、100×、400×顯微鏡下看到的菌絲形態(tài)。

2.3 野生菌株菌絲的形態(tài)學(xué)特征

在顯微鏡下觀察分離純化后的Y1菌絲，可清楚看到菌絲的生長方向和整體結(jié)構(gòu)（圖3-A、B），菌絲發(fā)生鎖狀聯(lián)合，菌絲直徑為30～60 μm；菌絲生長結(jié)構(gòu)，主要由一條主菌絲上繼續(xù)行二級分叉、三級分叉長出新的菌絲，菌絲顏色呈淺黃色。主菌絲比次菌絲要粗一些（圖3-C）。主菌絲細胞結(jié)構(gòu)呈網(wǎng)狀，且有像竹子一樣的“結(jié)節(jié)”，“結(jié)節(jié)”之間距離不等；主菌絲長出二級菌絲后，二級菌絲繼續(xù)長出三級菌絲。圖3-C右下角的“突起”，似花蕾，有待驗證是否是長出三級菌絲的起點。

2.4 分子鑒定結(jié)果

（1）PCR電泳結(jié)果與ITS序列分析。PCR擴增產(chǎn)物DNA電泳如圖4。泳道1為Marker，泳道2為目標(biāo)產(chǎn)物Y1的PCR擴增產(chǎn)物。目標(biāo)產(chǎn)物Y1，DNA條帶清晰、較明亮，無明顯后拖尾現(xiàn)象，產(chǎn)物很充足，特異性較強，大小在750～1 000 bp。將目標(biāo)產(chǎn)物的測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST比對，結(jié)果為：菌株Y1與sp.19親緣關(guān)系最接近，同緣性達99%。

（2）進化樹分析。將菌株Y1的ITS序列和從GenBank中找出的一些其他具有代表性的真菌序列一并導(dǎo)入MEGA version 7.0系統(tǒng)軟件，采用N-J法構(gòu)建進化樹分析（圖5），可直觀地判斷出Y1與sp.19在同一分支上，親緣關(guān)系最近。結(jié)合ITS序列分析和野生菌株形態(tài)學(xué)描述，初步鑒定野生菌株Y1為sp.19

圖4 PCR電泳結(jié)果

2.5 不同原種培養(yǎng)基Y1菌絲的生長情況

將Y1菌種接入9個不同配方的原種培養(yǎng)基，結(jié)果（表2）顯示，配方1、2、5、7、8的菌絲從第3天開始萌發(fā)定植，其他4個配方是第4天開始萌發(fā)。從菌核形成數(shù)量看，僅配方1和配方7在菌絲長滿菌袋期間出現(xiàn)黃色菌核，其余配方均未發(fā)現(xiàn)菌核，推測配方1和配方7的營養(yǎng)組成更有利于菌核的形成。

從菌絲濃密度看，配方3、4、8均稠密且粗壯，生長整齊，在后期菌絲滿袋后均呈黃色，表現(xiàn)尤佳，這3個配方的棉籽殼含量較高，推測可能是棉籽殼透氣性好，利于Y1菌絲生長。配方1、5、9菌絲較稠密粗壯無雜菌，表現(xiàn)次之。這3個配方的主要原料是麥粒、玉米芯、木屑。配方2為全小麥，菌絲生長較稀疏，氣生菌絲肉眼觀察短而細，可能是由料內(nèi)空隙少、透氣性不足導(dǎo)致。

從菌絲生長速度看，配方5、6、9最佳，分別為0.971±0.023 cm/d、1.000±0.053 cm/d和0.945± 0.015 cm/d，三者間差異不顯著；其后，依次為配方1、7、8、3、2；配方4菌絲生長速度顯著慢于其他配方，僅為0.590±0.008 cm/d。

菌絲的生長速度、菌核的有無與很多因素有關(guān)。本實驗采用9種培養(yǎng)基配方，營養(yǎng)成分、碳氮比、水分、pH和裝料的松緊度不同等內(nèi)部因素，以及培養(yǎng)環(huán)境溫濕度、實驗測量的誤差等[9]外部因素，都會對實驗結(jié)果造成一定影響。綜合考慮菌種萌發(fā)生長時間、菌核數(shù)量、菌絲顏色、菌絲濃密度、菌絲生長速度各因素，確定以配方1（麥粒75%、土壤23%、石灰1%、過磷酸鈣1%）作為菌株Y1的最優(yōu)原種培養(yǎng)基。

