李賽菊，晉孝翠，富國文，吳玉江，四朗玉珍，蘇宇航，樊月圓*，舒相華，宋春蓮

(1.云南農(nóng)業(yè)大學，云南昆明 650201；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850009；3.永仁縣蓮池鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務中心，云南楚雄 651499)

抗生素是臨床上用于細菌感染的首選藥物，但由于抗生素的濫用導致多重耐藥菌的出現(xiàn)，而中藥及其復方的抗菌過程是一個非常復雜的過程，到目前為止鮮有關(guān)于中藥產(chǎn)生耐藥性的報道，因此中藥成為新型獸藥開發(fā)的重中之重。

巖青蘭(DracocephalumrupestreHance,DRH) 隸屬唇形科青蘭屬植物，多分布于海拔1 500 m之上，全草藥用具有疏風清熱、涼肝止血之功效，可以清熱消炎、健胃消食[1]，主治外感風熱，頭痛寒熱，喉痛咳嗽，黃疸性肝炎，吐血衄血，痢疾[2]。其地上全草富含黃酮類成分[3]，無明顯的毒副作用[4]。旱辣蓼(PolygonumflaccidumMeisn,PFM)為一年生草本植物， 是一種傳統(tǒng)中藥，多分布于西藏等高海拔地區(qū)。具有除濕化滯等功效, 用于痢疾、腸炎、食滯等[5]。輪葉棘豆(OxytropischiliophyllaRoyle,OCR)為豆科棘豆屬植物，又名莪大夏(藏名)[6]，分布于海拔3 500 m～5 200 m的山坡、河灘，在我國主要產(chǎn)于西藏西部及新疆[7]。藥性涼，味苦，具有具有清熱解毒，止血消炎，止瀉鎮(zhèn)痛的作用，內(nèi)服治療創(chuàng)傷出血，瘡癤發(fā)炎，腸炎腹瀉，外用可消腫止痛，是常用藏藥[8]。

巖青蘭、旱辣蓼、輪葉棘豆3種藥物在我國分布廣泛，植物來源充足，但相關(guān)研究報道較少，目前在體外抑菌作用方面尚無研究報道，與此同時植物抑菌成分主要為黃酮類、生物堿類、醌類和有機酸類化合物[9-11]。因此本研究通過GC-MS技術(shù)對3種藥物中各類化學成分進行分析，同時開展3種藥物及其復方乙醇提取物體外抗大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌的抑菌作用研究，為開發(fā)天然抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌菌種，均由云南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院微生物實驗室分離鑒定保存。

1.1.2 藥材 輪葉棘豆地上部分，巖青蘭全草和旱辣蓼根部于2019年2月在西藏采集，由云南農(nóng)業(yè)大學中獸醫(yī)實驗室鑒定后干燥，粉碎過100目篩備用。

1.1.3 主要試劑 LB培養(yǎng)基，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；溴甲酚紫指示劑，天津市科密歐化學試劑有限公司產(chǎn)品；無水乙醇，成都市科隆化學品有限公司產(chǎn)品；石油醚，無錫市亞盛化工有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52CS)，上海亞榮生物化學設備廠產(chǎn)品；鼓風干燥箱DH(G-9240A)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(HP-92272)，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；色譜儀(Eppendorf UltiMate 3000 RS)、高分辨質(zhì)譜儀(QExactive)，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 提取物制備 分別準確稱取輪葉棘豆、巖青蘭、旱辣蓼藥粉100 g和1∶1∶1比例的復方藥物100 g，按照料液比為1∶30的比例加入濃度為700 mL/L的乙醇，60 ℃超聲提取30 min，重復提取2次。負壓抽濾后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，經(jīng)石油醚萃取后揮干石油醚，所得的濃縮藥液于鼓風干燥箱中干燥至浸膏，4 ℃保存。

1.2.2 GC-MS分析 取適量旱辣蓼、輪葉棘豆、巖青蘭提取物膏劑，加入1 mL甲醇∶水(8∶2，V∶V)渦旋混勻；加入二氧化鋯研磨珠研磨后，4 ℃ 20 000 r/min離心10 min；上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機分析。以電噴霧電離源(ESI)為離子源，正負離子切換掃描采集數(shù)據(jù)，利用ACQUITY UPLCHSS T3色譜柱進行分析。采集的數(shù)據(jù)通過整理后進行數(shù)據(jù)庫檢索比對，對質(zhì)譜鑒定到的分析物進行質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析并選取具有生物活性的化合物進行分析。

1.2.3 提取物體外抑菌試驗 分別取適量滅菌蒸餾水配置成1 g/mL的藥液和適量滅菌生理鹽水配置成108CFU/mL濃度的菌液。將含10 g/L葡萄糖的LB肉湯和和配置好的1 g/mL的藥液按照二倍稀釋法稀釋10個濃度，取100 μL菌液加入到10個濃度的試管中，另取2管分別為單純藥物和單純LB肉湯培養(yǎng)基對照?；靹蚝蟮渭?滴2 mg/mL溴甲酚紫指示劑，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h～24 h，觀察變色結(jié)果。選取剛好未變色的試管濃度作為最小抑菌濃度，采用打孔法進行最小抑菌濃度抑菌圈測定，參考相關(guān)文獻[12]判斷標準：抑菌圈直徑≥20 mm為極敏(+++)，15 mm≤抑菌圈直徑<20 mm為高敏(++)，10 mm≤抑菌圈直徑<15 mm為中敏(+)，10 mm以下的為低敏(-)。從所得MIC值以上濃度的所有未變色試管中取100 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基上進行MBC值的測定。

