張梓軒，黃武琴，鄭百利，于金玲，史麗華，李冰，劉孝剛

(錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

弓形蟲病是由弓形蟲屬的剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的一種重要人畜共患寄生蟲病，特別是當(dāng)宿主免疫力下降時(shí)更容易感染發(fā)病，是一種重要機(jī)會(huì)性致病原蟲[1-2]。弓形蟲宿主范圍十分廣泛，能感染包括人在內(nèi)的所有溫血?jiǎng)游颷3]。弓形蟲病呈世界性分布，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，全世界大約有1/3的人類被弓形蟲感染，歐美人群的感染率達(dá)到25%～50%，個(gè)別國(guó)家高達(dá)80%。最新的一項(xiàng)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)普通人群弓形蟲抗體陽(yáng)性率為8.2%，孕婦為8.6%[4]。在動(dòng)物感染方面，我國(guó)部分地區(qū)綿羊、雞弓形蟲的平均感染率分別為13.87%、19%[5]，遼寧省豬的血清陽(yáng)性率為11.3%[6]。該病不僅對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅，同時(shí)也能導(dǎo)致動(dòng)物的廣泛感染和發(fā)病，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

微線體蛋白(MIC)是由位于弓形蟲前端的微線體所分泌，在弓形蟲黏附和侵襲宿主的過(guò)程中起到十分重要的作用[7]。目前已知的微線體蛋白有27種，包括 MIC1～MIC17、頂膜抗原(AMA1)、枯草桿菌蛋白酶(SUB1)、菱形體蛋白(ROM1)、金屬蛋白酶(TLN4)、可變性血小板反應(yīng)蛋白(SPATR)等，目前關(guān)于MIC1～MIC8等微線體蛋白的研究報(bào)道較多，而針對(duì)MIC9的研究較少[8]。本研究對(duì)微線體蛋白MIC9進(jìn)行克隆和表達(dá)，并對(duì)其免疫反應(yīng)性進(jìn)行分析，為MIC9蛋白免疫功能等后續(xù)相關(guān)基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲株、菌株和質(zhì)粒

弓形蟲RH蟲株由本實(shí)驗(yàn)室保存提供，克隆菌株DH5α和表達(dá)菌株大腸桿菌BL21購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，表達(dá)載體pGEX-4T-1購(gòu)于武漢淼靈質(zhì)粒有限公司。

1.1.2 主要試劑

血液/細(xì)胞/組織基因組DNA/RNA提取試劑盒(離心柱型，貨號(hào)：DP315)、質(zhì)粒小量提取試劑盒(貨號(hào)：D1100)，購(gòu)于天根生化科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、2×Taq酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；pMD-18T載體、內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ、T4連接酶，購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、5×蛋白上樣緩沖液、2×蛋白上樣緩沖液、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker，購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；預(yù)染蛋白Marker，購(gòu)于碧云天生物技術(shù)；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，購(gòu)于美國(guó)密理博；弓形蟲RH株鼠源全蟲多克隆抗體(貨號(hào)：GTX36747)，購(gòu)于LifeSpan BioSciences；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗鼠lgG，購(gòu)于凱基生物；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光顯色液，購(gòu)于上海天能。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

利用Oligo 7軟件參照已公布的MIC9蛋白基因序列(GenBank:XM_018780746.1)設(shè)計(jì)1對(duì)引物，2條引物5′端分別插入EcoRⅠ和SalⅠ限制酶切位點(diǎn)(下劃線處)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。上游引物：5′-GCAGGAATTCATGAGGGTTTCGTTTAACGTAC-3′，下游引物：5′-GCAGGTCGACTCAATACATTCCTTCAAAATCG-3 ′。

1.2.2 弓形蟲MIC9基因PCR擴(kuò)增

用DNA/RNA提取試劑盒提取弓形蟲RH株總基因組，并對(duì)基因組進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用本研究設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。反應(yīng)體系50 μL：模板5 μL、2×Taq酶25 μL、上游引物和下游引物各2 μL、ddH2O 16 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸5 min。

