陳倩茹 夏 雪 王 川 李前正 張洪培 陳迪松 吳振斌 周巧紅

(1.武漢理工大學資源與環(huán)境工程學院,武漢 430070;2.中國科學院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室,武漢 430072;3.中國科學院大學,北京 100049)

近年來城市化進程加速了河流污染并致使河流黑臭現(xiàn)象頻發(fā)[1,2]。黑臭河流威脅水生生態(tài)環(huán)境,嚴重影響居民的身心健康[3]。導致河流黑臭現(xiàn)象發(fā)生的外源性因素包括排放到河流中過量的有機物質、重金屬及營養(yǎng)元素等[4]。內源因素包括河流中生物地球化學循環(huán)的破壞,如碳、氮、磷和硫循環(huán),其中硫循環(huán)的影響甚大[5]。微生物在河流生態(tài)系統(tǒng)的生物地球化學循環(huán)中起著至關重要的作用[6,7]。在環(huán)境脅迫下微生物通常形成一些特定的群落結構[8,9],優(yōu)勢微生物群落的變化及其與其他微生物群落的相互作用通常會影響微生物生態(tài)系統(tǒng)的結構、功能和穩(wěn)定性[10]。對污染沉積物中微生物群落的表征可以提供識別潛在生物指示物種和響應特定污染物的生物標志物群落的機會[11]。因此,研究沉積環(huán)境中微生物群落的組成和優(yōu)勢群及監(jiān)測它們的變化至關重要。沉積物質量監(jiān)測和評價體系中往往忽略具有重要生態(tài)功能的微生物群落,缺乏生態(tài)系統(tǒng)多群落水平的調查研究。目前黑臭沉積物的微生物群落研究主要致力于垂直分布[11]、水體修復演化等[13],特別缺乏季節(jié)變化特征分析。就黑臭河流而言,它是硫化合物的儲存庫。典型的黑臭河含有38.8—222.6 mg/L的[14],在這樣的環(huán)境中,微生物還原硫酸鹽產(chǎn)生有異味的揮發(fā)性硫化合物,包括無機H2S和有機硫化物[15],導致河流發(fā)臭[3]。而Fe2+和Mn2+與硫離子結合產(chǎn)生的金屬硫化物被吸附在懸浮顆粒上,導致河流呈現(xiàn)黑色[3]。因此,亟需揭示與硫酸鹽還原相關的生物特征。

本文選取沙潁河流域下游城市黑臭內河為研究對象,采用高通量測序技術對沉積物微生物群落結構進行分析,并結合沉積物的理化性質,分析微生物群落群落結構特別是硫酸鹽還原菌與環(huán)境因子的關系,以期為黑臭成因和治理提供一定的支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況及采樣點設置

本研究的采樣點位于沙潁河下游安徽阜陽段城區(qū),選取在《阜陽市人民政府辦公室關于印發(fā)阜陽城區(qū)黑臭水體五年整治計劃的通知》中列出的22條黑臭河流中的兩條黑臭河道,七漁河和中清河。于2018年1月、4月、7月和11月在兩條黑臭河道中清河、七漁河的5個樣點分別采集沉積物樣品,其中中清河設置3個樣點,七漁河設置2個樣點,樣點分布見圖1和表1。使用彼得森采泥器采集樣點的表層沉積物樣品(0—5 cm深),每個樣點共取樣3次,混合均勻后立即將樣品放置到無菌塑料袋中,隨后儲存到便攜冰箱中運輸?shù)綄嶒炇摇Ｔ跇悠肪|化后,將一部分沉淀物樣品儲存在-80℃的無菌管中用于DNA提取,并將剩余的沉淀物樣品儲存在4℃下用于理化性質分析。

圖1 阜陽城市黑臭內河采樣點分布Fig.1 Distribution of the sampling sites in urban black-odorous river,Fuyang

