趙少若，王孟月,白晶晶,郝麗影, 梁嚴(yán)予, 關(guān)洋, 鄧均華*, 田克恭,*

(1. 洛陽(yáng)普泰生物技術(shù)有限公司，河南 洛陽(yáng) 471000；2. 國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471000)

非洲豬瘟(ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的家豬、野豬的一種急性、烈性、高度接觸性動(dòng)物傳染病，所有品種和年齡的豬均可感染，發(fā)病率和死亡率最高可達(dá)100%[1-2]。ASF于20世紀(jì)20年代在非洲地區(qū)首次被發(fā)現(xiàn)，具有很強(qiáng)的傳染性，對(duì)全球家豬生產(chǎn)造成巨大影響。2018年我國(guó)沈陽(yáng)市發(fā)生首例非洲豬瘟感染病例，并隨后在全國(guó)各地陸續(xù)發(fā)生，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成巨大的威脅[3-4]。

ASFV是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，直徑175～215 nm，為二十面體帶囊膜的雙鏈DNA病毒，也是唯一已知的蟲媒DNA病毒。該病毒基因大小介于170～190 kb之間，包含151個(gè)開(kāi)放閱讀框，基因組編碼150～200個(gè)蛋白[5-7]。DP96R基因在不同病毒毒株基因組中序列高度保守，屬于病毒毒力基因，是導(dǎo)致家豬發(fā)病的重要因素之一。有研究表明DP96R蛋白屬于非洲豬瘟病毒感染早期蛋白，在病毒感染巨噬細(xì)胞后2 h即可以檢測(cè)到其表達(dá)，該基因缺失后，雖不影響病毒在體外巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖，但其對(duì)家豬的致病力明顯減弱[8]。本研究通過(guò)構(gòu)建重組原核質(zhì)粒pET28a-SUMO-DP96R并進(jìn)行原核表達(dá)，對(duì)重組蛋白SUMO-DP96R進(jìn)行純化，并制備了針對(duì)DP96R蛋白的單克隆抗體，為DP96R蛋白生物學(xué)功能及ASFV基因缺失疫苗的研究提供了重要的生物材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

pET28a-SUMO質(zhì)粒由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心構(gòu)建并保存；大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶，購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；液體石蠟，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG，購(gòu)自Sigma公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠單抗Ig類/亞類/亞型鑒定用ELISA試劑盒，購(gòu)自洛陽(yáng)佰奧通實(shí)驗(yàn)材料中心；ASFV陽(yáng)性血清、ASFV抗原，購(gòu)自歐盟參考實(shí)驗(yàn)室(EU Reference Laboratory for ASF, INIA-CISA)。

1.3 表達(dá)菌株的構(gòu)建

根據(jù)大腸桿菌密碼子優(yōu)化后的DP96R序列設(shè)計(jì)引物，并引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ(下劃線處)，上游引物為DP96R-BamHⅠ-F：5′-CGCGGATCCATGTCTACCCACGACTGCTC -3′，下游引物為DP96R-XhoⅠ-R：5′-CCGCTCGAGTTAGTTGTTTTT-CTGGATAG -3′。引物和優(yōu)化后的DP96R基因由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。以合成的pUC57-ASFV DP96R為模板，用引物DP96R-BamHⅠ-F和DP96R-XhoⅠ-R進(jìn)行DP96R基因的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下(50 μL)：ddH2O 22 μL，2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL，DP96R-BamHⅠ-F(10 μmol/L)1 μL，DP96R-XhoⅠ-R(10 μmol/L)1 μL，模板1 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。將擴(kuò)增的目的條帶電泳后回收，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切消化，并與同樣酶切后的pET28a-SUMO載體連接，將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂布于含卡那霉素的LB平板，37 ℃靜置培養(yǎng)10～12 h至單菌落清晰可辨，挑取單菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，即為能表達(dá)ASFV SUMO-DP96R蛋白的工程菌大腸桿菌BL21(ED3)/pET28a-SUMO-DP96R菌株。

1.4 重組蛋白SUMO-DP96R的表達(dá)與純化

將大腸桿菌BL21/pET28a-SUMO-DP96R菌種2 mL，接種至200 mL含卡那霉素的普通肉湯培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基)內(nèi)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600 nm值為0.8～1時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG溶液，28 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。收集菌體用高壓勻質(zhì)機(jī)破碎菌體，離心后收集上清和沉淀，檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。上清液中加入0.01 mol/L咪唑，經(jīng)0.45 μm濾器過(guò)濾后采用鎳柱親和層析法進(jìn)行蛋白純化。純化蛋白用SDS-PAGE檢測(cè)，并經(jīng)光譜掃描法確定其純度。

