鄭振霄，戴志遠(yuǎn)*，彭 茜

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江工商大學(xué) 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310012 3 浙江工商大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 杭州310012）

海豹（Phoca hispida）是對(duì)鰭足亞目種海豹科動(dòng)物的統(tǒng)稱。海豹主要分布在寒冷的兩極海域，大體分成北方的海豹亞科和南方的僧海豹亞科2類，其中海豹亞科分布基本限于北半球，而僧海豹亞科在2 個(gè)半球均有分布。極寒的生存環(huán)境，使得海豹脂肪組成具有特異性。一個(gè)最大的特征就是n-3 多不飽和脂肪酸（n-3PUFA）含量高。研究表明n-3PUFA 在促進(jìn)炎癥消退，調(diào)節(jié)體內(nèi)脂代謝，增強(qiáng)免疫力等方面具有積極作用。此外，海豹脂肪組織中還含有一種魚體中罕有的增效因子——DPA，可以一定程度上增強(qiáng)EPA 等n-3PUFA 的功效。海豹油提取自海豹脂肪組織的液體脂肪油，在常溫下呈淡黃色，具有重大開發(fā)潛力[1-4]。

海豹油中n-3PUFA（EPA，DPA，DHA）的含量通常在20%左右，在此濃度所起到的保健功能非常有限，通常情況下，只有含量在70%以上，n-3PUFA 的保健功能才能得到充分發(fā)揮，因此有必要采取一定技術(shù)手段對(duì)其中的n-3PUFA 進(jìn)行富集。由于油脂的天然存在形式是甘油三酯，而甘油三酯的沸點(diǎn)較高，且其所連接的脂肪酸具有異質(zhì)性，使得n-3PUFA 的富集存在較大阻礙，乙酯化油則可以有效回避上述阻礙，適合作為制備高純度n-3PUFA 的原料[5]。對(duì)于酯化油來講，尿包法和分子蒸餾法是比較常用的n-3PUFA 富集方法，尿素包合法是依據(jù)不同脂肪酸碳鏈的平均直徑程度來分離的方法，而分子蒸餾法是根據(jù)不同脂肪酸在真空狀態(tài)下，揮發(fā)性不同而進(jìn)行分離的方法，這2 種富集方法的共同特點(diǎn)就是操作簡便，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)[6]。

目前，對(duì)于尿包法和分子蒸餾法的研究主要集中在工藝參數(shù)的優(yōu)化和反應(yīng)條件的改善2 個(gè)方面。Zhang 等[7]以裂殖壺藻油乙酯為原料，利用分子蒸餾技術(shù)對(duì)其中的n-3PUFA 進(jìn)行富集，結(jié)果表明，在蒸發(fā)溫度110.4 ℃，進(jìn)料速率78.7 mL/h，刮板轉(zhuǎn)速350 r/min，壓力10 Pa 的條件下，重相中n-3PUFA 含量可達(dá)92.98%。Zheng 等[8]采用尿素包合法對(duì)海豹油乙酯中的n-3PUFA 進(jìn)行富集，采用響應(yīng)面法優(yōu)化富集條件（尿酯比、結(jié)晶溫度和結(jié)晶時(shí)間），最終得到n-3PUFA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71.35%的脂肪酸乙酯混合物，得率為82.31%。林文等[9]采用尿素包合法和分子蒸餾法對(duì)乙酯型魚油中的EPA和DHA 進(jìn)行富集，結(jié)果表明，在最優(yōu)條件下，EPA和DHA 的總純度達(dá)78.90%，回收率為49.00%。關(guān)于尿包和分子蒸餾對(duì)油脂品質(zhì)及揮發(fā)性物質(zhì)影響的研究較為少見。本文以海豹油乙酯為原料，采用尿包法和分子蒸餾法對(duì)其中的n-3PUFA 進(jìn)行富集，并通過理化分析、氣相色譜（GC）及頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）等技術(shù)研究尿包法和分子蒸餾法對(duì)海豹油乙酯品質(zhì)、脂肪酸組成及揮發(fā)性物質(zhì)的影響，以期為功能性海豹油生產(chǎn)過程中的品質(zhì)控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海豹油乙酯，舟山市奧旭魚油制品有限公司；正己烷、乙醇等，國藥集團(tuán)；脂肪酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品，上海安普科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器，常州國華電器有限公司；分子蒸餾器，天津堯舜分子蒸餾設(shè)備有限公司；水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；7890B 氣相色譜儀，美國Agilent 公司；Trace GC Ultra 氣相色譜與DSQ Ⅱ質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 尿素包合法聯(lián)合分子蒸餾法富集n-3PUFA

