周景云，劉百紅，劉雪微，楊欣艷，李寶春，陳西釗

(北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司，北京 100094)

豬瘟是豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，具有高傳染性和高致病性的特點，嚴(yán)重阻礙我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[1]。豬瘟被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為通報疫病之一，我國將其列為一類動物傳染病[2-3]。豬瘟的出現(xiàn)距今已有200多年，目前雖然很多國家已經(jīng)消滅了豬瘟，但近期，日本26年來再次暴發(fā)該病[4-5]，因此它仍然是危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病。目前對豬瘟的防控主要是疫苗免疫，但受各方面因素影響，豬瘟疫苗免疫失敗現(xiàn)象時有發(fā)生，豬瘟在局部地區(qū)仍有發(fā)生與流行[6-7]。近年來，豬瘟的流行形式已從頻發(fā)的大流行轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗟貐^(qū)散發(fā)性流行，大多數(shù)表現(xiàn)為溫和型豬瘟，臨床癥狀減輕，呈現(xiàn)亞臨床感染。母豬感染豬瘟，導(dǎo)致長期帶毒、散毒，成為豬瘟預(yù)防免疫效果差、反復(fù)發(fā)生的重要原因。

CSFV屬于黃病毒科瘟病毒屬。該病毒基因組為單股正鏈RNA，基因組的中間部分是編碼多聚蛋白的開放閱讀框[8-9]，從 5′→3′依次編碼的結(jié)構(gòu)蛋白為 Npro、C、 E0、E1、 E2 和 非結(jié)構(gòu)蛋白P7、NS2、 NS3、 NS4A、NS4B、 NS5A 和 NS5B，其中 C、 E0、E1、 E2 為重要的結(jié)構(gòu)蛋白，尤其是E2蛋白，是主要的保護性抗原結(jié)構(gòu)蛋白，具有較強的免疫原性和反應(yīng)原性[10-11]，可誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生[12-14]。

目前，國內(nèi)外市售豬瘟檢測試劑盒較多，均為檢測豬瘟抗體，用來評估豬場疫苗免疫效果。為配合豬瘟凈化政策，需要研制豬瘟野毒抗體檢測試劑盒。本項目利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的豬瘟野毒E2蛋白作為包被抗原，用針對豬瘟野毒的單克隆抗體經(jīng)過辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記后作為酶標(biāo)抗體建立阻斷ELISA檢測方法。本研究中使用的豬瘟野毒單克隆抗體為豬瘟野毒株E2蛋白作為免疫原而制備的，其只與不同亞型的豬瘟野毒株發(fā)生反應(yīng)，與豬瘟兔化弱毒疫苗株(C株)不反應(yīng)[15-16]。因此，該單抗可與臨床樣本中感染豬瘟野毒后產(chǎn)生的抗體競爭性結(jié)合包被于抗原板上的豬瘟野毒E2蛋白，有效阻斷樣本中的野毒抗體與包被抗原的反應(yīng)，通過計算阻斷率判定樣本中豬瘟野毒感染情況。該方法可用于臨床上豬瘟野毒感染豬的篩查，為豬瘟凈化計劃提供真實的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

酶標(biāo)板購自廈門怡佳美實驗器材有限公司；豬瘟野毒陽性參考品、豬瘟陰性參考品、豬瘟免疫參考品、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)陽性血清、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)陽性血清、豬細(xì)小病毒(PPV)陽性血清、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)陽性血清均購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；辣根過氧化物酶購自SIGMA公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬IgG多抗購自SIGMA公司；豬瘟野毒單抗細(xì)胞株購自廣州伯尼茲生物科技有限公司[17]；豬瘟野毒E2蛋白、豬瘟野毒單抗和酶標(biāo)野毒單抗為世紀(jì)元亨自制；369份豬瘟陰性血清、84份臨床豬血清由世紀(jì)元亨檢測中心提供(其中78份免疫血清，為免疫哈爾濱元亨藥業(yè)有限公司的豬瘟活疫苗的豬場中獲得；6份豬瘟野毒血清為有豬瘟感染的豬場獲得)；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 豬瘟野毒E2蛋白特異性鑒定