1.2 沉積物理化指標分析方法

測量的沉積物理化指標包括T(Temperature,溫度)、pH、SOM(Soil organic matter,有機質)、TP(Total phosphate,總磷)、TN(Total nitrogen,總氮)、Cl-、F-及。TN測定用過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法,TP測定用抗壞血酸還原磷鉬藍法,SOM測定用灼燒減重法。Cl-、F-及測定用離子色譜法(離子色譜儀ICS-1100)。

1.3 微生物群落的Ilumina MiSeq測序分析

沉積物微生物DNA提取,選用16S rDNA V3—V4區(qū)的通用引物341F(5′-CCTACGGGNGG CWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTAT CTAATCC-3′)進行PCR擴增[16]。第一輪PCR擴增體系為30 μL:2×Taqmaster Mix(15 μL),Bar-PCR primer F(10 μmol/L)1 μL,Primer R(10 μmol/L)1 μL,Genomic DNA 10—20 ng,其余為H2O。PCR反應程序如下:94℃預變性3min;94℃變性30s,45℃退火20s,65℃延伸20s,循環(huán)5次。94℃變性20s:55℃退火20s;72℃延伸30s;循環(huán)5次,72℃延伸5min。第一輪擴增結束后,引入Illμmina橋式PCR兼容引物,進行第二輪擴增。PCR第二輪擴增體系與第一輪相同,反應程序如下:95℃預變性30s;95℃變性15s;55℃退火15s;72℃延伸30s;循環(huán)5次,最后72℃延伸5min。利用NEB kit試劑盒回收DNA。然后將擴增好的產(chǎn)物的兩個末端加上接頭,采用Illumina Hiseq 2500/4000 with PE150測序平臺進行測序分析(上海生工生物工程股份有限公司)。

表1 沙潁河流域各采樣位點詳細情況Tab.1 The introduction of sampling sites in the Shaying River Basin

1.4 生物信息學和統(tǒng)計學分析

測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別(Base Calling)分析轉化為原始測序序列[17],根據(jù)PE reads之間的overlap關系將成對的reads拼接成一條序列。通過barcode序列區(qū)分測序得到的原始測序序列,同時去除序列中的嵌合體及非特異性擴增序列。使用兩步Uclust法將97%相似水平的序列分類為運營分類單位[18](Operational Taxonomic Units,OTU),并對樣本的Chao豐度指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)進行計算。整合Silva[19]和NCBI 16S二個數(shù)據(jù)庫與細菌OTU代表性序列進行同源性比對。采用RDP classifier對OTU進行物種分類,利用R對物種分類學統(tǒng)計結果進行作圖。

使用Origin(8.5版本)繪制門水平優(yōu)勢物種豐度柱狀圖;利用SPSS(17.0版本)軟件分析沉積物理化因子及門水平優(yōu)勢物種在季節(jié)間的差異,在P＜0.05時,差異被認為是顯著的;結合Pearson相關性分析和CANOCO軟件(5.0版本)來進行評估環(huán)境因素與微生物群落之間的關系。

2 結果與討論

2.1 沉積物理化性質

沉積物四季的理化指標測定結果如表2所示,TN含量為1160—14340 mg/kg,TP含量為1110—4120 mg/kg。將其與沉積物質量標準(Sediment Quality Guidelines,SQG)[20]比較,發(fā)現(xiàn)沉積物4個季節(jié)樣品均處于污染狀態(tài),就TN含量而言:約有68.4%的沉積物樣品處于中度污染,31.6%的沉積物樣品處于重度污染;就TP含量而言:約有26.3%的沉積物樣品處于中度污染,73.7%的沉積物樣品的處于重度污染。

表2 黑臭內河沉積物理化因子測定結果Tab.2 The physico-chemical factors of sediments collected from urban black-odrous rivers

