王靖舒，佟 平，陳紅兵，3，高金燕*

（1 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室 南昌330047 2 南昌大學食品學院 南昌330047 3 南昌大學中德聯(lián)合研究院 南昌330047）

食物過敏是部分特殊人群對食物產(chǎn)生的不良反應，其發(fā)生率呈逐年升高的趨勢[1-3]。雞蛋作為世界公認的八大類致敏性食物之一，其過敏原多存在于蛋清中，主要包括卵轉鐵蛋白、卵白蛋白、卵類粘蛋白和溶菌酶4 種[4-5]。其中，卵轉鐵蛋白（Ovotransferrin，OVT） 致敏性與卵類黏蛋白相似，是致敏性較強的蛋白之一[6]。目前對OVT 的研究主要為抗菌，抗炎，抗氧化活性，免疫調(diào)節(jié)等功能特性方面[7-10]，而對其消化穩(wěn)定性、致敏性等方面了解非常有限。

過敏原蛋白耐胃、腸消化或形成較大片段，是其導致腸道黏膜免疫致敏的前提條件[11]，而且過敏原蛋白的胃、腸消化特性是食物過敏的關鍵因素[12]。小腸作為食物消化吸收中最主要的部分，主要分為腸腔消化和黏膜消化。小腸刷狀緣膜酶（Small intestinal brush border membrane enzyme，簡稱BBM 酶） 是小腸刷狀緣表面的一種消化酶，能夠逐步分解多數(shù)小肽段和一部分多肽段[13]，被應用于很多研究[14-15]。曾有學者指出[16-17]，小腸粘膜期是蛋白質消化的重要環(huán)節(jié)，BBM 酶包括氨肽酶A、氨肽酶N、膜甘氨酰亮氨酸肽酶、二肽基肽酶、γ-谷氨酰轉移酶、羧基酞酶和鋅穩(wěn)定性天冬氨酰賴氨酸肽酶等7 種類型，主要與各類寡肽和二肽的水解、氨基酸吸收和二肽轉運有關。James 等[18]也曾指出，黏膜消化是各種養(yǎng)分的最終消化階段，腸黏膜是所有養(yǎng)分的最終消化場所。目前有關BBM 酶進一步消化OVT 的胃-小腸消化產(chǎn)物的研究鮮有報道。

結合OVT 的研究現(xiàn)狀及嬰幼兒、成年人的胃、腸發(fā)育狀況，本研究在體外靜態(tài)消化模式下，分別模擬嬰幼兒和成年人胃液、小腸液以及BBM酶對OVT 的消化。采用Tricine-SDS-PAGE 和MALDI-TOF-MS 結合方法分析各消化階段的產(chǎn)物，探討各階段不同條件下消化產(chǎn)物的變化，旨在闡明OVT 的胃、腸消化特性，為進一步理解嬰幼兒與成年人食物過敏的差異性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗與試劑

新鮮雞蛋，市售。

DEAE-Sepharose Fast Flow，美國GE 公司；胃蛋白酶等消化酶及消化所需其它試劑，美國Sigma 公司；BBM 酶（活性為0.072 U/mg 蛋白），南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室自制；SDS-PAGE 凝膠配制所用試劑，上海生工生物工程有限公司；大分子預染蛋白Marker、小分子非預染蛋白Marker，美國Thermo 公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA），日本島津公司；HCl、NaHCO3、NaCl、NaOH、冰乙酸、無水乙醇、無水甲醇等化學試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 設備與儀器

DHL-A 電腦恒流泵、HD-21 核酸蛋白檢測儀、數(shù)控計滴自動部分收集器、TH-500 梯度混合儀，上海青浦滬西儀器廠；N2000 色譜工作站，浙江大學智達信息工程有限公司；Mini 蛋白電泳儀、GS-800 凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；MAL DI-TOF-MS 質譜儀，日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 卵轉鐵蛋白（OVT） 的分離純化 參考佟平[19]的蛋清預處理及分離純化OVT 的方法，提取蛋清蛋白，采用濃縮膠濃度4%、分離膠濃度12%的SDS-PAGE 對各洗脫峰進行鑒定，收集純度符合試驗條件的OVT 提取液進行超濾濃縮，最終采用BCA 試劑盒測定濃縮的OVT 提取液濃度。