尿素包合法的主要工藝參數(shù)：尿酯比2.38∶1，冷卻溫度15 ℃，時(shí)間2.5 h，分子蒸餾法的主要工藝參數(shù)：進(jìn)樣量250 g，蒸餾溫度90 ℃，壓力2.0 Pa。具體操作流程參考文獻(xiàn)[10]所述方法。

1.4 品質(zhì)指標(biāo)的測定

品質(zhì)指標(biāo)包括水分及揮發(fā)物、酸價(jià)、皂化值、過氧化物值和碘值，測定方法參考文獻(xiàn)[11]所述。

1.5 脂肪酸組成的測定

采用氣相色譜檢測，檢測條件參考文獻(xiàn)[11]所述。

1.6 揮發(fā)性物質(zhì)的測定

揮發(fā)性物質(zhì)的萃取采用頂空固相微萃取技術(shù)，揮發(fā)性物質(zhì)種類和相對(duì)含量的測定由GC-MS完成[12-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 品質(zhì)指標(biāo)

富集過程中海豹油的品質(zhì)指標(biāo)變化如表1所示。酯化油、尿包油和分子蒸餾油中的水分及揮發(fā)性物質(zhì)的含量分別為0.48%，1.66%和0.21%。由于尿包過程中涉及到“水洗”，這一過程會(huì)明顯增加樣品中的水分含量，分子蒸餾是在高真空和較高溫度條件下實(shí)施的分離方法，水和一些低沸點(diǎn)的化合物會(huì)在這一過程中被去除。油脂是疏水性的物質(zhì)，一般情況下油水不易混溶，而油脂中的磷脂、固醇等雜質(zhì)能吸收水分，并形成膠體物質(zhì)懸浮在油脂中，油脂中的水分和揮發(fā)性物質(zhì)含量過多，會(huì)促進(jìn)油脂中解脂酶的活動(dòng)以及微生物的生長、繁殖，加快油脂的水解和酸敗[14-15]。酸價(jià)是指中和1 g 油脂中游離脂肪酸所需KOH 的質(zhì)量，是反映油脂品質(zhì)的主要技術(shù)指標(biāo)之一，酸價(jià)越高，油脂水解越嚴(yán)重，品質(zhì)越差[16]。酯化油、尿包油及分子蒸餾油的酸價(jià)分別為0.84，0.79，0.81 mg KOH/g，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示三者之間沒有顯著差別（P＜0.05），這說明尿包法和分子蒸餾法對(duì)海豹油乙酯的酸價(jià)沒有影響，并且在整個(gè)n-3PUFA 的富集操作過程中酸價(jià)始終保持在較低水平。華盛頓責(zé)任營養(yǎng)委員會(huì)規(guī)定功能油脂中的酸價(jià)限量為＜3 mg KOH/g，說明在整個(gè)富集過程中，海豹油的酸價(jià)始終維持在較低水平。油脂的皂化值是油脂本身的特性，是完全造化1 g 油脂所需的KOH 的mg 數(shù)，是油脂中脂肪酸平均鏈長的量度，與油脂的平均分子質(zhì)量緊密相關(guān)[10]。酯化油、尿包油和分子蒸餾油的皂化值分別為177.73，200.48，250.53 mg KOH/g，呈逐漸增大的趨勢，這是因?yàn)樵谀蛩匕虾头肿诱麴s過程中，結(jié)構(gòu)簡單的直鏈脂肪酸和沸點(diǎn)較低的脂肪酸會(huì)被分離，長鏈的結(jié)構(gòu)復(fù)雜并且具有較高沸點(diǎn)的脂肪酸通常具有較大的平均分子質(zhì)量，表觀反映為皂化值的不斷增大。油脂過氧化物值是判斷油脂及其制品氧化程度的重要指標(biāo)，主要反映油脂中氫過氧化物的含量，是評(píng)價(jià)油脂品質(zhì)的重要依據(jù)。酯化油、尿包油和分子蒸餾油的過氧化物值分別為4.22，4.25，4.35 meq/kg，三者之間沒有顯著差異，說明尿包和分子蒸餾對(duì)樣品的過氧化值的影響不大。碘值反映油脂不飽和程度，酯化油的碘值為116.63 g I2/100g，小于尿包油（163.73 g I2/100 g），尿包油小于分子蒸餾油（200.89 g I2/100g）。結(jié)果表明，隨著尿包和分子蒸餾操作的進(jìn)行，樣品的不飽和度越來越大，說明尿包法和分子蒸餾法是富集n-3PUFA 的有效手段。