1.5 重組蛋白SUMO-DP96R的Western blot鑒定

將純化的重組蛋白DP96R進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，電泳后的凝膠用半干式轉(zhuǎn)膜法電轉(zhuǎn)至NC膜。轉(zhuǎn)印的硝酸纖維素膜(NC膜)用5%脫脂奶粉封閉，4 ℃封閉過(guò)夜，ASFV陽(yáng)性血清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG為二抗，加入DAB顯色液進(jìn)行顯色。

1.6 單克隆抗體的制備

1.6.1 動(dòng)物免疫及間接ELISA篩選方法的建立

將純化后的重組蛋白SUMO-DP96R與弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后，按100 μg/只的劑量背部皮下多點(diǎn)免疫4～6周齡雌性BALB/c小鼠。分別間隔2周，用與弗氏不完全佐劑充分乳化的重組蛋白SUMO-DP96R按相同劑量對(duì)小鼠進(jìn)行二免及三免。三免后7 d采血，用間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。將純化后的重組蛋白SUMO-DP96R稀釋至0.1 μg/mL，按100 μL/孔包被于酶標(biāo)板，取稀釋后的待檢血清作為一抗，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗。當(dāng)陰性對(duì)照OD450 nm<0.2時(shí)試驗(yàn)成立，S/N(待檢樣品OD450 nm/陰性樣品OD450 nm)≥2.1判為陽(yáng)性，S/N<2.1判為陰性，以陽(yáng)性孔對(duì)應(yīng)的最高稀釋度作為待檢血清的抗體效價(jià)。選擇抗體效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行融合。細(xì)胞融合前3 d，將純化的重組蛋白SUMO-DP96R以100 μg/只的劑量注射小鼠腹腔，進(jìn)行沖擊免疫。

跨境專線物流是指通過(guò)航空包艙方式將商品運(yùn)輸?shù)絿?guó)外，再通過(guò)合作公司進(jìn)行目的國(guó)的派送。專線物流的優(yōu)勢(shì)在于其能夠?qū)崿F(xiàn)集約化運(yùn)輸，將大批量商品運(yùn)輸?shù)侥骋惶囟▏?guó)家或地區(qū)，從而實(shí)現(xiàn)規(guī)模效應(yīng)降低成本。因此，其價(jià)格比商業(yè)快遞低。時(shí)效上稍慢于商業(yè)快遞，但比郵政包裹快很多。

1.6.2 細(xì)胞融合及陽(yáng)性克隆篩選

將SP2/0與離心后的免疫脾細(xì)胞以1∶10的比例混合后，用聚乙二醇(PEG)1 500作為融合劑進(jìn)行細(xì)胞融合。將融合細(xì)胞滴加于鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞板，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。10 d后取細(xì)胞上清，用1.6.1建立的間接ELISA方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，同時(shí)以大腸桿菌BL21/pET28a-SUMO蛋白包被板作對(duì)照，包被濃度為0.1 μg/mL。以SUMO-DP96R蛋白檢測(cè)孔的OD值與對(duì)照孔的差值，作為該孔的OD值，選擇OD值高的孔進(jìn)行3～5次亞克隆，直至雜交瘤細(xì)胞上清陽(yáng)性率為100%，對(duì)篩選后陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并將細(xì)胞凍存。

1.6.3 腹水的制備

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的8～10周齡BALB/c小鼠，按0.5 mL/只的劑量腹腔注射無(wú)菌液體石蠟致敏。7 d后對(duì)小鼠腹腔注射0.5 mL細(xì)胞密度為300 000/mL的雜交瘤細(xì)胞。待小鼠腹部明顯膨大時(shí)收集腹水，以12 000 r/min離心10 min，上清即為單克隆抗體。

1.7 單克隆抗體的鑒定

1.7.1 單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定

采用1.6.1建立的間接ELISA法測(cè)定單克隆抗體效價(jià)，同時(shí)用大腸桿菌BL21/pET28a-SUMO蛋白包被板進(jìn)行間接ELISA作為對(duì)照試驗(yàn)，棄掉對(duì)照值高的單克隆抗體。