1.3.2 體外模擬嬰幼兒及成年人胃腸消化 參考Dupont 等[20]的方法，稍作改進，并設置不同條件進行胃、腸消化過程，具體如下。

1.3.2.1 體外模擬嬰幼兒胃腸消化 胃消化不同時間條件：pH 2.5，胃蛋白酶（22.75 U/mg 蛋白），75 mmol/L NaCl，37 ℃分別孵育0，30，60，90，120 min。取5 支10 mL EP 管，先后加入模擬胃液1 mL 和1 mg/mL OVT 提取液1 mL，混勻后進行孵育。加入1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH 值至中性，終止消化。消化產(chǎn)物用于分析。

胃消化不同pH 值條件：胃蛋白酶（22.75 U/mg 蛋白），75 mmol/L NaCl，pH 值分別為1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，37 ℃孵育1 h。取5 支10 mL EP 管，先后加入不同pH 值的模擬胃液1 mL 和1 mg/mL OVT 提取液1 mL，混勻后于37 ℃孵育1 h，加入1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH 值至中性，終止消化。消化產(chǎn)物用于分析。

腸消化不同時間條件：pH 6.5，牛α-糜蛋白酶（0.04 U/mg 蛋白），豬胰蛋白酶（3.45 U/mg 蛋白），1 mmol/L 牛黃膽酸鈉，1 mmol/L 甘氨脫氧膽酸鈉，26.1 mmol/L Bis-Tris 緩沖液，37 ℃分別孵育0，30，60，90，120 min。取5 支10 mL EP 管，先后加入嬰幼兒模擬胃液1 mL 和1 mg/mL OVT 提取液1 mL，混勻后于37 ℃孵育1 h，加入適量1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH 值至中性。再加入嬰幼兒模擬腸液2 mL，37 ℃孵育一定時間后，100 ℃恒溫加熱5 min，終止反應。消化產(chǎn)物用于分析。

1.3.2.2 體外模擬成年人胃腸消化 胃消化不同時間條件：pH 2.0，胃蛋白酶（182 U/mg 蛋白），50 mmol/L NaCl，37 ℃分別孵育0，30，60，90，120 min。消化方法同1.3.2.1 胃消化不同時間條件。

胃消化不同pH 值條件：胃蛋白酶（182 U/mg蛋白），50 mmol/L NaCl，pH 值分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，37 ℃孵育1 h。消化方法同1.3.2.1 胃消化不同pH 值條件。

腸消化條件：pH 6.5，牛α-糜蛋白酶（0.44 U/mg 蛋白），豬胰蛋白酶（34.5 U/mg 蛋白），4 mmol/L牛黃膽酸鈉，4 mmol/L 甘氨脫氧膽酸鈉，26.1 mmol/L Bis-Tris 緩沖液，37 ℃分別孵育0，30，60，90，120 min。消化方法同1.3.2.1 腸消化不同時間條件。

1.3.3 體外模擬嬰幼兒及成年人BBM 酶消化取2 支10 mL EP 管，先后加入嬰幼兒/成年人模擬胃液1 mL，1 mg/mL OVT 提取液1 mL，混勻后于37 ℃孵育1 h；加入1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至中性，再對應加入嬰幼兒/成年人模擬腸液2 mL，混勻后37 ℃孵育1 h 后加入50 μL BBM 酶溶液，混合均勻37 ℃溫度孵育2 h，100 ℃恒溫加熱5 min 終止反應。消化產(chǎn)物用于分析。

1.3.4 Tricine-SDS-PAGE 及MALDI-TOF-MS 分析 OVT 經(jīng)體外模擬嬰幼兒和成年人胃、小腸及BBM 酶連續(xù)消化的各階段產(chǎn)物，采用Tricine-SDS-PAGE 及MALDI-TOF-MS 分別分析。Tricine-SDS-PAGE 所用致密膠濃度為16.5%，夾層膠濃度為10%，分離膠濃度為4%，量程設置為30 V（1 h）～100 V（2 h）。MALDI-TOF-MS 質譜分析試驗參數(shù)：線性正離子譜模式，N2激光源，波長337 nm，離子源加速電壓25 kV，脈沖寬度3 nS，疊加108，基質為CHCA。取樣品0.5 μL 于樣品孔中心，加入基質0.5 μL，室溫晾干結晶后放入質譜儀中測試。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 超濾濃縮OVT 的濃度試驗重復3 次，利用Microsoft Excel 2010 統(tǒng)計處理，采用Origin 9.0 作圖分析。Tricine-SDS-PAGE 采用GS-800 凝膠成像系統(tǒng)成像。MALDI-TOF-MS 采用Shimadzu Biotech Launchpad 軟件采集信息并成圖。

