李建，姚望，杜星，潘增祥，李齊發(fā)

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類長度20～22個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子(non-coding RNAs，ncRNAs)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs主要通過轉(zhuǎn)錄后水平沉默靶基因表達(dá)，進(jìn)而在各種組織和器官的多種細(xì)胞生理和病理過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[1-2]。在哺乳動(dòng)物卵巢組織中，miRNAs在卵母細(xì)胞、體細(xì)胞(如顆粒細(xì)胞)和卵泡液中廣泛表達(dá)，并調(diào)控多種卵巢功能，從原始卵泡庫的維持和起始，到排卵、黃體形成和卵巢老化[2-4]。在各種卵巢細(xì)胞中，卵巢顆粒細(xì)胞中miRNAs的研究最為深入，涉及各種顆粒細(xì)胞功能，如顆粒細(xì)胞增殖[5]、顆粒細(xì)胞凋亡[2]、顆粒細(xì)胞自噬[6]、類固醇激素分泌[7]和細(xì)胞周期等[8]。目前靶向卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的miRNAs研究最多，如miR-26b[5]、miR-425[9]、miR-1306[10]和miR-204[11]等?；騼?nèi)miR-126通過靶向抑制TGFB2基因，抑制卵巢顆粒細(xì)胞中TGF-β信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖，介導(dǎo)高繁殖力候選基因NORFA對(duì)豬繁殖性能的調(diào)控[2]。眾所周知，芳香化酶P450arom是卵巢顆粒細(xì)胞中雌激素合成通路的限速酶，其編碼基因CYP19A1被發(fā)現(xiàn)受多個(gè)miRNAs如miR-1275[5]、miR-10b[12]和miR-27a-3p[13]等的直接或間接調(diào)控，從而介導(dǎo)miRNAs對(duì)顆粒細(xì)胞雌激素分泌的調(diào)控。但目前關(guān)于靶向調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞周期的miRNAs研究較少[8,14]。本文以豬卵巢顆粒細(xì)胞為研究對(duì)象，利用流式細(xì)胞技術(shù)分析miR-1307在顆粒細(xì)胞周期中的作用，以期為解析哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期的miRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用新鮮卵巢來自南京祿口機(jī)場(chǎng)屠宰場(chǎng)的成年杜長大商品母豬。用75%酒精消毒后的手術(shù)剪將剛屠宰的母豬輸卵管末端的卵巢剪下，簡單清洗后將卵巢浸泡在37 ℃的生理鹽水中，盡快運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑

試驗(yàn)用主要試劑有：DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、Opti-MEM培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素雙抗(PS)(Gibco公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(HyClone公司)；胰蛋白酶-EDTA(0.05%)(Thermo公司)、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(Vazyme 公司)。

1.3 試驗(yàn)儀器

試驗(yàn)所用儀器主要包括：二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-18AIC)(Panasonic公司)、離心機(jī)(TDZ4-WS)(長沙湘智公司)、超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰公司)、流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司)、光學(xué)顯微鏡(YSA100)(Nikon)和微量移液器(Thermo公司)等。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1 生物信息學(xué)分析

豬等哺乳動(dòng)物miR-1307前體和成熟體序列下載自NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm. nih.gov/)和miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)。利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列堿基組成和多重比對(duì)分析。利用在線軟件RNA structure(http://rna.urmc.rochester.edu/RNA structureWeb/)預(yù)測(cè)miR-1307前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用在線軟件Targetscan(http://www.targetscan.org/)和miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)miR-1307的靶基因。利用在線軟件DAVID(https://david-d.ncifcrf.gov/)進(jìn)行GO分析和KEGG功能富集分析。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將采集的母豬卵巢放在37 ℃無菌生理鹽水中，75%酒精和PBS清洗卵巢3～5次后，用10 mL注射器抽取直徑為3～5 mm卵泡的卵泡液。1 000 r/min離心5 min，去除卵泡液；PBS清洗2遍顆粒細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后去除PBS；用DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸混勻細(xì)胞。將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后觀察細(xì)胞貼壁情況，將未貼壁的細(xì)胞用移液槍吸棄；用PBS清洗細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底部且狀態(tài)良好時(shí)鋪板。用5 mL PBS重復(fù)清洗細(xì)胞2遍，加入1 mL的胰酶孵育2 min以消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察到細(xì)胞狀態(tài)，充分漂浮后立即加入等體積的培養(yǎng)基終止消化。1 000 r/min 離心5 min，去除胰酶和培養(yǎng)基混合液；加入DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸混勻細(xì)胞，接種于12孔或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.3 小分子RNA合成