1.2.3 MIC9基因重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及測(cè)序

用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒回收目的片段，然后將目的片段與pMD-18T載體連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，進(jìn)行EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定，并將鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 MIC9基因片段的原核表達(dá)載體構(gòu)建

用EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切pGEX-4T-1原核表達(dá)載體，膠回收載體片段。將重組克隆質(zhì)粒雙酶切后獲得的目的片段膠回收產(chǎn)物和pGEX-4T-1載體的酶切膠回收產(chǎn)物用T4連接酶16 ℃連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌 BL21，然后提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定結(jié)果。

1.2.5 重組蛋白MIC9在大腸桿菌中的表達(dá)分析

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，IPTG(終濃度為1.5 mmol/L)37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組不加入IPTG，其余條件均一致。分別取誘導(dǎo)和對(duì)照組菌液1 mL，12 000 r/min離心1 min，棄上清，加入1 mL PBS重懸沉淀，10 000 r/min 離心1 min，棄上清，清洗3次。菌體沉淀用40 μL ddH2O重懸，加入10 μL 5×SDS上樣緩沖液二硫蘇糖醇(DTT)，混勻后，沸水煮5 min，冷卻至室溫；10 000 r/min 離心1 min，取10 μL上清進(jìn)行 SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。

1.2.6 Western blot對(duì)重組蛋白MIC9的驗(yàn)證與分析

1.2.6.1 GST標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot驗(yàn)證

取MIC9蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，電泳結(jié)束后，以GST標(biāo)簽抗體作為一抗，以HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體為二抗進(jìn)行Western blot檢驗(yàn)，驗(yàn)證重組蛋白的表達(dá)情況。

1.2.6.2 用弓形蟲全蟲抗體進(jìn)行Western blot驗(yàn)證

取蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，電泳結(jié)束后，以弓形蟲全蟲抗體作為一抗，以HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體為二抗進(jìn)行Western blot檢驗(yàn)，對(duì)重組蛋白的免疫反應(yīng)性進(jìn)行檢驗(yàn)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 弓形蟲RH株MIC9基因PCR擴(kuò)增

以弓形蟲RH株總DNA作為模板，用本研究設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增出1條約900 bp的條帶，與預(yù)期目的片段大小相一致，結(jié)果如圖1。

2.2 MIC9基因重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及測(cè)序

將MIC9基因片段連接到pMD-18T載體，提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切獲得約2 000和900 bp的2個(gè)片段，與預(yù)期結(jié)果一致，詳見(jiàn)圖2。陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序獲得有效核苷酸903 bp，與預(yù)期結(jié)果一致，測(cè)序結(jié)果已上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，并獲得基因編號(hào)： MK704431。經(jīng)BLAST比對(duì)，與基因數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的4條弓形蟲MIC9基因序列同源性均在99%以上，具體比對(duì)結(jié)果如下：與其中3條基因(MK704432.1、XM-018780746.1、LN714502.1)的同源性均為99.89%，與另1條基因AF353166.1的同源性為99.11%，證明pMD-18T-MIC9重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DL2000 Marker；1. MIC9目的基因擴(kuò)增片段；2. 陰性對(duì)照

M. DL5000 Marker；1. pMD-18T-MIC9質(zhì)粒；2. pMD-18T-MIC9質(zhì)粒酶切

2.3 MIC9基因原核表達(dá)載體鑒定

用EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切pGEX-4T-1原核表達(dá)載體和pMD-18T-MIC重組質(zhì)粒，將MIC9基因片段連接到pGEX-4T-1載體，提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，獲得約4 000和900 bp的2個(gè)片段，與預(yù)期結(jié)果一致，陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果插入片段為903 bp，無(wú)基因突變，證明pGEX-4T-1-MIC9原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。詳見(jiàn)圖3。