對沉積物理化指標測定結果進行差異性檢驗,TN含量在不同季節(jié)間差異明顯(P＜0.01),冬季的TP含量與夏秋兩季差異明顯(P＜0.05),其余指標在不同季節(jié)間差異不明顯(P＞0.05)。春季TN、TP、SOM等含量較高,總體來說,阜陽黑臭內河的沉積物在春季污染更為嚴重。

2.2 微生物群落的多樣性和豐富度季節(jié)特征

所有沉積物樣品高通量測序檢測得到的Coverage指數(shù)≥0.97,說明每個微生物樣品的OTUs都具有代表性,可以很好地反映微生物樣品信息。種群多樣性代表著一個群落中種的數(shù)量和各種的個體數(shù)量關系,同時還能反映群落的穩(wěn)定性和動態(tài)。通常Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)被用來評價物種的多樣性情況,Shannon指數(shù)越高說明多樣性越高,本研究中春季(5.44)＞冬季(4.92)＞夏季(4.61)＞秋季(3.82),而Simpson指數(shù)越低說明物種的多樣性越高,春季(0.03)＜夏季=冬季(0.07)＜秋季(0.17)?？偟膩砜?在黑臭河流中沉積物的微生物多樣性指數(shù)均不高,但是表現(xiàn)出一定的變化規(guī)律,即春季＞冬季≥夏季＞秋季。Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)通常被用來評價種群的豐富度,指數(shù)越高說明物種數(shù)越多,物種數(shù)由大到小依次為春季、冬季、秋季和夏季。春季微生物的多樣性和豐富度最高,這可能與春季沉積物高污染負荷有關。

根據(jù)微生物多樣性指數(shù)與環(huán)境因子的皮爾遜相關分析系數(shù)(表3),可以看出四季中沉積物微生物多樣性受季節(jié)與pH影響較顯著。溫度是決定微生物群落結構的關鍵因子,溫度升高微生物群落多樣性增加[21—24],溫度可用來預測微生物群落結構的季節(jié)動態(tài)變化,然而,在本研究中,阜陽黑臭沉積物的微生物多樣性(Shannon_index)與季節(jié)表現(xiàn)出顯著負相關(P=0.003),微生物豐富性(Chao1_index)與季節(jié)成顯著負相關(P=0.021),與溫度的關系不顯著,可能是由于沙潁河流域春秋季干旱頻發(fā),水位較低[25],從而影響了沉積物中的微生物的豐富度和多樣性。pH是決定微生物群落結構的另一關鍵因子,pH可以通過影響不同種類微生物的生長狀況和生態(tài)系統(tǒng)中的其他環(huán)境因子來直接或間接影響微生物群落的結構和多樣性[26,27]。

表3 微生物群落多樣性與沉積物之間的皮爾遜相關分析系數(shù)Tab.3 Pearson correlation analysis coefficient between microbial community diversity and physico-chemical factors of sediments

2.3 微生物群落結構季節(jié)特征

所有沉積物樣品共測定到42個門,4個季節(jié)中變形桿菌都是第一優(yōu)勢門,占比為40.3%—70.5%,這與之前學者對長江口沉積物的微生物組成研究一致[28,29]。除變形桿菌門外,優(yōu)勢菌門分別為厚壁菌門、綠彎菌門、疣微菌門、浮霉菌門、擬桿菌門和放線菌門。多項研究表明,變形桿菌、擬桿菌門和酸桿菌是沉積物環(huán)境中的優(yōu)勢微生物,它們始終是厭氧氨氧化、硫酸鹽還原等生物地球化學過程的重要貢獻者[28—30]。