由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成豬miR-1307模擬物(mimics)、抑制劑(inhibitor)和相應(yīng)的陰性對(duì)照(NC)等小分子RNA。詳細(xì)序列見表1。

表1 小分子RNA序列

1.4.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

豬卵巢顆粒細(xì)胞在6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。待每孔長到80%～90%時(shí)，利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將小分子RNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染時(shí)的培養(yǎng)基是不含胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染4 h后將培養(yǎng)基換成含有15% FBS和2% PS的DMEM/F-12培養(yǎng)基。詳細(xì)的轉(zhuǎn)染步驟參考文獻(xiàn)[5]。

1.4.5 細(xì)胞周期分析

豬卵巢顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后棄掉培養(yǎng)基，用預(yù)熱的PBS輕洗細(xì)胞，棄掉PBS，每孔細(xì)胞用1 mL預(yù)熱的胰酶消化懸浮細(xì)胞，再用培養(yǎng)基終止消化。1 000 r/min離心5 min，吸棄液體；用500 μL預(yù)冷的PBS輕洗細(xì)胞2次，用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒中的RNase A溶液與碘化丙啶(PI)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，利用細(xì)胞內(nèi)DNA能夠和PI結(jié)合的特性，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞各個(gè)時(shí)期的DNA含量。用Modifit軟件(Verity Software House公司)對(duì)細(xì)胞周期結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS v20.0(IBM公司)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，用t檢驗(yàn)來評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。用GraphPad Prism 5軟件 (GraphPad Software公司)制作柱形圖。所有試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬miR-1307序列分析

豬miR-1307前體序列(cDNA)的長度為80 bp，其中堿基A、T、G和C的含量分別為16.25%、22.50%、30.00%和31.25%。序列分析發(fā)現(xiàn)豬miR-1307前體序列與人、牛、羊、黑猩猩和家犬等物種的一致性分別為53.02%、53.02%、53.2%、53.38%和75%(圖1)。豬miR-1307成熟序列為5′-ACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUG-3′，與人、牛、羊、黑猩猩和家犬等物種的一致性分別為100%、100%、95.65%、100%和100%。豬miR-1307種子序列(CUCGGCG)與哺乳動(dòng)物其他物種完全一致，說明哺乳動(dòng)物miR-1307序列高度保守。

染色體定位分析發(fā)現(xiàn)豬miR-1307定位于14號(hào)染色體，在基因組的114 325 624～114 325 703 nt之間，而人、牛、羊、黑猩猩和家犬等哺乳動(dòng)物miR-1307則分別位于10、26、26、10和28號(hào)染色體上。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物miR-1307均位于編碼基因ATP5MD的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與第1外顯子之間(圖2)，說明哺乳動(dòng)物miR-1307基因定位也比較保守。

2.2 豬miR-1307 前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用RNA structur在線軟件對(duì)豬miR-1307前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析，發(fā)現(xiàn)豬miR-1307前體序列的最小折疊自由能(minimum free energy，MFE)小于-20 kcal/mol，并且能夠折疊形成典型的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。同時(shí)，結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-1307成熟序列位于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的臂上，符合miRNA的形成機(jī)制。

2.3 豬miR-1307功能預(yù)測(cè)

