李紅建，秦丹丹，姜曉輝，方開星，王秋霜，潘晨東，李波，王青，吳華玲

廣東苦茶資源嘌呤生物堿含量分析與評價

李紅建，秦丹丹，姜曉輝，方開星，王秋霜，潘晨東，李波，王青，吳華玲*

廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點實驗室，廣東 廣州 510640

以13份廣東省境內(nèi)收集的苦茶資源為研究對象，來自不同省份的28份代表性品種（系）為對照，分析苦茶資源中嘌呤生物堿含量特征。結(jié)果顯示，咖啡堿、可可堿、苦茶堿及生物堿總量均表現(xiàn)出較大的遺傳差異，遺傳多樣性指數(shù)（）為0.78~1.94，變異系數(shù)（）為34.89%~191.19%。系統(tǒng)聚類分析將試驗材料分為6個類群，類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ主要為常規(guī)品種（系），咖啡堿是其優(yōu)勢嘌呤堿；類群Ⅴ為低咖啡堿的南昆山毛葉茶；類群Ⅳ、Ⅵ全部為苦茶資源，苦茶堿含量較高。通過綜合評價，從苦茶資源中篩選出生物堿含量特異的育種材料10份。此外，不同葉位含量分析表明，苦茶中苦茶堿隨葉片成熟度增加呈緩慢降低趨勢，至成熟葉期仍維持較高水平。研究結(jié)果為今后嘌呤生物堿含量特異的功能性苦茶品種培育及開發(fā)利用提供了依據(jù)。

苦茶；嘌呤生物堿；種質(zhì)資源；遺傳多樣性；聚類分析

苦茶作為一類特殊的茶樹資源，因其干茶味極苦而得名，早期多以野生茶樹形式存在，具有一定的藥理作用[1]?？嗖柙谖覈饕植荚诨洝⑾?、贛毗鄰區(qū)，尤其以南嶺山脈兩側(cè)居多，在云南紅河、西雙版納等地也有分布[2-3]。江華苦茶是研究較多的一類苦茶，研究者認為其與云南大葉茶親緣關(guān)系較近，是由云南大葉演變到灌木型小葉種的一類過渡類型[4-5]。王新超等[1]分析了來自廣東、湖南、江西等地苦茶資源的主要生化成分，將苦茶與阿薩姆種聚為一類，并認為苦茶是比較適合制作紅茶的資源。上世紀八十年代發(fā)現(xiàn)的生長在云南東南部紅河州的野生大葉種苦茶[6]，被石祥剛等[7]升格為獨立的種。

茶葉中嘌呤生物堿是決定茶葉品質(zhì)的關(guān)鍵成分之一，有多種生理功效[8-12]。常規(guī)茶葉中咖啡堿（Caffeine）為優(yōu)勢嘌呤生物堿，約占茶葉干重的2%~5%，可可堿（Theobromine）和茶堿（Theophylline）含量極低，約為0.05%和0.002%[13]。前人對苦茶資源生物堿也進行了較多研究。楊春等[14]對江華苦茶資源生物堿測定發(fā)現(xiàn)其咖啡堿和可可堿含量較高；唐琴等[15]對福建尤溪苦茶分析發(fā)現(xiàn)，其含有3種生物堿（咖啡堿、可可堿、茶堿），含量稍高于對照，但分布模式與常規(guī)茶基本一致；葉創(chuàng)興等[16-17]報道了云南紅河苦茶存在一種新的生物堿分布模式，苦茶堿（Theacrine）是其優(yōu)勢嘌呤堿，含量高達1.29%，其次是咖啡堿和可可堿；楊超等[18]對云南西雙版納州的苦茶特征成分進行研究，發(fā)現(xiàn)具有特征性成分的苦茶堿是導(dǎo)致該類苦茶滋味極苦的主要原因。由此可見，不同地區(qū)的苦茶在嘌呤生物堿的含量及分布模式上存在較大差異，有待對更多類型的苦茶資源進行進一步發(fā)掘。