比較沉積物中微生物群落結構發(fā)現(xiàn)(如圖2所示),變形桿菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、疣微菌門、擬桿菌門和放線菌門等優(yōu)勢菌門的相對豐度均在季節(jié)水平上存在差異。與其他季節(jié)相比較,春季厚壁菌門、綠彎菌門、放線菌門及酸桿菌門相對豐度較大,春季變形桿菌門相對豐度小于其他三季。由于綠彎菌門和酸桿菌門是已知指示污染的微生物[31],這在一定程度上說明春季沉積物污染更嚴重。秋季疣微菌門與擬桿菌門富集程度顯著減小,變形桿菌門相對其他季節(jié)顯著增加。而有研究表明變形菌門在微生物脫氮、氧化硫化物及降解有機物等具有主要作用,且大部分變形菌門的微生物在厭氧條件下仍可進行反硝化過程[32—34],因此推斷秋季微生物降解污染物的能力更強。這與2.1中得出的阜陽沉積物在春季污染更為嚴重的結論一致。

2.4 沉積物微生物群落與環(huán)境因子相關性

沉積物微生物群落受到各種環(huán)境因素的影響[35,36]。為了探討環(huán)境因素對微生物豐度和群落組成的影響,本研究利用冗余性分析(Redundancy analysis,RDA)探討微生物群落與環(huán)境因子之間的相關性。如圖3所示,在由主軸1和主軸2構成的排序圖中,環(huán)境因子用帶有箭頭的紅色線段表示,向量長短代表了其在主軸中的作用,箭頭所處象限表示環(huán)境因子與排序軸之間相關性的正負。圖3反映了4個季度沙潁河沉積物微生物群落組成、結構沿環(huán)境梯度變化的趨勢。在RDA排序圖中,與第一排序軸(水平)關系最大的是Cl-和F-,呈正相關。與第二排序軸(垂直)關系最大的是溫度及pH,呈正相關,SOM、TN、TP及呈負相關。4個季度的微生物在生態(tài)適應上既有重疊現(xiàn)象,又表現(xiàn)出對各自棲息生境的特殊適應特點,SOM、溫度及pH等相關環(huán)境因子可能是影響其分布的重要因素。

圖2 四季門水平優(yōu)勢沉積物微生物群落差異Fig.2 Seasonal difference of dominant microbial communities in sediments at the phylum level

圖3 門水平上的微生物群落與環(huán)境因子的RDA分析Fig.3 Redundancy analysis of microbial community and environmental factors based on phylum level

對各門水平上的微生物與環(huán)境因子進行Pearson分析,發(fā)現(xiàn)在門水平上受季節(jié)和溫度影響的微生物較多。在沉積物理化指標中,TN及SOM的含量對門水平上的環(huán)境微生物影響較大,這是因為營養(yǎng)元素可以用作碳或能量的來源,從而影響微生物群落的結構[37]。

環(huán)境因素對微生物群落和功能具有抑制或促進作用[38]。變形菌門與SOM(r= -0.489,P=0.034)和TN(r= -0.540,P=0.017)顯著負相關,厚壁菌門與總氮顯著正相關(r=0.503, P=0.028),綠彎菌門則與硫酸鹽顯著正相關(r=0.514,P=0.020),與SOM(r=0.603,P=0.006)及總氮(r=0.625,P=0.004)含量呈極強正相關,與pH顯著負相關(r= -0.570,P=0.011)。但本研究中仍有部分微生物如Chlamydiae、Aminicenantes等未表現(xiàn)出與環(huán)境因子相關,這可能是因為該研究中微生物門類與環(huán)境因子之間的關系可能受到混雜因素的影響,但其作用可能難以區(qū)分[37]。

2.5 硫酸鹽還原菌的季節(jié)特征

硫化氫與其他還原硫(S)化合物是黑臭水體中惡臭的主要來源[39—41]。在污染嚴重的石井河中檢測出4種惡臭揮發(fā)性有機硫化物[42]。硫酸鹽還原菌(Sulfate-reducing bacteria,SRB)可以利用含硫化合物作為能量代謝過程的主要成分進行異化性硫酸鹽還原,從而產(chǎn)生H2S。部分SRB還能將Fe3+還原為Fe2+,Fe2+與硫化氫反應形成硫化亞鐵(FeS)黑色懸浮物質,導致水體發(fā)黑[43]。因此,SRB是導致水體發(fā)黑發(fā)臭的主要微生物。然而,很少有研究者研究黑臭沉積物中SRB的季節(jié)動態(tài)變化。