圖5 系統(tǒng)進化分析

表2 羊肚菌Y1菌株在不同原種培養(yǎng)基中的菌絲生長情況

注：同列不同小寫字母表示0.05水平的差異性顯著；“-”表示無菌核，“+”越多表示菌核越多。

3 結(jié)論與討論

微生物的分離鑒定用于區(qū)分微生物的種類，是微生物學(xué)中的一個重要組成部分，是后續(xù)實驗的基礎(chǔ)。其鑒定方法主要包括經(jīng)典分類鑒定方法和分子水平鑒定方法兩種[10]。對于大型真菌，經(jīng)典分類學(xué)方法主要是通過觀察菌絲和子實體形態(tài)，結(jié)合其生活習(xí)性和生理生化特征進行。該方法易于觀察和比較真菌的形態(tài)特征，雖有一定的穩(wěn)定性，但也有一定的局限性。局限性在于隨外界環(huán)境不同，子實體的形態(tài)和顏色會發(fā)生改變，完全根據(jù)經(jīng)典分類學(xué)方法得到的結(jié)果并不是很準確。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，可以通過真菌的分子水平鑒定方法中的ITS序列對其進行識別[11]分類。經(jīng)典分類學(xué)鑒定方法結(jié)合分子生物學(xué)鑒定方法，能準確地確定真菌的種屬分類關(guān)系。

本研究將兩種方法結(jié)合確定了一株野生黃色羊肚菌菌株的種屬關(guān)系。通過對子實體形態(tài)、分離后的菌絲形態(tài)、菌絲純化后的轉(zhuǎn)管情況、菌絲液體培養(yǎng)情況等的觀察，顯示其基本特征形態(tài)與羊肚菌屬相同。通過運用分子水平鑒定方法進行DNA提取、PCR擴增，將擴增得到的產(chǎn)物直接進行測序，再通過BLAST系統(tǒng)比對，利用MAGE version 7.0系統(tǒng)軟件繪制系統(tǒng)進化樹，最終確定該野生菌株為黃色羊肚菌類群中的19。

本研究還通過分析比較菌株Y1在9種不同原種培養(yǎng)基配方中菌絲的生長速度、密度、顏色變化及菌核數(shù)量，篩選適宜的原種培養(yǎng)基。菌絲的生長速度并非是越快越好，生長速度與培養(yǎng)箱里的空氣濕度、原種培養(yǎng)料的密度、透氣透水性、配方中的碳氮比等諸多因素有關(guān)[12, 13]。而優(yōu)質(zhì)菌種應(yīng)菌絲粗壯，菌核致密、較硬[14]，綜合考慮各因素，認為本實驗原種養(yǎng)基配方以配方1（麥粒75%、土壤23%、石灰1%、過磷酸鈣1%）最優(yōu)。

本研究在湖北黃石地區(qū)首次分離鑒定出黃色羊肚菌19，豐富了當(dāng)?shù)氐囊吧婢Y源，并為我國黃色羊肚菌類群的進一步開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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Isolation and identification of a wildstrain and its spawn medium screening

Wu Jin Luo Kai Xia Xian Li Mengling Tu Junming*

（Hubei Key Laboratory of Edible Wild Plants Conservation & Utilization; Hubei Engineering Research Center of Characteristic Wild Vegetable Breeding and Comprehensive Utilization Technology; College of Life Sciences, Hubei Normal University, Huangshi, 435002, China）

A wild edible fungus strain Y1 was found under a thatched forest during field investigation. The strain was purified and identified by classical classification and molecular biology methods. At the same time, through the analysis of the mycelial growth speed, mycelial density and the number of sclerotia ofamong 9 different kinds of medium formula, the spawn medium ofwas screened. The results showed that Y1 fruiting body is yellow in cap, white and hollow in stipe which was similar toin shape. Moreover, the mycelium was yellow, the mycelium was thick, obvious mycelium structure, under the microscope, which was similar toin morphological characteristics. The ITS sequence of the strain shared 99% homology with the yellowspecies ingenus. It was identified assp.19The optimum spawn medium formulation was 75% wheat grain, 23% soil, 1% lime and 1% superphosphate.

; isolation and identification; ITS sequence; original culture medium

Q93-3,S646

B

2095-0934（2021）01-050-06

食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室開放基金資助（EWPL201907）；湖北師范大學(xué)創(chuàng)新團隊項目（T201907）

吳金，女，在讀碩士研究生，主要研究食用菌資源開發(fā)與利用。E-mail：873028748@qq.com。

涂俊銘（1972—），男，博士，教授，主要從事微生物學(xué)方面研究。E-mail：627162862@qq.com。