張 琳，陳雅思

武昌理工學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 (武漢 430223)

紫花地丁是很常見的天然草藥，在中藥中有著很重要的地位，從古至今，其清熱解毒的功效人們早已熟知，現(xiàn)如今，其在抗氧化方面的作用得到了科學(xué)界廣泛的關(guān)注。黃酮類化合物是一類天然產(chǎn)物，它廣泛存在于植物體內(nèi)，具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)[1]，這個特殊結(jié)構(gòu)讓黃酮類化合物具備有豐富多樣的生物活性，如心血管系統(tǒng)活性、提高機體性能、抗氧化自由基、抗衰老等[2]；黃酮類活性化合物不僅能保護心血管系統(tǒng)，而且還有抗癌，抗病毒，治療咳嗽、風(fēng)濕、冠心病、肝臟及動脈硬化等作用[3-4]。本實驗探究了紫花地丁主要成分總黃酮的體外抗氧化活性強弱。首先利用乙醇回流提取方法從紫花地丁中草藥本身中提取出有效成分總黃酮，將通過氯仿和石油醚萃取后再重結(jié)晶得到的總黃酮制備成樣品溶液，設(shè)定合適濃度梯度[5]，通過對比紫花地丁總黃酮對亞硝酸鈉、·OH自由基和DPPH的還原能力，來檢測紫花地丁總黃酮的體外抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

紫花地丁干草，云南龍發(fā)制藥有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，合肥博美生物公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸、水楊酸、硫酸亞鐵、75 %乙醇、95 %乙醇、無水乙醇、石油醚、氯仿、乙醚、碳酸氫鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、正丁醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、30%過氧化氫，均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

YRE-301型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、RE-201C型恒溫水油浴鍋、SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵、PTHW型電熱套、DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SB-3200DT超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；750T型多功能粉碎機，鉑歐五金廠；BS 224 S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；索氏提取器，成都企航儀器制造部。

1.2 試驗方法

1.2.1紫花地丁總黃酮的提取與純化

1.2.1.1 藥材前處理

將紫花地丁干草打碎，稱重放置一邊，架好回流裝置，取粉碎后的紫花地丁干草若干，在常溫下用石油醚(沸點30 ℃～60 ℃)浸泡10 min后在45 ℃恒溫條件下回流30 min，以達到去酯和色素的目的，之后揮干石油醚，備用。

1.2.1.2 總黃酮的提取[6]

取10 g紫花地丁干草在80 ℃水浴條件下，以75 %的乙醇為提取劑，采用紫花地丁∶乙醇(1∶15，質(zhì)量比)的料液比，回流提取2次，每次回流提取時間1 h，同時提取3組，后合并提取液，即為粗體溶液。

1.2.1.3 總黃酮的分離[7]

合并液濃縮至原體積的1/5，密封靜置過夜，分3次以一層中速濾紙抽濾，以此方法除去不溶性雜質(zhì)，得到粗品溶液，而后濃縮干燥得固體，稱重。

1.2.1.4 總黃酮的純化[8]

將固體打碎，分別以氯仿，石油醚浸洗1次，以去除雜質(zhì)，抽濾烘干。以乙醚溶解，依次用20 mL 5% NaHCO3、5% Na2CO3、0.2 % NaOH以及4% NaOH溶液萃取，以稀鹽酸調(diào)節(jié)至pH=2。 出現(xiàn)沉淀后，收集將各個萃取液的沉淀合并，以熱水溶解后用正丁醇萃取，取有機層于蒸發(fā)皿濃縮，恒溫干燥得純化后產(chǎn)品。

1.2.2總黃酮含量的確定

1.2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

先取0.5 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取6支25 mL具塞試管，分別編號1、2、3、4、5、6，再精密量取 0、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于6支25 mL具塞試管中，再用亞硝酸鈉- 硝酸鋁比色法[9-12]測定其吸光度值后繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。

其具體的步驟為：每根試管分別加2 mL的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置5 min。再加2 mL10%硝酸鋁溶液，同樣搖勻，放置5 min。最后加1 mL 4%氫氧化鈉溶液，用75%乙醇定容至15 mL，搖勻后放置 20 min。以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的1號試劑做為空白對照，在波510 nm 的測定吸光度A。以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度值 A 為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 樣品濃度測定方法

精密稱取純化后的總黃酮產(chǎn)品50 mg，用75%乙醇溶解在100 mL容量瓶中，并用75 %乙醇稀釋至刻度，搖勻后再從中吸取10.0 mL，按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進行操作，測定其吸光值A(chǔ)，并利用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得總黃酮濃度，平行3次實驗得平均值?？傸S酮純度計算公式如下：

1.2.3不同紫花地丁總黃酮溶液濃度對亞硝酸鹽清除率的影響

取6只25 mL試管分別編號1、2、3、4、5、6，再精確量取0.5 mg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液2.0 mL于6支25 mL試管中，再分別依順序加入0.25 mg/mL的總黃酮溶液0、0.5、1.0 、2.0 、4.0 、8.0 mL，在37 ℃恒溫水浴反應(yīng)20 min。取出質(zhì)量分數(shù)為0.4%的對氨基苯磺酸溶液，加入2.0 mL，搖勻后靜置5 min，然后再加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液1.0 mL，靜置5 min，最后用75 %乙醇加至15 mL，搖勻后再靜置15 min。用75%乙醇做參比，在確定的最大吸收波長538 nm處測定其吸光度A0、AQ[14]，分別進行3次平行試驗。計算公式如下：