按照亞類鑒定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行單克隆抗體亞類鑒定。

1.7.3 單克隆抗體特異性鑒定

將純化的重組蛋白SUMO-DP96R與對(duì)照蛋白大腸桿菌 BL21/pET28a-SUMO進(jìn)行SDS-PAGE分析，電泳后的凝膠進(jìn)行Western blot鑒定，以單克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，加入DAB顯色液進(jìn)行顯色。

1.8 單克隆抗體與ASFV抗原的反應(yīng)性鑒定

取商品化的ASFV抗原，按照使用說(shuō)明1∶1 600稀釋后包被酶標(biāo)板，100 μL/孔，4 ℃孵育過(guò)夜，洗板后加入封閉液，150 μL/孔，4 ℃封閉過(guò)夜。洗板后加入1∶100稀釋的單克隆抗體，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，37 ℃孵育1 h。洗板后加入1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育30 min。洗板后分別加入顯色液A、B液，37 ℃顯色15 min，然后用2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，50 μL/孔，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

DP96R基因擴(kuò)增后的大小與預(yù)期大小一致，為309 bp(圖1)。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET-SUMO-DP96R進(jìn)行雙酶切鑒定，核酸電泳圖片可觀察到載體條帶和目的條帶(圖2)，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。同時(shí)對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與DP96R目的基因堿基序列一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M. DNA Marker; 1. DP96R基因

M. DNA Marker; 1. pET-SUMO-DP96R雙酶切

2.2 重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定

將大腸桿菌 BL21/pET28a-SUMO-DP96R菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)， SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3，誘導(dǎo)后的菌體破碎液上清與誘導(dǎo)前相比，出現(xiàn)明顯的目的蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白SUMO-DP96R分子量約在28 kDa，且為可溶性表達(dá)。采用鎳柱親和層析法純化上清中的可溶蛋白，純化后蛋白純度約90%，見(jiàn)圖4A。經(jīng)Western blot方法鑒定，表達(dá)的重組蛋白SUMO-DP96R能夠與ASFV陽(yáng)性血清反應(yīng)，呈現(xiàn)特異性的條帶，見(jiàn)圖4B，結(jié)果表明重組蛋白SUMO-DP96R具有良好的反應(yīng)原性。

M. 蛋白Marker; 1. 未誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21/pET28-SUMO-DP96R菌體破碎液上清; 2. 誘導(dǎo)后的大腸桿菌BL21/pET28-SUMO-DP96R菌體破碎液上清

M. 蛋白分子量Marker; 1. 純化的重組蛋白SUMO-DP96R

2.3 單克隆抗體制備及效價(jià)檢測(cè)

通過(guò)間接ELISA方法檢測(cè)免疫后小鼠血清的效價(jià)，小鼠血清效價(jià)最高為1∶2 048 000萬(wàn)。選擇效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，最終篩選得到14株能穩(wěn)定性分泌抗DP96R蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為3H11、3C6、2H7、3H7、5C6、1G7、2D6、5G12、1G2、2E4、3H2、2E8、5C4及5G7，對(duì)這14株雜交瘤細(xì)胞制備的單克隆抗體進(jìn)行ELISA效價(jià)檢測(cè)，結(jié)果表明，制備的單克隆抗體ELISA效價(jià)不低于1∶2 560 000萬(wàn)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 單克隆抗體亞類鑒定

對(duì)制備的單克隆抗體進(jìn)行亞類鑒定，單克隆抗體3H11、3C6、2H7、1G7、5G12、1G2及3H2重鏈亞類均為IgG1，單克隆抗體3H7、2E4、2D6、2E8、5C4、5C6及5G7的重鏈亞類均為IgG2a，輕鏈亞類均為κ。

2.5 單克隆抗體特異性鑒定

采用Western blot法對(duì)14株單克隆抗體進(jìn)行鑒定，結(jié)果重組蛋白SUMO-DP96R出現(xiàn)特異性條帶，對(duì)照蛋白大腸桿菌BL21/pET28a-SUMO無(wú)條帶，表明制備的14株單克隆抗體具有良好的特異性，鑒定結(jié)果以2D6(圖5A)和2H7(圖5B)為示例。