表1 富集過程中的品質(zhì)指標(biāo)變化Table 1 The change of quality index during enrichment

2.2 脂肪酸組成

n-3PUFA 富集過程中脂肪酸的組成變化如圖1所示。酯化油中的脂肪酸組成比較復(fù)雜，含有多種不同種類的脂肪酸。其中，單不飽和脂肪酸（MUFA）含量最高達(dá)48.32%，飽和脂肪酸（SFA）和n-3PUFA 的含量較為接近，分別為24.15%和22.05%，相似的結(jié)果也出現(xiàn)在Durnford 等[17]的報(bào)道中。SFA 中，棕櫚酸（C16：0）的含量最高，為13.72%，其次為肉豆蔻酸（C14：0），6.64%；MUFA 中，油酸（C18：1）的含量最高，達(dá)到21.74%，其次為棕櫚油酸（C16：1），15.11%。n-3PUFA 中，DHA 的含量最高，為9.33%，其次為EPA（8.87%），DPA 的含量為3.85%。

尿包油中SFA，MUFA 和n-3PUFA 的含量分別為4.22%，24.81%和62.52%。相比于原料油，SFA 含量下降最為顯著（下降到起始含量的1/5），MUFA 含量下降也較明顯（下降至起始含量的1/2），PUFA 含量大幅度增加（約為起始含量的3倍）。對(duì)比不同種類脂肪酸的含量變化可以看出，尿包法可以有效去除樣品中的SFA。然而，對(duì)于某些長鏈MUFA 的分離效果來講，作用有限，尤其是C16：1（11.56%），C18：1（7.61%）和C20：1（5.64%），仍 占據(jù)較大比例。DHA、EPA 和DPA 的含量顯著升高，分別為起始值的2.91，2.87，2.57 倍，可以看出，尿素包合法對(duì)DHA 和EPA 的富集效果要好于DPA，然而，兩者之間的差別不大。在尿素六面體結(jié)構(gòu)形成結(jié)晶過程中，飽和脂肪酸由于其碳鏈為直鏈結(jié)構(gòu)，容易形成尿素絡(luò)合物而被分離，而高不飽和脂肪酸由于其含有多個(gè)雙鍵，碳鏈彎曲程度高，很難被晶體結(jié)構(gòu)包合而得到富集，并且這種富集效果會(huì)隨著結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度增加而增強(qiáng)[18]。DHA、EPA 和DPA 是二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸的簡稱，按結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度排序?yàn)镈HA＞DPA＞EPA。然而從數(shù)據(jù)上看，DPA的富集效果遜于EPA，可能與原料中DPA 的含量較低有關(guān)，原料中DHA 和EPA 的含量較為接近，而DPA 的含量遠(yuǎn)低于另外兩者。