2 結果與分析

2.1 OVT 的分離純化

通過SDS-PAGE 對蛋清分離產(chǎn)物鑒定，圖1a中泳道1～2 中78 ku 處出現(xiàn)OVT 條帶且純度大于92.5%，泳道3～4 中除OVT 外含有其它蛋白，純度較低。收集符合試驗條件（泳道1～2）的所有OVT提取液，通過超濾濃縮、BCA 試劑盒測得其質量濃度為6.24 mg/mL。

圖1 OVT 純度鑒定（a）及濃度測定（b）Fig.1 Purity identification（a） and concentration determination（b） of ovotransferrin

2.2 OVT 在體外模擬嬰幼兒和成年人胃液中的消化

在消化過程中，胃主要通過研磨（胃竇的機械研磨）和胃分泌物的聯(lián)合作用來分解食物結構。一般研究食物胃消化時，設置模擬胃消化時長為1 h，模擬胃液pH 值多為1.5～2.5。結合嬰幼兒及成年人胃發(fā)育及胃消化特點，本試驗分別設置胃消化時間和消化液pH 值梯度變化，探討不同條件對OVT 的消化影響。

2.2.1 不同消化時間對胃消化的影響

2.2.1.1 消化時間對模擬嬰幼兒胃消化OVT 的影響 體外模擬嬰幼兒胃消化不同時間，OVT 產(chǎn)物結果分析見圖2。圖2a 中，嬰幼兒胃消化產(chǎn)物主要分布在5～15 ku 和30～50 ku。胃消化伊始，OVT 產(chǎn)物數(shù)量多且呈彌散狀。Hoppe 等[21]發(fā)現(xiàn)OVT 在胃蛋白酶消化液（pH 1.2）中孵育30 s 消失，Wang等[22]也提到OVT 對胃蛋白酶水解較為敏感，說明OVT 對胃蛋白酶沒有抵抗力。隨著消化時間的延長，泳道2～5 的條帶表示消化產(chǎn)物基本相同而豐度不同，產(chǎn)物中分子質量較大的產(chǎn)物進一步逐漸分解為分子質量較小的蛋白。圖2b 為質譜圖出峰范圍5～13 ku 區(qū)域。胃消化伊始，OVT 產(chǎn)物分子質量分布在5～13 ku，6.8，7.0，7.9 ku 及10.1 ku 處離子峰信號較強，相對強度較高。隨著消化時間的延長，譜圖2～5 中10 ku 處吸收峰消失，產(chǎn)物分子質量均分布在5～8 ku 之間，出峰趨勢相同，部分離子峰信號強度隨時間變化而變化，說明胃消化時間對消化產(chǎn)物具有一定影響。

由圖2可知，體外模擬嬰幼兒胃消化OVT 的產(chǎn)物分子質量范圍為5～15 ku 和30～50 ku，且胃消化形成的產(chǎn)物以前者居多。隨著胃消化時間的延長，OVT 在嬰幼兒模擬胃液中逐步降解，也生成了分子質量5.5，6.8，8.4 ku 的耐消化蛋白質。

2.2.1.2 消化時間對模擬成年人胃液消化OVT 的影響 OVT 在成年人模擬胃液中的消化產(chǎn)物分析圖見圖3。圖3a 中，OVT 由78 ku 大分子蛋白分解為5～14 ku 和30～50 ku 蛋白。胃消化30～120 min時，10 ku 處條帶逐漸變淺至消失，而7 ku 處條帶逐漸變深，這與劉光明等[23]體外模擬胃消化日本鰻鱺膠原蛋白的降解趨勢一致，即隨消化時間的延長，分子質量較大的降解產(chǎn)物逐漸減少，分子質量較小的降解產(chǎn)物則增加。圖3b 顯示MALDITOF-MS 出峰范圍為5～10 ku。成年人胃消化伊始，產(chǎn)物以5～8 ku 蛋白為主，而圖2b 譜圖1顯示嬰幼兒胃消化0 min 時的產(chǎn)物以6～11 ku 的蛋白居多，說明OVT 在成年人模擬胃液中更易被降解為分子質量偏小的蛋白，即短時間內(nèi)成年人胃消化OVT 的能力較嬰幼兒強。OVT 在成年人胃液中消化30 min 時，生成5.5，6.8 ku 的蛋白，產(chǎn)物種類明顯減少。隨著消化時間的延長，5.5 ku 的蛋白未發(fā)生變化，較耐胃消化；而6.8 ku 處吸收峰消失，即該分子質量蛋白發(fā)生酶解。