式中：A0為未加供試品的吸光度；AQ為加入供試品的吸光度。

1.2.4不同紫花地丁總黃酮溶液濃度對DPPH自由基清除率的影響

DPPH溶液的制備：精密稱取9.7 mg DPPH，加入少量無水乙醇，再用95%乙醇定容至250 mL，配制成0.2 mmol/L的DPPH溶液(用棕色瓶裝且暗處保存)。清除率的測定：取6支10 mL具塞比色管編號為1、2、3、4、5、6，將0.25 mg/mL總黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.016、0.031、0.063 、0.125、0.25 mg/mL。6支比色管同時加入1 mL DPPH溶液；再向1號比色管加入95%乙醇1 mL，其余5支比色管分別加入1 mL不同濃度的總黃酮溶液，最后用95%乙醇補足至4 mL。避光放置30 min后，以75%乙醇為參比，在確定的最大吸收波長517 nm處測定吸光度，分別進行3次平行試驗。1號作為對照，測得吸光度A0,其余測得吸光度A1[14]。計算公式如下：

式中：A0為未加供試品的吸光度；A1為加入供試品的吸光度。

1.2.5不同紫花地丁總黃酮溶液濃度對OH自由基清除率的影響

第一組取6支潔凈的10 mL具塞比色管，編號為1、2、3、4、5、6，每支比色管中依照順序加入9 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 mL、8.8 mmol/L過氧化氫溶液1 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，搖勻，在37 ℃恒溫水浴加熱20 min。取出，依次加入0.25 mg/mL總黃酮溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，再用75%乙醇補足至1 mL，搖勻之后繼續(xù)在37 ℃水浴恒溫加熱20 min。之后在確定的最大吸收波長510 nm處測定吸光度A0，AS，平行3次實驗。

第二組是為了消除色素的影響，另取5支10 mL比色管，分別編號②、③、④、⑤、⑥，分別依次加入9 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 mL、蒸餾水1 mL、9 mmol/l水楊酸-乙醇溶液1 mL，搖勻，在37 ℃恒溫水浴加熱20 min。取出，依次加入0.2 mg/mL總黃酮溶液0.2 、0.4、0.6 、0.8 、1.0 mL，再用75%乙醇補足至1 mL，搖勻之后繼續(xù)在37 ℃水浴恒溫加熱20 min。之后在確定的最大吸收波長510 nm處測定吸光度AS0，平行3次實驗[15]。

1.2.5.2 計算公式

式中：A0為空白對照液吸光度，其中只加入硫酸亞鐵溶液、過氧化氫、水楊酸-乙醇溶液的吸光度；AS為加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、過氧化氫、不同濃度總黃酮溶液的吸光度；AS0為加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、蒸餾水溶液、不同濃度總黃酮溶液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.747 1x-0.008，R2=0.996 8。將純化后總黃酮溶液的吸光度帶入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到其濃度為0.25 mg/mL；計算得到的總黃酮純品的純度為50%。

2.2 不同紫花地丁總黃酮溶液濃度對亞硝酸鹽清除率的影響

不同紫花地丁總黃酮溶液濃度對亞硝酸鹽清除率的影響見圖2。由圖2可知，隨著總黃酮加入體積增多，總黃酮對亞硝酸鹽清除率也逐步增高，并且較低濃度的總黃酮溶液即可有清除亞硝酸鹽的能力。僅僅在加入總黃酮濃度為0.2 mg/mL時，對亞硝酸鹽的清除率就達到了63.01%，因而在此總黃酮濃度條件下，對亞硝酸鹽清除效果較好。

圖2 紫花地丁總黃酮對亞硝酸鹽的清除率

2.3 不同紫花地丁總黃酮溶液濃度對DPPH自由基清除率的影響

不同紫花地丁總黃酮溶液濃度對DPPH自由基清除率的影響見圖3。由圖3可知，隨著總黃酮溶液濃度的升高，總黃酮對DPPH自由基的清除率有升高，但從0.125 mg/mL開始清除率上升的趨勢減弱，這說明清除率已經(jīng)較高。尤其在紫花地丁總黃酮濃度達到0.016 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達到59.28%，而在0.25 mg/mL時，清除率達到83.23%。因此在0.25 mg/mL總黃酮濃度條件下，對DPPH自由基清除效果較好。

圖3 紫花地丁總黃酮對DPPH自由基的清除率

2.4 不同紫花地丁總黃酮溶液濃度對OH自由基清除率的影響

不同紫花地丁總黃酮溶液濃度對OH自由基清除率的影響見圖4。由圖4可知，隨著加入總黃酮溶液體積的增加，清除率逐步上升。并且在加入總黃酮溶液的濃度為0.25 mg/mL時，清除率達到69.65%。故可以確定，在此總黃酮濃度條件下，對羥基自由基清除效果較好。

圖4 紫花地丁總黃酮對羥基自由基的清除率

3 結(jié)論

本實驗經(jīng)提取純化得到的總黃酮提取物的含量為50 %。而后通過進一步的實驗探究得到，當(dāng)紫花地丁總黃酮濃度為0.2 mg/mL時，對亞硝酸鈉清除率為63.01 %；濃度為0.25 mg/mL時，對DPPH清除率為83.23 %；濃度為0.25 mg/mL時，對·OH自由基清除率為69.65%，體現(xiàn)紫花地丁總黃酮溶液對亞硝酸鈉、打破平衡和·OH自由基具有極好的抗氧化能力。并且經(jīng)對比得出，在相同濃度的條件下，紫花地丁總黃酮溶液對DPPH自由基的清除率高于對·OH自由基的清除率和亞硝酸鈉；清除率大小順序為：DPPH>羥基自由基>亞硝酸鈉。