分子蒸餾后的樣品中共檢測到5 種脂肪酸，分別是C20：1（4.68%），C22：1（2.21%），EPA（17.37%），DPA（21.24%）和DHA（54.35%）。尿包后殘存的SFA 經(jīng)過分子蒸餾已被完全去除，MUFA 中C16：1和C18：1的含量也被降低至檢測限以下，只有少部分分子質(zhì)量較大的MUFA（C20：1和C22：1），然而其含量也都在5%以下。對(duì)于EPA、DPA 和DHA 來講，EPA 含量出現(xiàn)大幅下降，從25.44%降低到17.37%，DHA 和DPA 的含量大幅提升，分別由27.15%，9.93%提高到54.35%和21.24%，增幅為1.00 倍和1.14 倍。對(duì)于三者含量在分子蒸餾過程中的不同表現(xiàn)，可以解釋為EPA 的分子質(zhì)量與其它兩者差別較大，導(dǎo)致其沸點(diǎn)最低，分子自由程最低，因此在蒸發(fā)和冷凝過程中會(huì)先于其它兩者被分配到輕相中，EPA 含量降低導(dǎo)致其它2 者含量上升。

2.3 揮發(fā)性物質(zhì)

HS-SPME-GC-MS 是測定揮發(fā)性物質(zhì)的一種常用手段，既具有準(zhǔn)確性高，選擇性好，鑒別能力強(qiáng)的特點(diǎn)，又具有所需樣品少，靈敏度高的特點(diǎn)[19]。許多學(xué)者都采用該方法研究油脂中的揮發(fā)性物質(zhì)。王亞男等[20]采用GC-MS 方法研究超臨界萃取得到的金槍魚油中的揮發(fā)性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)魚油中的主要揮發(fā)性物質(zhì)為酸類、醛類、烴類、酮類及一些雜環(huán)化合物。李文佳[21]利用GC-MS 測定淡水魚油中的揮發(fā)性物質(zhì)，分析結(jié)果表明醛類是淡水魚油中的主要揮發(fā)性物質(zhì)，占總揮發(fā)性物質(zhì)的45.26%。

圖1 富集過程中脂肪酸組成變化Fig.1 The fatty acids composition changes during the enrichment

圖2 富集過程中揮發(fā)性物質(zhì)種類變化Fig.2 The types of volatile substances changesduring the enrichment

本試驗(yàn)采取HS-SPME-GC-MS 方法對(duì)酯化油、尿包油和分子蒸餾油中的揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量進(jìn)行測定，并對(duì)不同種類揮發(fā)性物質(zhì)的峰數(shù)量和峰面積進(jìn)行分析。海豹油中揮發(fā)性物質(zhì)的種類及數(shù)量如圖2所示，海豹油酯化油、尿包油及分子蒸餾油中檢測到的有效成分分別為40，42，41種，酯化油中檢測到種類較多的物質(zhì)是酮類（10種）、醛類（8 種）、烴類（7 種），而尿包油中種類較多的物質(zhì)為醇類（10 種）、醛類（8 種）、烴類（8種），分子蒸餾后的樣品中檢測到種類較多的物質(zhì)為醇類（10 種）、酮類（9 種）、醛類（7 種）。根據(jù)檢測到揮發(fā)性物質(zhì)的種類、數(shù)來看，尿包法和分子蒸餾法對(duì)海豹油乙酯中的揮發(fā)性物質(zhì)的影響不是很大，并且樣品中風(fēng)味物質(zhì)多數(shù)被鑒定為醛類、酮類、醇類和烴類。