圖2 OVT 在體外模擬嬰幼兒胃液消化不同時間的產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）圖譜Fig.2 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated infant gastric juice in vitro at different times

結合圖2及圖3可知，成年人胃消化的產(chǎn)物分子質量范圍與嬰幼兒胃消化產(chǎn)物范圍一致。在成年人胃消化60 min 時，OVT 已基本消化完全。試驗證明OVT 可隨著消化時間的延長在成年人模擬胃液中逐步降解，生成5.5 ku 耐胃消化蛋白。

OVT 在嬰幼兒和成年人模擬胃液中均隨消化時間延長而逐漸降解，這與簡姍[24]的研究結果一致。黃園園等[25]對甲殼類動物中主要過敏原原肌球蛋白進行模擬胃消化也得出相同結論。此外，嬰幼兒和成年人消化產(chǎn)物中均含有5.5 ku 耐消化蛋白，而成年人胃消化產(chǎn)物種類較少，這是因為嬰幼兒胃液中鹽酸和各種酶的分泌均較成人少且酶活力低，導致消化功能差[26]。成年人各消化系統(tǒng)發(fā)育完全，體內(nèi)消化液中各成分的分泌量均高于嬰幼兒，消化功能也隨之增強。

圖3 OVT 在體外模擬成年人胃液消化不同時間的產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）圖譜Fig.3 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated adult gastric juice in vitro at different times

2.2.2 不同pH 值對胃消化的影響 胃功能不健全的嬰兒、胃潰瘍患者等人群在功能紊亂或胃液分泌不足時，胃液的酸度較低，對食物的消化作用有一定影響。在用餐后，人體胃液pH 值會升至3或更高[27-28]。因此，本試驗設置梯度pH 值變化，探究模擬胃液pH 值對OVT 胃消化穩(wěn)定性的影響，并根據(jù)不同pH 值條件，消化相同時間生成的產(chǎn)物種類、含量和較大分子質量產(chǎn)物的降解狀態(tài)，結合已報道的胃內(nèi)正常pH 值范圍，確定OVT 在嬰幼兒及成年人胃液中最易消化的pH 值。

2.2.2.1 胃液pH 值對模擬嬰幼兒胃液消化OVT的影響 體外模擬嬰幼兒在不同pH 值條件下消化OVT 1 h 的產(chǎn)物分析圖見圖4。圖4a 中，嬰幼兒模擬胃液pH 值在1.5～2.5 范圍時，OVT 多被消化為5～12 ku 左右的蛋白，pH 值的升高使OVT 降解產(chǎn)物中的大分子蛋白逐步被水解為小分子蛋白，在胃液環(huán)境pH 值為2.5 時，大于10 ku 的條帶已基本消失；胃液環(huán)境pH 值為3.0 時，OVT 被消化為10～30 ku 左右的蛋白，條帶數(shù)目較多并彌散狀；pH 值為3.5 時，OVT 基本不會被消化，在78 ku 處呈清晰條帶。簡姍[24]的結果也表明，在模擬胃液pH 3.5 條件下，OVT 消化2 min 后仍有大量未降解的蛋白條帶。圖4b 中，模擬胃液pH 值為3.5時，OVT 發(fā)生不完全降解，可檢測到完整的OVT蛋白和少部分經(jīng)過胃消化生成的5～10 ku 的蛋白；在pH 1.5～3.0 條件下，OVT 都能夠被消化為分子質量為5～10 ku 的蛋白。進一步縮小譜圖范圍至5～10 ku，得到圖4c，胃液pH 值為1.5～2.5時，OVT 胃消化產(chǎn)物基本相同，然而隨著pH 值的升高，5.5，6.8，7.7，8.4 ku 等吸收峰強度有所變化，說明pH 值對胃消化具有一定影響，與其它試驗結果一致[29-30]；在pH 3.0 條件下，OVT 胃消化產(chǎn)物的吸收峰數(shù)量減少，消化產(chǎn)物分子質量較大，消化能力減弱。因此，OVT 在模擬胃液pH 2.5 條件下進行消化，產(chǎn)物中較大分子蛋白減少，更容易被降解。