廣東地處熱帶、亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，良好的氣候和生態(tài)系統(tǒng)蘊含了眾多獨特的茶樹資源，如白毛茶、鳳凰單叢茶、可可茶、客家小葉種及苦茶資源[19-20]。至今，針對廣東境內(nèi)苦茶資源研究報道較少。本課題組前期對廣東省境內(nèi)苦茶資源進行了廣泛調(diào)查，并收集了13份苦茶資源。本研究以國內(nèi)不同茶區(qū)代表性品種（系）為對照，通過對13份苦茶資源的嘌呤生物堿進行綜合評價，旨在了解不同資源的變異特征及利用潛力，為苦茶資源的開發(fā)利用提供理論參考和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為保存于“廣東省茶樹種質(zhì)資源庫”的41份種質(zhì)資源，包括13份新收集的廣東苦茶資源和28份來源于國內(nèi)各省份代表性對照品種（系）（廣東種質(zhì)14份，浙江種質(zhì)3份，湖南種質(zhì)2份，湖北種質(zhì)2份，云南種質(zhì)2份，福建種質(zhì)3份，貴州種質(zhì)1份，臺灣種質(zhì)1份）。其基本信息如表1。

1.2 嘌呤生物堿測定

1.2.1 茶樣制備

參考《茶樹種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》的方法[21]，以一芽二葉標準對41份供試材料采樣，微波蒸青5?min，80℃恒溫干燥固樣后粉碎，制作分析樣品；同時取5份資源（K4、K22、K29、K32、K36）同一新梢下的芽頭、第一至五嫩葉以及成熟葉制作不同葉位樣品。

1.2.2 色譜條件

嘌呤生物堿（咖啡堿、可可堿、茶堿、苦茶堿）含量采用高效液相色譜儀（High performance liquid chromatography，HPLC）進行測定。液相色譜條件：流動相為0.1%甲酸（A相）和100%乙腈（B相），流速為1?mL·min-1，柱溫35℃，檢測波長為231?nm。梯度洗脫：9~15?min，A相由4%線性升至6%，B相由96%線性降至94%；15~30?min，A相由6%線性升至12%，B相由94%線性降至88%；30~55?min，A相由12%線性升至18%，B相由88%線性降至82%；55~58?min，A相由18%線性降至4%，B相由82%線性升至96%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 嘌呤生物堿的含量與變異分析

由于茶堿僅在少數(shù)供試材料（K14、K28、K31、K35、K39、K40、K41）中檢出，且含量極低（＜0.08?mg·g-1），本研究只討論咖啡堿、可可堿、苦茶堿分析結(jié)果，生物堿總量為咖啡堿、可可堿、苦茶堿含量之和。分析結(jié)果如表2所示，生物堿總量的遺傳多樣性指數(shù)（）最高，為1.94，其次是咖啡堿、苦茶堿，分別為1.76、1.21，可可堿最低為0.78。不同材料間變異系數(shù)存在較大差異：可可堿變異系數(shù)最大，為191.19%，變幅為0.23~56.82?mg·g-1；其次是苦茶堿，其變異系數(shù)為125.54%，變幅為0.18~15.71?mg·g-1；咖啡堿變異系數(shù)為51.09%，變幅為0.66~48.72?mg·g-1；生物堿總量變異系數(shù)最小，為34.89%，變幅為6.98~61.29?mg·g-1。

2.2 聚類分析

以咖啡堿、可可堿、苦茶堿及生物堿總量為指標，選用歐氏距離、Ward法進行系統(tǒng)聚類分析，構(gòu)建聚類樹狀圖。由圖1可知，在遺傳距離閾值為5時，41份茶樹資源可以分為6類，各類群的特征見表3。

類群Ⅰ包含14份種質(zhì)資源，均為各省育成品種（系），其中廣東種質(zhì)資源8份（K16、K22、K25、K32、K34、K35、K36、K37），湖南種質(zhì)資源1份（K2），云南種質(zhì)資源2份（K18、K41），福建種質(zhì)2份（K26、K33），臺灣種質(zhì)資源1份（K27）。這類種質(zhì)咖啡堿含量平均值為35.90?mg·g-1，顯著高于類群Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ；而可可堿（4.34?mg·g-1）、苦茶堿（0.92?mg·g-1）含量較低。

類群Ⅱ包含5份種質(zhì)資源，有廣東種質(zhì)4份，其中育成品種（系）3份（K38、K39、K40），苦茶資源1份（K10）；貴州種質(zhì)資源1份（K31）。該類種質(zhì)咖啡堿平均含量為41.45?mg·g-1，顯著高于類群Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。生物堿總量較高，平均值為54.43?mg·g-1，顯著高于類群Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ；可可堿含量中等（9.17?mg·g-1）；苦茶堿含量較低（3.81?mg·g-1）。值得注意的是，此類種質(zhì)中K10苦茶堿含量較高，達12.36?mg·g-1。