利用2種算法預(yù)測(cè)了miR-1307的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Targetscan預(yù)測(cè)的靶基因?yàn)? 693個(gè)，miRWalk預(yù)測(cè)的靶基因?yàn)? 924個(gè)，2種算法預(yù)測(cè)到的公共靶基因?yàn)?67個(gè)共同的靶基因。利用DAVID軟件對(duì)miR-1307的靶基因進(jìn)行功能富集分析。GO分析結(jié)果顯示，在生物學(xué)進(jìn)程中，miR-1307的靶基因主要富集在rRNA分解代謝進(jìn)程、炎癥反應(yīng)和白細(xì)胞趨化性等通路中；在細(xì)胞組成上，miR-1307的靶基因主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、基底膜以及溶酶體的組成有關(guān)；在分子功能方面，miR-1307的靶基因主要參與蛋白酪氨酸磷酸酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性和外核糖核酸酶活性等過程(圖3)。KEGG通路分析顯示，miR-1307靶基因與催產(chǎn)素信號(hào)通路顯著相關(guān)(P<0.05)，雖然也富集到關(guān)于RNA降解和趨化因子信號(hào)途徑，但是相關(guān)性不顯著(圖4)。

has. 人；ssc. 豬；bta. 牛；chi. 羊；ptr. 猩猩；cfa. 家犬。下同

圖2 哺乳動(dòng)物miR-1307染色體定位

1.rRNA分解代謝進(jìn)程；2. 抗原刺激的炎癥反應(yīng)；3. 白細(xì)胞趨化反應(yīng)；4. 藥物反應(yīng)；5. 干細(xì)胞生長因子受體信號(hào)；6. 4型過敏反應(yīng)；7. 樹突狀細(xì)胞分化；8. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；9. 基底膜；10. 溶酶體；11. 核外泌體；12. 核膜；13. 蛋白酪氨酸磷酸酶活性；14. 轉(zhuǎn)錄因子活性；15. 核糖核酸外切酶活性；16. ATP結(jié)合

圖4 miR-1307靶基因KEGG通路分析結(jié)果

2.4 過表達(dá)miR-1307對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞周期的影響

為了分析miR-1307在卵巢顆粒細(xì)胞中的功能，將miR-1307 mimics轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細(xì)胞中，利用FACS技術(shù)檢測(cè)顆粒細(xì)胞周期情況，結(jié)果如圖5。miR-1307過表達(dá)后豬卵巢顆粒細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例增加，而S期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)，說明miR-1307過表達(dá)可抑制細(xì)胞S期DNA合成過程，導(dǎo)致豬卵巢顆粒細(xì)胞的G0/G1期阻滯。

2.5 抑制miR-1307對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞周期的影響

為了進(jìn)一步研究miR-1307在豬卵巢顆粒細(xì)胞周期中的作用，將miR-1307 inhibitor轉(zhuǎn)染到豬卵巢顆粒細(xì)胞中抑制miR-1307的表達(dá)，利用FACS技術(shù)檢測(cè)顆粒細(xì)胞周期情況，結(jié)果如圖6。抑制miR-1307后豬卵巢顆粒細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例減少(但未達(dá)顯著水平)，而S期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05)，說明抑制miR-1307可促進(jìn)S期細(xì)胞DNA合成，預(yù)示豬卵巢顆粒細(xì)胞增殖水平增加。