圖4 OVT 在體外模擬嬰幼兒胃液消化不同pH 值的產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b，c）圖譜Fig.4 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b，c） of ovotransferrin digested by simulated infant gastric juice in vitro at different pH values

圖5 OVT 在體外模擬成年人胃液消化不同pH 值的產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）圖譜Fig.5 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated adult gastric juice in vitro at different pH values

圖4說明OVT 在pH 1.5～3.0 條件下，嬰幼兒模擬胃液中可被完全消化，在pH 3.5 條件下少部分發(fā)生消化，其中最易消化pH 值為2.5。

2.2.2.2 胃液pH 值對模擬成年人胃液消化OVT的影響 據(jù)文獻[31]報道，成人胃在禁食狀態(tài)下的pH 值通常為1.7～1.9。本試驗設置成年人模擬胃液pH 值范圍為1.0～3.0，消化產(chǎn)物分析圖見圖5。圖5a 中，OVT 在pH 1.0～3.0 條件下均可發(fā)生降解。當pH 值為1.0～1.5 時，OVT 被消化為8，10 ku的蛋白；隨著pH 值升至2.5，10 ku 處條帶逐漸變淺直至消失；pH 3.0 時，胃蛋白酶的活力受pH 值的影響而較弱，OVT 被酶解的程度較低，生成30 ku 的大分子片段。相同pH 值條件下，嬰幼兒胃消化產(chǎn)物種類比成年人的多，尤其在pH 3.0 時，嬰幼兒胃消化產(chǎn)物條帶分布在10～30 ku，遠大于成年人的消化產(chǎn)物范圍5～10 ku。這與成年人模擬胃液中胃蛋白酶的酶活度較高有關。因此，在相同pH 值的胃消化條件下，成年人消化能力較嬰幼兒更強。圖5b 中，成年人模擬胃液pH 值為1.0～1.5時，OVT 消化產(chǎn)物基本相同，而對應離子峰強度不同；在pH 2.0 時，產(chǎn)物種類明顯減少，較大分子質量蛋白質發(fā)生降解，且在pH＞2.0 條件下，均生成5.3，5.5 ku 蛋白。因此，在pH 1.0～3.0 的消化環(huán)境中，pH 值的升高使OVT 被消化成小分子產(chǎn)物的含量有所增加。這是因為隨著pH 值的升高，胃蛋白酶形成較少，酶活受到部分抑制，導致蛋白消化能力有所降低[30]。產(chǎn)物5.5 ku 處蛋白未因pH 值的變化發(fā)生降解，較耐消化。

圖5結果表示，在pH 1.0～3.0 范圍內(nèi)模擬成年人胃消化，OVT 胃消化產(chǎn)物種類隨著pH 值的升高而減少，pH 2.0 時，OVT 最易被消化，這與胃蛋白酶在pH 2.0 附近具有最大活性密切相關[32]。Dekkers 等[33]的試驗也表明在一定范圍內(nèi)，pH 值越高消化能力越弱，pH 值越低越有利于食物蛋白消化。比較相同pH 值條件的嬰幼兒及成年人胃消化結果，可知嬰幼兒胃消化產(chǎn)物種類多且分子質量相對偏大；嬰幼兒與成年人胃消化不同時間、不同pH 值條件下均生成較耐消化的5.5 ku 蛋白，該片段值得進一步研究。

2.3 體外模擬嬰幼兒和成年人小腸液中的消化

腸道是食物消化的主要部位，食物經(jīng)胃消化后，其產(chǎn)物進入小腸，并通過胰蛋白酶和膽汁分泌物的協(xié)同作用進行消化過程[34]。Bourlieu 等[26]詳細研究了嬰兒和腸道狀況的生化差異，Poquet 等[32]也提到消化道不成熟致使嬰幼兒胰蛋白酶消化能力有限。根據(jù)2.2.2 節(jié)的結果，OVT 分別在嬰幼兒和成年人最易消化的pH 值條件下胃消化1 h，再進行小腸消化，以此探討不同腸消化時間內(nèi)OVT被消化的特點。