本研究根據(jù)高通量測序的結果篩選出其中的SRB菌屬,在樣品中共發(fā)現(xiàn)16個SRB菌屬(表4),Desulfoprunum是本實驗沉積物中SRB豐度最高的菌屬。進一步分析SRB的季節(jié)特征,春季與秋季SRB菌屬相對豐度存在顯著差異(P=0.017)。春季沉積物中Desulfoprunum屬相對豐度最高,而Desulfoprunum屬嚴格厭氧,說明春季沉積物處于厭氧狀態(tài)。春季沉積物中SRB的類群最多,相對豐度最大,這些結果表明在春季該沉積物環(huán)境更適于SRB類群生長繁殖。為避免水體發(fā)黑發(fā)臭,應在春季控制SRB的數(shù)量。

表4 硫酸鹽還原菌屬與環(huán)境因子之間的皮爾遜相關分析系數(shù)Tab.4 Pearson correlation analysis coefficient between sulfatereducing and environmental factors

對硫酸鹽還原菌與環(huán)境因子進行相關性分析,Desulfovibrio屬與含量呈極強正相關(r=0.617,P=0.004),Desulfuromonas(r=0.476,P=0.034)、Desulfonema(r=0.462,P=0.040)、Desulfobacula(r=0.462,P=0.040)與TN呈顯著正相關,Desulfosporosinus與TN呈極強正相關(r=0.660,P=0.002),Desulfosporosinus屬與SOM呈顯著正相關(r=0.475,P=0.040),Desulfosarcina與Cl-呈顯著正相關(r=0.448,P=0.048),Desulfomonile屬與溫度呈顯著負相關(r=-0.494,P=0.017)。研究表明,硫酸鹽還原菌屬為厭氧異養(yǎng)微生物,其生長代謝依賴于含量,碳源及溶氧條件等[44,45]。本研究中硫酸鹽還原菌的相對豐度主要與TN、Cl-、SOM、含量相關。因此,為控制春季SRB的數(shù)量,應控制春季沉積物中的營養(yǎng)物質含量。

3 結論

與其他研究中沉積物微生物群落組成類似,本研究對黑臭內河不同季節(jié)沉積物進行測序,結果表明在門水平上,沉積物中優(yōu)勢菌門始終為變形桿菌、厚壁菌門、綠彎菌門、疣微菌門、浮霉菌門、擬桿菌門和放線菌門等,但這些菌門的相對豐度隨著季節(jié)變化而改變。春季指示污染的微生物如綠彎菌門和酸桿菌門相對豐度較高,秋季具有降解污染物能力的變形菌門相對豐度較高。這與對阜陽四季沉積物理化指標進行分析,得出的沉積物污染在春季更嚴重的結論一致。隨后對阜陽沉積物門水平上的微生物群落組成、環(huán)境因子進行RDA分析,結果表明SOM、溫度及pH等相關環(huán)境因子是影響微生物群落的重要因素。

對四季沉積物中的SRB菌屬進行統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)春季沉積物中SRB的類群最多,相對豐度最大,而導致水體發(fā)臭的硫化氫氣體主要在SRB還原硫酸鹽的過程中產(chǎn)生,部分SRB還會還原Fe3+,導致黑色懸浮物質FeS產(chǎn)生。因而,在黑臭沉積物的治理過程中,對SRB數(shù)量的控制尤為重要。對SRB與環(huán)境因子進行Pearson相關性分析,得到SRB的豐度與、TN、SOM、Cl-等呈顯著正相關。因此為有效避免河流黑臭物質的產(chǎn)生,建議在春季控制沉積物中營養(yǎng)物質的含量。