表1 單克隆抗體ELISA效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

M. 蛋白分子量Marker;1. 純化的重組蛋白SUMO-DP96R;2. 對(duì)照蛋白大腸桿菌BL21/pET28a-SUMO

2.6 單克隆抗體與ASFV抗原的反應(yīng)性鑒定

用商品化ASFV抗原包被的酶標(biāo)板，通過(guò)間接ELISA方法對(duì)制備的14株單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：?jiǎn)慰寺】贵w100倍稀釋后，5株的OD值在0.201～0.435之間，9株的OD值在0.104～0.168之間，陰性對(duì)照值為0.012。表明制備的抗非洲豬瘟病毒DP96R蛋白單克隆抗體與病毒具有一定的反應(yīng)性。

3 討論

非洲豬瘟是一種傳染性很強(qiáng)的高致病性疫病，患病豬出現(xiàn)高熱、食欲廢絕、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟器官嚴(yán)重出血等臨床癥狀，具有發(fā)病病程短、病死率高等特征。鑒于該病的嚴(yán)重危害性，OIE將其列為法定報(bào)告的烈性傳染病之一，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。非洲豬瘟目前尚無(wú)有效的治療藥物和商品化疫苗，一旦發(fā)病，需立即進(jìn)行診斷，及時(shí)撲殺感染豬群并采取衛(wèi)生防疫措施[9-11]。

現(xiàn)有研究表明，研制基因缺失弱毒活疫苗是ASFV疫苗研發(fā)的首選策略。ASFV病毒復(fù)制是調(diào)控病毒基因轉(zhuǎn)錄的開(kāi)關(guān)，極早期和早期基因在病毒復(fù)制前進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而中期和晚期基因在病毒復(fù)制開(kāi)始后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)[12]。DP96R是早期基因，在不同病毒毒株基因組中序列高度保守，是ASFV在體外巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖非必需基因，但卻是ASFV毒力基因之一，其作用機(jī)制仍然未知。DP96R蛋白能夠抑制cGAS-STING信號(hào)通路，抑制抗病毒反應(yīng)，是病毒免疫逃避機(jī)制及疫苗研究的重要靶標(biāo)。ASFV E70缺失DP96R基因以及ASFV Georgia 2007毒株同時(shí)缺失9GL和DP96R基因后病毒毒力均明顯下降，可以針對(duì)親本強(qiáng)毒株攻毒提供一定的保護(hù)力[13-16]。

本研究根據(jù)GenBank公布的中國(guó)分離的ASFV DP96R基因序列(GenBank: MH766894.1)進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化，并將優(yōu)化后的基因進(jìn)行全序列合成，以原核表達(dá)技術(shù)成功表達(dá)了可溶性的重組蛋白SUMO-DP96R。通過(guò)Western blot方法檢測(cè)，DP96R蛋白與ASFV陽(yáng)性血清具有反應(yīng)性，說(shuō)明表達(dá)的DP96R蛋白具有良好的反應(yīng)原性。本研究利用重組蛋白SUMO-DP96R免疫小鼠共制備了14株針對(duì)DP96R蛋白的單克隆抗體，以DP96R蛋白為抗原的間接ELISA方法檢測(cè)，效價(jià)均不低于1∶2 560 000，其中2D6、1G7的效價(jià)最高，達(dá)1∶20 480 000。單抗亞型及特異性鑒定結(jié)果表明，14株單克隆抗體的重鏈亞型分別為IgG1、IgG2a，輕鏈亞型均為κ，且均能夠特異性識(shí)別DP96R蛋白。商品化ASFV抗原為感染ASFV的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，將其包被酶標(biāo)板，用間接ELISA方法檢測(cè)14株單克隆抗體，結(jié)果具有一定反應(yīng)性，但OD值較低，可能因?yàn)锳SFV結(jié)構(gòu)復(fù)雜，DP96R為病毒感染早期蛋白，且為病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，收獲抗原時(shí)可能病毒表達(dá)的DP96R蛋白含量較低。以DP96R蛋白為抗原的間接ELISA和Western blot結(jié)果表明制備出的單克隆抗體是針對(duì)DP96R蛋白的特異性抗體，且效價(jià)較高，說(shuō)明單抗與蛋白具有良好的反應(yīng)性。因此在DP96R蛋白功能及ASFV復(fù)雜的致病機(jī)制等基礎(chǔ)研究中，本研究制備的單克隆抗體可能會(huì)成為重要的生物材料。

綜上，本研究制備的DP96R單克隆抗體，經(jīng)鑒定效價(jià)較高且特異性良好，可以為非洲豬瘟病毒DP96R蛋白結(jié)構(gòu)功能及基因缺失疫苗、病毒致病機(jī)制的研究提供重要的生物材料。