2.3.1 不同消化時間對體外模擬嬰幼兒腸消化的影響 OVT 經(jīng)嬰幼兒模擬胃液（pH 2.5） 消化1 h，小腸消化不同時間的產(chǎn)物分析圖見圖6。圖6a中，胃-小腸消化后的產(chǎn)物分子質量大小在3.4～10 ku 之間，較OVT 的胃消化產(chǎn)物明顯發(fā)生進一步酶解。隨著消化時間的延長，胃-小腸消化產(chǎn)物中分子質量偏大的產(chǎn)物含量被進一步消化分解，如10 ku 處條帶在消化120 min 時顏色變淺。圖6b 中，不同消化時間條件下的胃-小腸消化產(chǎn)物基本相同，產(chǎn)物分子質量分布在0.5～1.0 ku，其中0.495，0.559，0.638 ku 等肽段受消化時間影響較小，較耐消化。

圖6 OVT 在體外模擬嬰幼兒腸液消化不同時間的產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）圖譜Fig.6 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated infant intestinal fluid in vitro at different times

2.3.2 不同消化時間對體外模擬成年人腸消化的影響 OVT 經(jīng)成年人模擬胃液（pH 2.0）消化1 h，小腸消化不同時間的產(chǎn)物分析圖見圖7。與圖6a 相比，圖7a 中成年人胃-小腸消化產(chǎn)物分子質量較小，基本分布在5～10 ku。小腸消化0 min 時條帶呈彌散狀態(tài)，7 ku 處有一條較為清晰的細條帶；隨著消化時間的延長，該條帶逐漸被降解。圖7b 中顯示成年人的OVT 胃-小腸消化產(chǎn)物存在分子質量＜1 ku 的肽。小腸消化時間對OVT 胃消化產(chǎn)物被進一步酶解的影響較小，且不同時間消化形成產(chǎn)物基本相同，主要生成0.495，0.560，0.638 ku 及0.666 ku 的小分子肽。

比較圖6及圖7可知，嬰幼兒胃-小腸產(chǎn)物分子質量范圍相對較大，生成片段也相對較多，說明嬰幼兒小腸消化能力相對較弱；OVT 在嬰幼兒及成年人胃液-小腸液消化后均生成0.495，0.560，0.638 ku 較耐消化的多肽，且消化時間對腸消化產(chǎn)物影響較小。Picariello 等[35]表示腸道消化基本在2 h 內(nèi)完成，在較長的孵育時間內(nèi)肽型未發(fā)生明顯變化。

2.4 體外模擬嬰幼兒及成年人BBM 酶消化

經(jīng)過胃消化的食糜進人小腸后，在胰酶作用下產(chǎn)生可吸收的終產(chǎn)物，通過上皮細胞刷狀緣膜上表達的水解酶將腸腔里的養(yǎng)分進一步消化[36]。有報道指出[16]，食物蛋白質經(jīng)過腸腔內(nèi)消化后形成的大量寡肽發(fā)生進一步水解時，其中大部分二肽和少量三肽經(jīng)轉運后由細胞漿肽酶水解，而約10%二肽、60%三肽及幾乎全部三肽以上的寡肽均由BBM 酶水解，最后形成氨基酸。

圖7 OVT 在體外模擬成年人腸液消化不同時間的產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）圖譜Fig.7 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated adult intestinal fluid in vitro at different times

OVT 經(jīng)過嬰幼兒和成年人胃、小腸分別消化后，加入BBM 酶進一步消化得到終消化產(chǎn)物，其分析圖見圖8。圖8a 泳道1 中，嬰幼兒胃-小腸消化產(chǎn)物分子質量為3.4～10 ku，30～50 ku，再經(jīng)BBM 酶消化后30～50 ku 處條帶數(shù)量明顯減少，顏色變淺，僅剩5～13 ku 范圍內(nèi)少數(shù)條帶。圖8a 泳道2 顯示，成年人胃-小腸消化產(chǎn)物分子質量分布范圍為5～10 ku，經(jīng)BBM 酶進一步消化后幾乎沒有條帶，說明OVT 被消化的較為徹底。圖8b 中，嬰幼兒和成年人的OVT 終消化產(chǎn)物分子質量集中在0.4～0.7 ku 范圍內(nèi)，0.560 ku 肽段含量均最多，而嬰幼兒消化產(chǎn)物的種類居多，其中最大分子質量產(chǎn)物為0.680 ku，超過成年人產(chǎn)物中最大分子質量產(chǎn)物（0.666 ku）。再結合圖6、圖7對比可知，0.495，0.560，0.638 ku 處片段較耐酶消化，且嬰幼兒終消化產(chǎn)物中含有耐消化的大分子蛋白，可以推測嬰幼兒更易發(fā)生OVT 的腸道黏膜免疫致敏。