酯化油、尿包油和分子蒸餾油中的揮發(fā)性物質(zhì)的種類及相對(duì)含量如圖3～圖5所示。酯化油、尿包油及分子蒸餾油中揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積分別為71.66%，84.69%，63.66%，尿包后樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積出現(xiàn)了較大幅度的上升，而分子蒸餾后揮發(fā)性物質(zhì)的面積又明顯下降，并且低于酯化油的總峰面積。尿包過程中會(huì)使用較多的有機(jī)試劑和尿素，這些物質(zhì)在加熱的條件下容易發(fā)生分解反應(yīng)，生成易揮發(fā)的物質(zhì)，使得尿包樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積增加，而分子蒸餾是在高真空度、較高溫度下分離，這樣的操作條件使得一些低沸點(diǎn)的物質(zhì)被分離到輕相從而被去除，使得重相中樣品的揮發(fā)性物質(zhì)含量減少，因此，分子蒸餾技術(shù)不僅可以用作n-3PUFA 的富集，還可用于油脂生產(chǎn)過程中的脫臭、脫色環(huán)節(jié)。

圖3 酯化油中揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量Fig.3 The relative content of volatile substances in the ethyl esters

圖4 尿包油中揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量Fig.4 The relative content of volatile substances in the ethyl esters of urea complexation

圖5 分子蒸餾油中揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量Fig.5 The relative content of volatile substances in the ethyl esters of molecular distillation

酯化油中相對(duì)含量最多的揮發(fā)性物質(zhì)為醛類，占20.44%，其中貢獻(xiàn)較大的是十一醛（5.98%）、壬醛（4.15%）和2，4-庚二烯醛（3.14%）；其次是酮類，占17.77%，其中貢獻(xiàn)較大的有2-庚酮（4.56%）、2-壬酮（3.97%）、3，5-辛二烯-2-酮（2.62%）；酯化油中烴類的相對(duì)含量為11.99%，貢獻(xiàn)較大的有乙烯（3.92%）、2，6，10-三甲基十四烷（3.23%）和2，6，10-三甲基十六烷（2.10%）。尿包油中相對(duì)含量最多的揮發(fā)性物質(zhì)為醇類，占30.11%，其中貢獻(xiàn)較大的為十五碳烯醇（14.42%）、乙醇（6.40%）和2-乙基己醇（3.98%）；其次為醛類，占18.24%，貢獻(xiàn)較大的有壬醛（6.16%）、2，4-庚二烯醛（4.00%）和十一醛（3.52%）；再次為酮類，占13.98%，其中貢獻(xiàn)較大的有2-庚酮（3.78%）、2-羥基環(huán)十五酮（3.69%）和3，5-辛二烯-2-酮（3.69%）。分子蒸餾油中相對(duì)含量較多的揮發(fā)性物質(zhì)為烴類（15.79%）、醛類（15.47%）和醇類（15.34%），其中貢獻(xiàn)較大的有8-甲基癸烷（3.55%）、7-亞丙基-二環(huán)庚烷（3.32%）、1-丙基環(huán)己烯（2.94%）、2，4-庚二烯醛（8.83%）、壬醛（1.98%）、十一醛（1.76%）、乙醇（3.03%）、1-戊烯-3-醇（2.62%）、表藍(lán)桉醇（1.78%）。