采用間接ELISA方法對豬瘟野毒E2蛋白的特異性進行鑒定。將豬瘟野毒E2蛋白稀釋至0.1 μg/mL的包被濃度，100 μL/孔，加樣完畢后用封板膜覆蓋反應(yīng)板，2～8 ℃放置16～18 h。用PBST洗板1次，每孔加5% 脫脂奶粉，2～8 ℃封閉24 h。將豬瘟野毒陽性參考品、豬瘟免疫參考品、豬瘟陰性參考品、PRRSV陽性血清、PCV2陽性血清、PPV陽性血清、BVDV陽性血清分別進行1∶10稀釋，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)1 h，PBST洗5次。將辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬IgG多抗1∶5 000進行稀釋，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)30 min，PBST洗5次。每孔先加入50 μL 的底物A再加入50 μL 底物B，37 ℃反應(yīng)10 min，每孔加入50 μL終止液，讀取OD450值，計算阻斷率。

1.2.2 抗原最佳包被濃度和酶標(biāo)單抗最佳稀釋度的確定

采用棋盤滴定法。將豬瘟野毒E2蛋白用CB包被液按照1∶500、1∶1 000、1∶3 000、1∶5 000、1∶7 000、1∶10 000進行稀釋，充分混勻后于96孔微量反應(yīng)板上橫向包被，100 μL/孔，加樣完畢后將反應(yīng)板貼上封板膜，2～8 ℃放置16～18 h。用PBST洗板1次，每孔加5% 脫脂奶粉，2～8 ℃封閉24 h。豬瘟野毒陽性參考品、豬瘟陰性參考品按照1∶1進行稀釋，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)1 h，PBST洗5次。將豬瘟野毒酶標(biāo)單抗進行1∶500、1∶1 000、1∶2 000稀釋后自上而下加入到反應(yīng)板內(nèi)，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)30 min，PBST洗滌5次，每孔先加入50 μL 的底物A再加入50 μL 底物B，37 ℃反應(yīng)10 min，每孔加入50 μL終止液，讀取OD450值，計算阻斷率，選擇豬瘟野毒陽性參考品阻斷率最高點對應(yīng)的E2抗原包被濃度和酶標(biāo)單抗?jié)舛葹樽罴褩l件。

1.2.3 包被條件確定

1.2.3.1 包被液的選擇

按照已確定好的E2蛋白最佳包被濃度，分別選用碳酸鹽緩沖液(pH=9.6)、Tris-HCl(pH=8.0)、磷酸鹽緩沖液(pH=7.2)作為包被液進行包被，100 μL/孔，經(jīng)封閉液封閉后，與豬瘟陰性參考品反應(yīng)OD450值最高者即為蛋白吸附效果最好的包被液。

1.2.3.2 包被條件的摸索

按照已確定好的試驗條件，分別選擇2～8 ℃ 10 h、2～8 ℃ 14 h、2～8 ℃ 18 h、2～8 ℃ 24 h、37 ℃ 2 h、37 ℃ 4 h，6個包被條件進行包被，100 μL/孔，經(jīng)封閉液封閉后，與陰性參考品進行反應(yīng)，選擇陰性參考品OD450值高且孔間變異系數(shù)小的包被條件進行包被。

1.2.4 封閉液的選擇

按照已確定好的試驗條件，分別選擇5% BSA、10%脫脂奶粉、10%馬血清、10% 新生牛血清、1%酪蛋白作為封閉液進行封閉，封閉條件為2～8 ℃ 24 h。比較豬瘟陰性參考品的OD450值及N/P值，確定最佳封閉液的成分。

1.2.5 血清稀釋液的選擇

按照已確定好的試驗條件，分別比較5% BSA、5%新生牛血清、10%馬血清、10%脫脂奶粉、10%新生牛血清作為稀釋液的效果。用上述稀釋液分別對豬瘟野毒陽性參考品和豬瘟陰性參考品進行稀釋，比較豬瘟野毒陰性參考品的OD450值、豬瘟野毒陽性參考品的阻斷率及N/P值，從中選擇陰性參考品OD450值高、陽性參考品阻斷率高及N/P值高的稀釋液作為血清稀釋液。

1.2.6 血清稀釋倍數(shù)的選擇

用確定好的包被條件和封閉條件進行包被板制備，將豬瘟野毒陽性參考品、豬瘟免疫參考品和豬瘟陰性參考品分別按照1∶1、1∶4、1∶8進行稀釋，每孔加100 μL，37 ℃反應(yīng)1 h，PBST洗板5次，每孔加入100 μL豬瘟野毒酶標(biāo)單抗，37 ℃反應(yīng)30 min，PBST洗板5次，每孔先加入50 μL 的底物A再加入50 μL 底物B，37 ℃反應(yīng)10 min，每孔加入50 μL終止液，讀取OD450值，計算豬瘟野毒陽性參考品、豬瘟免疫參考品阻斷率。