OVT 經(jīng)過胃、小腸消化后，增加BBM 酶消化可明顯增強嬰幼兒及成年人胃-小腸消化產(chǎn)物的進一步酶解，該結論與其它研究報道相同。Picariello 等[37]發(fā)現(xiàn)加入BBM 酶后，牛奶蛋白水解程度高達80%，由此提出在體外模擬食物蛋白消化時應增加BBM 酶消化階段。Mamone 等[38]也證實十二指腸消化肽可被BBM 腸上皮細胞的內(nèi)/外肽酶進一步水解為單一氨基酸或短的雙或三肽。Gianfrani 等[39]表示在模擬腸消化后增加BBM 酶消化可以降低醇溶蛋白的免疫刺激活性。游義嬌[30]在麩質蛋白消化中加入BBM 酶消化過程，終消化產(chǎn)物中麩質含量降低，小麥蛋白的水解度明顯提高。

圖8 OVT 在體外模擬嬰幼兒及成年人BBM 酶消化產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）圖譜Fig.8 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated infant and adult BBM in vitro

目前有關蛋白質在體外模擬消化方法多參照美國藥典的模擬胃腸消化，或采用傳統(tǒng)的口腔-胃-腸3 步消化法，然而這些模擬消化模型提供的信息有限，只能評估蛋白質（或大多肽）的消化率，即消化穩(wěn)定性，而忽略了腸黏膜水解酶在人體生理學中的作用[40]。結合解剖學及生理學等多方面數(shù)據(jù)，有研究[40]提出BBM 酶可輔助食物最終消化，有利于蛋白質在人體胃腸道中的消化和吸收，且在最終消化階段發(fā)揮關鍵功能，尤其是將多肽逐漸縮短為寡肽和游離氨基酸[41]。Minekus 等[42]通過對人體生理條件的分析，將BBM 酶的消化過程也納入多種食物通用的標準化靜態(tài)體外消化模型中，目前是國際公認的一種標準化的消化模式。因此，在研究體外模擬胃腸消化蛋白質時，應加入BBM 酶消化階段以研究其在腸道消化中的降解作用。

3 結論

本文通過模擬嬰幼兒及成年人胃液、小腸液及小腸刷狀緣膜酶（BBM 酶）的體外靜態(tài)消化環(huán)境，發(fā)現(xiàn)雞蛋蛋清過敏原卵轉鐵蛋白（OVT）在嬰幼兒和成年人消化體系中均可被降解。在模擬嬰幼兒消化體系中，OVT 胃消化產(chǎn)物分子質量范圍為5～15 ku 和30～50 ku，進一步經(jīng)小腸消化后的產(chǎn)物分布在0.4～10 ku，最后經(jīng)小腸刷狀緣膜酶消化生成0.5～0.7 ku 肽段及部分5～13 ku 蛋白。OVT經(jīng)模擬成年人胃消化的產(chǎn)物分子質量范圍與模擬嬰幼兒的一致，胃-小腸消化主要生成0.5～0.8 ku肽段，再經(jīng)小腸刷狀緣膜酶消化生成0.5～0.7 ku肽段。此外，OVT 在胃液pH 值低于3.0 時可被消化，其在嬰幼兒和成年人胃消化中最易消化的pH值分別為2.5，2.0；隨著消化時間的延長，OVT 在模擬胃液中逐漸降解，可生成5.5 ku 耐胃消化片段，然而在模擬小腸液中，未隨時間發(fā)生顯著變化，生成0.495，0.560，0.638 ku 較耐腸、耐BBM 酶消化的多肽。這些耐消化片段均值得進一步研究。

試驗表明成年人消化能力相對較強，而嬰幼兒消化能力則較弱，導致OVT 經(jīng)嬰幼兒胃、小腸及BBM 酶消化后，產(chǎn)物中仍含有耐消化的大分子蛋白，提示更易發(fā)生OVT 過敏。另外，該研究初步揭示了OVT 體外胃腸消化的規(guī)律，為進一步明確OVT 耐胃腸消化片段與致敏性的關系提供了良好的工作基礎。