類群Ⅲ包含8份種質(zhì)資源，均為各省育成品種（系），其中廣東種質(zhì)資源1份（K1），浙江種質(zhì)3份（K3、K24、K30），湖北種質(zhì)2份（K19、K20），湖南種質(zhì)資源1份（K15），福建種質(zhì)資源1份（K21）。該類種質(zhì)咖啡堿含量平均值為26.11?mg·g-1，顯著低于類群Ⅰ、Ⅱ；生物堿總量平均值為28.40?mg·g-1，高于類群Ⅵ，但顯著低于其他類群；可可堿含量較低，平均值為1.88?mg·g-1；苦茶堿含量為6個類群中最低，平均值僅為0.41?mg·g-1?？傮w而言，此類群種質(zhì)嘌呤生物堿含量表現(xiàn)為中等（28.40?mg·g-1）。

類群Ⅳ包含5份種質(zhì)資源，全部為苦茶資源（K11、K12、K13、K14、K29）。該類種質(zhì)苦茶堿含量高達12.29?mg·g-1，顯著高于類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ；咖啡堿含量表現(xiàn)為中等，平均值為23.57?mg·g-1，顯著低于類群Ⅰ、Ⅱ；可可堿含量較低，平均值為3.13?mg·g-1。生物堿總量表現(xiàn)為中等，平均值為38.99?mg·g-1。此類群中，K11苦茶堿含量為15.71?mg·g-1，為所有供試材料中最高。

類群Ⅴ包含2份種質(zhì)資源，均為廣東特有種質(zhì)南昆山毛葉茶（K4、K5）。此類種質(zhì)可可堿含量平均值為56.12?mg·g-1，顯著高于其他類群；咖啡堿含量平均值僅為0.78?mg·g-1，顯著低于其他類群；苦茶堿含量較低，平均值為0.50?mg·g-1。此外，此類群生物堿總量為6個類群中最高，平均值為57.39?mg·g-1。

類群Ⅵ包含7份種質(zhì)資源，全部是苦茶資源（K6、K7、K8、K9、K17、K23、K28）。此類種質(zhì)苦茶堿含量較高，平均值為10.44?mg·g-1，顯著高于類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ；咖啡堿含量較低，平均值為5.40?mg·g-1，顯著低于類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ；可可堿含量和生物堿總量也較低，平均值分別為0.78?mg·g-1和16.61?mg·g-1。

2.3 嘌呤生物堿含量特異種質(zhì)的篩選

根據(jù)聚類分析結(jié)果及各類群生物堿綜合表現(xiàn)，在苦茶資源中初步篩選出生物堿含量特異的種質(zhì)10份（表4）。其中高苦茶堿種質(zhì)4份（苦茶堿＞10?mg·g-1），分別為K11、K13、K14和K29；高苦茶堿和高咖啡堿種質(zhì)1份（苦茶堿12.36?mg·g-1，咖啡堿34.05?mg·g-1），為K10；高苦茶堿和低咖啡堿種質(zhì)5份（苦茶堿＞10?mg·g-1，咖啡堿＜10?mg·g-1），分別為K6、K7、K8、K9和K28。

2.4 不同葉位嘌呤生物堿含量變化分析

為進一步明確嘌呤生物堿在不同葉位間含量變化情況，選取5份資源（K4、K22、K29、K32、K36）的芽頭、芽下第一至五葉以及成熟葉進行測定。如圖2所示，可可堿、咖啡堿、苦茶堿以及生物堿總量均在芽頭中含量最高，并隨著葉片成熟度的升高而逐漸降低，成熟葉中含量最低。相比而言，苦茶堿在K29苦茶資源不同葉位降低趨勢較為平緩，成熟葉期其含量仍維持在較高水平，表明苦茶堿與其他嘌呤生物堿有著不同的累積特性。

圖1 41份茶樹種質(zhì)資源嘌呤生物堿含量聚類圖

表3 41份種質(zhì)資源各類群嘌呤生物堿含量特征表（平均值±標準誤）

注：同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著（類群間比較）

Note: Means followed by small letters indicate significance of difference at＜0.05 level

表4 嘌呤生物堿含量特異的種質(zhì)

注：A：芽頭；B：第一葉；C：第二葉；D：第三葉；E：第四葉；F：第五葉；G：成熟葉

3 討論

我國是茶樹起源地，種質(zhì)資源十分豐富?？嗖枳鳛槲覈赜械牟铇滟Y源，對其進行適當?shù)脑u價和篩選將為今后開發(fā)利用提供理論參考。本研究對41份茶樹資源嘌呤生物堿分析表明，不同種質(zhì)間各嘌呤生物堿含量差異較大、變異類型豐富，蘊含著廣泛的遺傳基礎(chǔ)，可為茶樹育種和嘌呤生物堿的遺傳改良提供豐富的基因資源。