1.2.7 底物反應(yīng)時間的確定

將豬瘟陰性參考品和豬瘟野毒陽性參考品加到微量反應(yīng)板中，37 ℃反應(yīng)1 h。PBST洗滌5次，每孔加入100 μL豬瘟野毒酶標(biāo)單抗，37 ℃反應(yīng)30 min。PBST洗滌5次后，加入底物液，設(shè)置5個顯示條件，分別為室溫10 min、37 ℃ 5 min、37 ℃ 10 min、37 ℃ 15 min、37 ℃ 20 min，比較陰性參考品與野毒陽性參考品的比值，選擇比值最高的反應(yīng)時間作為顯色時間。

1.2.8 陰陽臨界值的確定

用以上建立的阻斷ELISA方法，檢測369份豬瘟野毒陰性血清，該血清為世紀(jì)元亨于合作豬場中收集的未免疫豬瘟疫苗的血清，其經(jīng)過國際貿(mào)易指定的熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)[18]進行驗證，均為豬瘟抗體陰性。計算阻斷率(%)=(陰性對照OD450平均值-樣品OD450值)/陰性對照OD450平均值×100%，測定血清樣本阻斷率的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。確立陰陽判界為(X+3SD)，當(dāng)血清樣本阻斷率>(X+3SD)時判為陽性；當(dāng)血清樣本阻斷率≤(X+3SD)時判為陰性。

1.2.9 初步臨床應(yīng)用

用建立的阻斷ELISA檢測方法檢測84份臨床豬血清，驗證該方法的應(yīng)用情況。其中78份為免疫世紀(jì)元亨的豬瘟活疫苗的血清，其采自正規(guī)豬場，該豬場免疫背景清晰，并且每年定期采樣進行RT-PCR檢測，CSFV均為陰性，無豬瘟感染史。78份血清經(jīng)過世紀(jì)元亨的CSFV抗體間接ELISA檢測試劑盒(用于疫苗評估)測定，抗體水平一致，離散度均一，免疫效果較好。該血清同時由FAVN試驗測定，均為免疫抗體陽性；另6份為CSFV感染血清，來自有豬瘟感染的豬場。6頭豬用RT-PCR方法進行了扁桃體帶毒情況檢測，均為陽性。用FAVN試驗檢測該6頭豬采取的血清，均為陽性，證實該6份血清為豬瘟野毒感染血清。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬瘟野毒E2蛋白特異性鑒定

采用間接ELISA方法對豬瘟野毒E2蛋白的特異性進行鑒定。豬瘟野毒E2蛋白以0.1 μg/mL包被，制備反應(yīng)板，分別將豬瘟野毒陽性參考品、豬瘟免疫參考品、豬瘟陰性參考品、PRRSV陽性血清、PCV2陽性血清、PPV陽性血清、BVDV陽性血清以1∶10稀釋進行試驗，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，豬瘟野毒E2可與豬瘟野毒陽性參考品發(fā)生較強的特異性反應(yīng)，與豬瘟陰性參考品及其他病毒陽性血清無反應(yīng)。

+為陽性，-為陰性

2.2 豬瘟野毒E2最佳包被濃度和酶標(biāo)單抗最佳稀釋度的確定

通過不同濃度E2包被，確定本檢測方法的豬瘟野毒E2蛋白最佳包被量以及豬瘟野毒酶標(biāo)單抗的最佳使用濃度。由圖2可知，當(dāng)豬瘟野毒酶標(biāo)單抗使用濃度為1∶1 000、野毒E2包被濃度為1∶5 000(對應(yīng)的包被濃度為0.03 μg/mL)時，阻斷率達到最高值，后續(xù)呈現(xiàn)水平狀態(tài)。綜合結(jié)果可見，豬瘟野毒E2最佳包被濃度為0.03 μg/mL，且豬瘟野毒酶標(biāo)單抗最佳稀釋比例為1∶1 000。

圖2 抗原包被濃度和酶標(biāo)單抗稀釋濃度的確定

2.3 包被條件確定

2.3.1 包被液的選擇

通過對3種包被液比較，表明pH=9.6的碳酸鹽緩沖液作為包被液時，檢測豬瘟陰性參考品OD450值最高，效果最好，見圖3，因此選擇pH=9.6的碳酸鹽緩沖液作為包被液。

圖3 最佳包被液的確定

2.3.2 包被條件的摸索

對6個不同包被條件進行比較，結(jié)果見圖4，可知，2～8 ℃包被18 h時，陰性參考品OD450值最高，蛋白吸附量最好，并且包被的板子變異系數(shù)最小，最為穩(wěn)定。因此確定2～8 ℃包被18 h作為包被條件。