2 結(jié)果

2.1 提取物GC-MS分析結(jié)果

如表1和圖1所示，通過對巖青蘭、旱辣蓼、輪葉棘豆乙醇提取物石油醚萃取部位正負離子模式下采集的總離子流圖、相關(guān)文獻和數(shù)據(jù)庫檢索及分析，巖青蘭、旱辣蓼、輪葉棘豆中分別鑒定了13、19、15種化合物。

表1 巖青蘭、旱辣蓼和輪葉棘豆提取物抑菌活性成分質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析

總離子流圖上半部分為正離子圖，下半部分為負離子圖；A.巖青蘭;B.旱辣蓼;C.輪葉棘豆

2.2 提取物抑菌試驗結(jié)果

2.2.1 MIC和MBC值測定結(jié)果 結(jié)果如表2，復方提取物對鏈球菌抑制效果最好，巖青蘭提取物對金黃色葡萄球菌抑制效果最好，巖青蘭和復方提取物對大腸埃希氏菌抑制效果最好，復方提取物對沙門氏菌抑制效果最好。

2.2.2 MIC抑菌圈測定結(jié)果 3種藥物及其復方提取物對4種常見菌的MIC抑菌圈測定結(jié)果見表3。根據(jù)判斷標準，巖青蘭提取物對金黃色葡萄球菌，復方提取物對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌高度敏感，其抑菌圈大小在15.03 mm～18.75 mm之間。其他均為中度敏感，抑菌圈大小在10.12 mm～15 mm之間。

表2 3種藥物及其復方提取物對4種常見菌的MIC、MBC值測定

表3 3種藥物及其復方提取物對4種常見菌的MIC抑菌圈測定

3 討論

大腸埃希氏菌、沙門氏菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌為養(yǎng)殖生產(chǎn)中常見的病原菌，但由于抗生素的不規(guī)范使用造成病原菌耐藥性的產(chǎn)生[13-14]，因此探求安全有效的抗生素替代藥物成為新獸藥開發(fā)的熱點之一，而中藥藥理機制復雜，藥效與其本身所含的活性物質(zhì)息息相關(guān)。由表1可知，鑒定出的13種巖青蘭化合物中黃酮類化合物9種，醌類化合物2種，生物堿類化合物2種，除丁聰?shù)萚15]和任冬梅等[3]鑒定出的北美圣草素、木犀草素、柚皮素和郝娜等[16]鑒定出的圣草酚以外，化合物1、2、3、4、5、9、13、15、19、20均為首次分離鑒定所得；鑒定出的19種旱辣蓼化合物中黃酮類化合物12種，有機酸類化合物2種，醌類化合物2種，生物堿類化合物3種，均為首次鑒定所得，分別為化合物1、2、4、5、6、7、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23；鑒定出的15種輪葉棘豆化合物中黃酮類化合物13種，醌類化合物1種，生物堿類化合物1種，除姚淑英等[5]鑒定出的槲皮素，格桑羅布等[17]和Liu Y等[18]鑒定出的(2S)-5，7-二羥基黃酮(白楊素)以外，化合物2、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、19和22均為首次鑒定所得。

體外抑菌試驗結(jié)果表明，3種藥物及其復方提取物對金黃色葡萄球菌和鏈球菌抑制作用比對大腸埃希氏菌、沙門氏菌的抑制作用強。另外，3種藥物及其復方提取物對大腸埃希氏菌的最小抑菌濃度皆大于沙門氏菌，可能是由于人類和動物長期食用含有生物活性成分的植物而導致體內(nèi)的大腸埃希氏菌產(chǎn)生了一定的耐藥性。3種藏藥及其復方提取物對4種常見菌均有良好的抑制效果，可能是由于3種藥物中含有多種具有抑菌活性的化學成分。洪志偉等[19]研究表明，槲皮素可能通過破壞細菌細胞壁結(jié)構(gòu)、改變細菌蛋白的表達譜， 進而對大腸埃希氏菌產(chǎn)生明顯的抑制作用；董曉寧等[20]通過平板稀釋法考察了苦蕎麥中提取的蘆丁對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌抑制作用顯著；周紅潮[21]觀察到黃芩苷對大腸埃希氏菌、傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用；Chen Y X等[22]則表明黃芩苷對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有很強的影響，最低抑菌濃度達到0.04 mg/mL；徐進[23]試驗結(jié)果表明，1 MIC的姜黃素對濃度為1×107CFU/mL的金黃色葡萄球菌抑菌作用最為明顯(P<0.05)；劉明[24]研究發(fā)現(xiàn),大黃素對MRSA252標準株與36株MRSA臨床分離株MIC為2 μg/mL～8 μg/mL、MBC為4 μg/mL～32 μg/mL。通過對巖青蘭、旱辣蓼、輪葉棘豆乙醇提取物化學成分分析和對4種常見病原菌的體外抑菌試驗，表明3種藥物及其復方提取物對4種常見菌均有良好的抑制效果，但由于中藥成分復雜，其抑菌機理有待進一步的研究。