基于表型的聚類分析，能夠在一定程度上反映各種質(zhì)的親緣關(guān)系和基因變異[24]。本研究所用常規(guī)育成品種（系）全部聚類到第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類群內(nèi)，且咖啡堿為其優(yōu)勢嘌呤堿?？Х葔A是決定茶葉風(fēng)味的物質(zhì)之一，往往作為茶樹品種選育的重要目標。從以上結(jié)果推測，以往茶樹品種選育過程中把高咖啡堿含量作為一個重要指標，而忽略了低咖啡堿品種的選育。南昆山毛葉茶作為一種天然低咖啡堿種質(zhì)，單獨聚類在類群Ⅴ，可能與此類資源屬于比較進化類型有關(guān)[25]。類群Ⅳ和類群Ⅵ全部為苦茶資源，且苦茶堿含量顯著高于其他類群（表3）。值得注意的是，第Ⅳ類群苦茶中嘌呤生物堿分布模式為咖啡堿＞苦茶堿＞可可堿，與以往報道的乳源群體[26]、禿房茶[27]等富含苦茶堿種質(zhì)的嘌呤生物堿分布模式均不相同，可作為一類獨特的遺傳資源?；诰垲惙治鼋Y(jié)果和嘌呤生物堿含量特征，從苦茶資源中篩選出特異種質(zhì)10份，其中高苦茶堿種質(zhì)4份，高苦茶堿、高咖啡堿種質(zhì)1份，高苦茶堿、低咖啡堿種質(zhì)5份。

進一步研究5份資源嘌呤生物堿在不同葉位累積情況發(fā)現(xiàn)，可可堿、咖啡堿、苦茶堿以及生物堿總量在各種質(zhì)中均為芽頭含量最豐富，并隨著葉片成熟度的升高而逐漸降低，在成熟葉中達到最低值（圖2）。這與前人報道茶樹中生物堿隨葉序的增加，其含量遞減的變化趨勢類似[28]，但有別于滕杰等[27]對禿房茶的研究。相比而言，苦茶堿在不同葉位降低趨勢較為平緩，在苦茶成熟葉中其含量仍維持在較高水平，這可能與苦茶堿處于嘌呤生物堿代謝途徑下游，有著特殊的累積特性有關(guān)[29-30]。

綜上所述，通過對廣東地區(qū)苦茶資源嘌呤生物堿分析評價，明確了其遺傳特征和分布模式，篩選出了生物堿含量特異的種質(zhì)資源，拓展了種質(zhì)基礎(chǔ)，對功能性茶樹品種的開發(fā)利用、優(yōu)良基因的挖掘具有重要意義。

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Analysis and Evaluation of Purine Alkaloid Contents in Bitter Tea Germplasm Resources from Guangdong

LI Hongjian, QIN Dandan, JIANG Xiaohui, FANG Kaixing, WANG Qiushuang, PAN Chendong, LI Bo, WANG Qing, WU Hualing*

Tea Research institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Key Laboratory of Tea Plant Resources Innovation and Utilization, Guangzhou 510640, China

The purine alkaloids of 13 bitter tea germplasms from Guangdong Province along with 28 representative cultivars (lines) from different tea producing areas in China were selected for analysis in this paper. The results indicate that genetic diversity index () of purine alkaloids ranged from 0.78 to 1.94, while the coefficient of variation () ranged from 34.89% to 191.19%. The samples could be divided into 6 groups based on cluster analysis: groupⅠ, Ⅱ and Ⅲ were predominantly consisted of conventional cultivars with high caffeine content; groupⅤcontained caffeine-free cultivars from Nankun Mountain, while all samples in groupⅣ and Ⅵ were bitter tea with high theacrine content. A total of 10 purine alkaloid specific bitter tea resources were identified. Moreover, theacrine showed a gradually decrease trend with the increase of leaf positions but maintained a high level in matureleaves of bitter tea. Taken together, our research provided a basisfor genetic improvement of functional tea cultivars with specific purine alkaloids in the future.

bitter tea, purine alkaloids, germplasms, genetic diversity, cluster analysis

S571.1；S324

A

1000-369X(2021)01-071-09

2020-05-27

2020-06-24

廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金（2020A1515110397）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-19）、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長基金（201830）、科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項資金（高水平農(nóng)科院建設(shè)）（R2017PY-QY009、R2018QD-99）

李紅建，男，助理研究員，主要從事茶樹資源與遺傳育種研究，lihongjian.hi@163.com。通信作者：wuhualing@163.com

（責(zé)任編輯：黃晨）