樣品中的烴類化合物主要來自烷基自由基的脂肪酸自氧化，盡管烴類在3 種樣品中都占有一定比例，而這些物質(zhì)的感覺閾值較大，對(duì)樣品整體揮發(fā)性風(fēng)味的影響不大[22]。醛類、酮類和醇類是烴類化合物不同氧化階段的不同產(chǎn)物，這些物質(zhì)通常具有較低的感覺閾值，對(duì)樣品的主體風(fēng)味有著很重要的影響[23]。酯化油、尿包油和分子蒸餾油中醛類、酮類和醇類物質(zhì)的含量分別為52.80%，62.33%和39.92%，尿包之后三者的相對(duì)含量顯著升高，而分子蒸餾之后又顯著下降，并且低于酯化油原料。這一結(jié)論與前文總峰面積變化的結(jié)論具有一致性，在這一過程中變化較大的風(fēng)味物質(zhì)主要有乙醇（3.99%，6.40%，3.03%）、2-乙基己醇（1.25%，3.98%，1.12%）、十五碳烯醇（0.78%，14.42%，1.61%）、壬醛（4.15%，6.16%，1.98%）、十一醛（5.98%，3.52%，1.76%）、3，5-辛二烯-2-酮（2.62%，3.26%，2.86%）、2-壬酮（3.97%，3.25%，1.57%）、2-庚酮（4.56%，3.78%，1.85%）。2-乙基己醇是一種無色液體，本身對(duì)樣品的主體風(fēng)味影響較小，而2-乙基己醇可通過乙醛縮合制得，與樣品中乙醛含量具有較大關(guān)聯(lián)。壬醛是一種無色油狀液滴，具有玫瑰、柑橘等香氣，有強(qiáng)烈的油脂氣味，存在于紅茶、綠茶、煙葉中。十一醛廣泛存在于甜橙、檸檬等柑橘水果中，具有脂蠟氣和甜橙玫瑰花香，略有甜味，可通過十一醇氧化，或十一酸催化還原制得，亦可通過十一烯酸甲酯加氫后得十一醇催化脫氫制得。廣泛應(yīng)用在化妝品、皂用香精中。3，5-辛二烯-2-酮具有特殊的皂香、蠟香和奶油香，在油脂含量高的食物中分布較廣。2-壬酮是一種無色至淡黃色液體，具有甜香、果香、奶油香，天然存在于香料、煙葉、草莓、干酪、生姜中，是一種常用食品香味劑，可用做溶劑、有機(jī)合成中間體或制備香料物質(zhì)。2-庚酮又稱甲基戊基酮，是一種無色液體，有類似梨的水果香味，溶于水，廣泛用于工業(yè)溶劑、纖維、醫(yī)藥、農(nóng)藥、香料化工等領(lǐng)域。

3 結(jié)論

尿包和分子蒸餾過程中，伴隨著n-3PUFA 含量的不斷升高，樣品的平均分子質(zhì)量、不飽和度均大幅增加，表現(xiàn)為皂化值和碘值的不斷升高，兩者變化過程分別為177.73，200.48，250.53 mg KOH/g和116.63，163.73，200.89 g I2/100 g。尿包過程涉及到“水洗”，所以樣品經(jīng)尿包后水分及揮發(fā)性物質(zhì)含量顯著升高（0.48%升至1.66%），而分子蒸餾是在高真空度，較高溫度下操作，可以有效降低樣品中的水分及揮發(fā)性物質(zhì)的含量（1.66%降至0.21%）。尿包和分子蒸餾操作對(duì)樣品的酸價(jià)和過氧化物值的影響不顯著。酯化油原料中MUFA 的含量最高為48.32%，SFA 和n-3PUFA 的含量較為接近，分別為24.15%和22.05%。尿包后樣品中的SFA 含量大幅度下降（4.22%），MUFA 含量也明顯下降，而某些長鏈MUFA 仍占據(jù)較大比例，如C16：1（11.56%），C18：1（7.61%）和C20：1（5.64%）。分子蒸餾可以有效分離SFA 和MUFA，得到含量高達(dá)92.96%的n-3PUFA 濃縮產(chǎn)物。酯化油、尿包油和分子蒸餾油中分別檢測到40，42，41 種揮發(fā)性物質(zhì)，揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積分別為71.66%，84.69%，63.66%，結(jié)果表明，尿包可以顯著增加樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的含量，而分子蒸餾則可以顯著降低揮發(fā)性物質(zhì)的含量，而尿包和分子蒸餾對(duì)樣品中揮發(fā)性物質(zhì)種類影響不大。其中，變化較大的揮發(fā)性物質(zhì)主要為乙醇（3.99%，6.40%，3.03%）、2-乙基己醇（1.25%，3.98%，1.12%）、十五碳烯醇（0.78%，14.42%，1.61%）、壬 醛（4.15%，6.16%，1.98%）、十一醛（5.98%，3.52%，1.76%）、3，5-辛二烯-2-酮（2.62%，3.26%，2.86%）、2-壬酮（3.97%，3.25%，1.57%）、2-庚酮（4.56%，3.78%，1.85%）。