2.4 重組蛋白MIC9在大腸桿菌中的表達(dá)

用1.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h，菌體蛋白(上清液)經(jīng)SDA-PAGE檢測(cè)顯示，MIC9重組蛋白樣品和空載分別在59 kDa(含標(biāo)簽蛋白)和26 kDa處有明顯蛋白表達(dá)條帶，表明成功誘導(dǎo)出MIC9重組蛋白，其結(jié)果如圖4。

M. DL5000 Marker；1. pGEX-4T-1-MIC9質(zhì)粒雙酶切；2. pGEX-4T-1-MIC9質(zhì)粒

M.蛋白質(zhì)Marker；1.誘導(dǎo)菌體蛋白；2.未誘導(dǎo)菌體蛋白；3. pGEX-4T-1載體誘導(dǎo)；4. pGEX-4T-1未誘導(dǎo)

2.5 MIC9重組蛋白的GST標(biāo)簽抗體Western blot驗(yàn)證

重組蛋白pGEX-4T-1-MIC9(上清液)經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)束后，采用半干轉(zhuǎn)方法用轉(zhuǎn)膜儀將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用GST單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，其顯影結(jié)果表明誘導(dǎo)后的重組蛋白MIC9和GST標(biāo)簽載體的目的蛋白處均有1條59 kDa(含GST標(biāo)簽)和26 kDa大小的目的蛋白條帶，證明重組蛋白MIC9成功表達(dá)，如圖5。

2.6 MIC9重組蛋白弓形蟲全蟲抗體Western blot驗(yàn)證

將重組pGEX-4T-1-MIC9蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用弓形蟲全蟲抗體為一抗進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，其結(jié)果表明經(jīng)誘導(dǎo)后的重組pGEX-4T-1-MIC9蛋白有預(yù)期的目的蛋白條帶(59 kDa)，能被弓形蟲全蟲抗體特異性識(shí)別，證明重組蛋白MIC9具有免疫反應(yīng)性，如圖6所示。

M.蛋白質(zhì)Marker；1. 誘導(dǎo)菌體蛋白；2. 未誘導(dǎo)菌體蛋白；3. pGEX-4T-1載體誘導(dǎo)；4. pGEX-4T-1空載體未誘導(dǎo)

M. 蛋白質(zhì)Marker；1. 誘導(dǎo)菌體蛋白；2. 未誘導(dǎo)菌體蛋白

3 討論

微線體是位于弓形蟲前部的分泌器官。所有微線體蛋白均在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)合成，再經(jīng)高爾基體到達(dá)微線體中貯存，最后分泌到蟲體表面，在識(shí)別、黏附、侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[9]。在微線體蛋白的合成、運(yùn)輸和分泌過(guò)程中,多種微線體蛋白會(huì)結(jié)合起來(lái)，以復(fù)合體的形式發(fā)揮作用[10]。除上述功能外，某些微線體蛋白(MIC1、MIC3、MIC4、MIC6、MIC8等)具有一定的免疫功能，是弓形蟲的疫苗候選分子[11]。

關(guān)于MIC1-8等微線體蛋白的研究報(bào)道較多，而針對(duì)MIC9的研究較少[7]。目前已知MIC9具有跨膜結(jié)構(gòu)，含有表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域，能夠在包囊內(nèi)慢殖子期表達(dá)，關(guān)于微線體蛋白MIC9其他方面的信息報(bào)道較少[12]。

本研究成功擴(kuò)增出大小為903 bp的MIC9基因片段，在大腸桿菌中成功表達(dá)，經(jīng)免疫學(xué)鑒定，MIC9重組蛋白能夠被弓形蟲全蟲抗體特異性識(shí)別，證明重組蛋白MIC9具有良好的免疫反應(yīng)性。本研究結(jié)果為微線體蛋白MIC9相關(guān)基礎(chǔ)研究及臨床疫苗的研究提供了參考。