圖4 最佳包被條件的確定

2.4 封閉液的選擇

通過對多種封閉液的封閉效果進行比較， 選擇陰性參考品OD450值較高且N/P值較高的作為封閉液，結(jié)果見圖5。從圖中可以看出，10%馬血清作為封閉液時，陰性參考品的OD450值和N/P值均最高，因此，選擇10%馬血清作為封閉液。

圖5 最佳封閉液的確定

2.5 血清稀釋液的選擇

通過對多種稀釋液進行比較，選擇陰性參考品OD450值較高且N/P值較高的作為稀釋液，結(jié)果見圖6，以5%的新生牛血清作為血清和酶的稀釋液為最佳。

圖6 最佳血清稀釋液的確定

2.6 血清稀釋倍數(shù)的選擇

由圖7可知，在豬瘟野毒陽性參考品阻斷率基本不受影響的同時，當(dāng)血清稀釋比例為1∶4時，免疫血清抗體降低效果更明顯，因此最終血清稀釋比例定為1∶4。

2.7 底物反應(yīng)條件的確定

不同底物顯色時間對顯色效果進行比較，結(jié)果見圖8。綜合考慮陰性對照OD450值、N/P值以及試驗操作的便捷性等，最終確定底物顯色條件為37 ℃，10 min為最佳。

圖7 最佳血清稀釋倍數(shù)的確定

圖8 最佳底物反應(yīng)條件的確定

2.8 陰陽臨界值的確定

用以上建立的阻斷ELISA方法，檢測369份豬瘟野毒陰性血清，計算血清樣本阻斷率的平均值為11.42和標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.36，X+3SD=39.51。因此確立陰陽判界為，當(dāng)阻斷率>40%時判為陽性，當(dāng)阻斷率≤40%時判為陰性。

2.9 初步臨床應(yīng)用

用建立的阻斷ELISA方法檢測收集的84份豬臨床血清，結(jié)果見圖9，其中6份CSFV感染血清檢測為豬瘟野毒抗體陽性，其他78份免疫血清均檢測為豬瘟野毒抗體陰性。

圖9 84份臨床血清檢測

3 討論

豬瘟是危害我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的頭號疫病。近年來在免疫壓力及各種環(huán)境變化等因素的影響下，豬瘟的流行特點發(fā)生了很大的變化，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失[19]。雖然我國應(yīng)用豬瘟兔化弱毒疫苗已有60多年，但至今仍未能根除豬瘟，其主要原因是，疫苗免疫程序混亂，帶毒種豬，免疫耐受，相應(yīng)政策法規(guī)不健全等[3]。豬瘟常和其他的疾病混合感染，造成病理變化和臨床癥狀越來越復(fù)雜，給豬瘟的臨床診斷與防治帶來極大困難[20]。目前種豬群中CSFV持續(xù)帶毒感染不僅導(dǎo)致嚴(yán)重的繁殖障礙，而且引起新生仔豬的死亡和免疫耐受，母豬的帶毒感染已成為CSFV傳播的主要原因之一。為此，開展豬群的CSFV凈化已刻不容緩。

目前關(guān)于豬瘟抗體ELISA檢測方法的研究有很多[21-24]，并且國內(nèi)外豬瘟抗體檢測試劑盒也較多，但均用于評估豬場疫苗免疫效果，沒有豬瘟野毒抗體檢測試劑盒上市，無法區(qū)分CSFV自然感染動物和C株疫苗免疫動物的血清抗體。

為查清豬群中豬瘟野毒感染情況，進一步為制定規(guī)?；i場豬瘟控制凈化措施做準(zhǔn)備，本項目利用豬瘟野毒E2和針對豬瘟野毒E2的單克隆抗體作為原料建立了阻斷ELISA檢測方法。該方法中的單抗僅與豬瘟野毒株反應(yīng)，與C株不反應(yīng)，因此可與樣本中的野毒抗體競爭結(jié)合包被抗原，進而確定豬只感染豬瘟的情況。目前，雖然針對CSFV的單克隆抗體研究較多[25-28]，但均未研制成豬瘟野毒抗體檢測試劑盒。本研究建立了豬瘟野毒抗體阻斷ELISA檢測方法并進行了初步驗證，共檢測84份臨床血清，檢測結(jié)果與血清已知背景一致。本試驗建立的抗體阻斷ELISA方法可初步用于臨床上豬瘟野毒感染豬的篩查，為豬瘟凈化計劃提供真實的參考依據(jù)。