A.對(duì)照組流式圖；B. miR-1307過表達(dá)組流式圖；C. 流式結(jié)果量化圖。*表示P<0.05。下同

A.對(duì)照組流式圖；B. miR-1307抑制組流式圖；C.流式結(jié)果量化圖

3 討論

眾所周知，miRNA是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA[15]。本文通過miRNA序列分析發(fā)現(xiàn)， miR-1307的序列(特別是成熟序列和種子序列)和基因組定位在哺乳動(dòng)物中均高度保守。這與前人對(duì)其他miRNAs的研究是一致的[2,5]。Du等[2]研究發(fā)現(xiàn)脊椎動(dòng)物miR-126基因前體序列高度保守，成熟序列(UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG)和種子序列(CGUACCG)完全一致，且都定位于表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域蛋白7(EGF like domain multiple 7，EGFL7)基因內(nèi)含子區(qū)。Liu等[5]研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物miR-26b基因前體序列高度一致(豬與小鼠、大鼠序列一致性為96.51%)，成熟序列(UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU)和種子序列(UCAAGUA)則完全一致，且都定位于編碼基因。另外，本文利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)合前人研究發(fā)現(xiàn)miR-1307的潛在靶基因參與調(diào)控多個(gè)生物學(xué)過程，如ISM1(isthmin 1)基因、DAB2互作蛋白(DAB2 interacting protein，DAB2IP)基因和B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，BCL2)基因等。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，ISM1已被證實(shí)是miR-1307的功能靶基因，miR-1307可靶向調(diào)控ISM1基因進(jìn)而影響凋亡相關(guān)基因如Caspase3、周期相關(guān)基因如細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)以及增殖相關(guān)基因Ki67的蛋白水平，從而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并使細(xì)胞周期阻滯在G1期[16]。在肝癌細(xì)胞中，顯著上調(diào)的miR-1307能夠靶向抑制DAB2IP來促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[17]。在我們預(yù)測(cè)的miR-1307潛在靶基因中，BCL2和X-連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是細(xì)胞凋亡標(biāo)志基因，是哺乳動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的重要抑制因子[5,7,9,18-19]。另外，本文通過KEGG功能富集分析發(fā)現(xiàn)miR-1307靶基因還富集在催產(chǎn)素信號(hào)通路中，其中CD38是促進(jìn)催產(chǎn)素分泌的關(guān)鍵因子[20-21]；而原癌基因SRC的活化介導(dǎo)了表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)放大催產(chǎn)素信號(hào)溶解黃體的過程[22]。綜上所述，豬miR-1307與其他哺乳動(dòng)物高度保守，可能與其他哺乳動(dòng)物miR-1307一樣，在眾多生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。

在真核生物中，細(xì)胞周期一般包括4個(gè)階段，G1期、S期、G2期和M期(有絲分裂期)。miRNAs與細(xì)胞周期密切相關(guān)，研究證實(shí)miRNAs可通過調(diào)節(jié)各個(gè)階段的關(guān)鍵細(xì)胞周期蛋白及其調(diào)節(jié)因子的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程[23]。例如，在人類乳腺癌細(xì)胞中，miR-17/20通過靶向抑制細(xì)胞周期蛋白CCND1來影響細(xì)胞周期進(jìn)程[24]。Let-7的低表達(dá)通過直接或間接影響細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子如周期依賴性激酶4/6(cyclin dependent kinase 4/6，CDK4/6)和細(xì)胞分裂周期蛋白25A(cell division cycle 25A，CDC25A)的表達(dá)，改變肺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程和增殖，進(jìn)而誘導(dǎo)其有絲分裂[25]。miR-30a和miR-145通過作用于多種癌細(xì)胞中周期相關(guān)基因，影響多發(fā)癌患者的生存率[26]。在正常細(xì)胞如牛肌細(xì)胞中，肌肉特異性表達(dá)的miR-208b通過靶向抑制周期相關(guān)基因CDK抑制劑1A(CDK inhibitor 1A，CDKN1A)，進(jìn)而影響細(xì)胞周期和增殖[27]。在牛卵巢顆粒細(xì)胞中，miRNA-183-96-182簇通過靶向抑制叉頭框蛋白O1(forkhead box O1，F(xiàn)OXO1)基因，調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期[14]。本文研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)或抑制miR-1307可影響豬卵巢顆粒細(xì)胞周期進(jìn)程，首次證實(shí)miR-1307與哺乳動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞的細(xì)胞周期有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-1307是細(xì)胞周期的重要表觀調(diào)節(jié)因子，在前列腺癌細(xì)胞中miR-1307通過靶向叉頭框蛋白O3A(forkhead box O3A，F(xiàn)OXO3A)基因的3′-UTR抑制FOXO3A的表達(dá)水平，進(jìn)而下調(diào)其下游基因即細(xì)胞周期抑制因子p21和p27的表達(dá)，從而影響細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期[28]?？傊疚难芯勘砻髟谪i卵巢顆粒細(xì)胞中，miR-1307是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵miRNA。但是，miR-1307通過調(diào)控下游靶基因影響豬卵巢顆粒細(xì)胞周期的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。