宋啟春,趙 研,李 東,宋繼東,樊立宏,時志斌

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨一科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:zhibin-shi@126.com)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種常見慢性關(guān)節(jié)退行性疾病,多發(fā)生于老年人,表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨破壞、關(guān)節(jié)邊緣骨質(zhì)增生及軟骨下骨硬化[1-3]。流行病學(xué)研究顯示,骨關(guān)節(jié)炎是導(dǎo)致下肢殘疾的十大常見病因之一,發(fā)病率逐年提高,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[4]。軟骨細(xì)胞炎癥和細(xì)胞基質(zhì)丟失一直被認(rèn)為是加重骨關(guān)節(jié)炎進程的重要病因之一[5]。

盤龍七片是由著名老中醫(yī)王家成所獻祖?zhèn)髅胤?經(jīng)科學(xué)研制而成的中成藥,臨床應(yīng)用表明其對骨關(guān)節(jié)炎病癥具有顯著療效[6,7]。然而關(guān)于盤龍七片對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷的保護作用及其相關(guān)機制的研究仍然極為有限。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)作為一類異質(zhì)性非編碼RNA,其基因組的數(shù)量在發(fā)育和分化過程中顯著增加,證明lncRNA在基因表達調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用[8]。有研究表明,lncRNA前列腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(prostate cancer-asso-ciated transcript 1,PCAT-1)在關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中被顯著上調(diào);在分離培養(yǎng)的人關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中下調(diào)PCAT-1可顯著抑制細(xì)胞凋亡[9]。目前為止,沒有報道表明盤龍七片是否可通過PCAT-1緩解關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的損傷及炎癥反應(yīng)。本研究通過分離培養(yǎng)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞,探究盤龍七片對其保護作用及作用機制,為解析盤龍七片治療骨關(guān)節(jié)炎的藥理機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

ACAN兔單抗、COL2A1兔單抗、MMP-13單抗、Caspase-3兔單抗、GAPDH兔多抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自英國Abcam公司;BCA試劑盒購自美國Pierce公司;TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒購自美國Cell Singnal Technology公司;SuperScriptTMPreamplification System for First Strand cDNA Synthesis試劑盒購自美國Gibco公司;pDNA3.1-PCAT-1購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2 骨性關(guān)節(jié)炎模型的建立

8周齡雄性SD大鼠45只,體質(zhì)量280-320 g,采購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,2%水合氯醛0.2 ml/10 g腹腔內(nèi)注射麻醉小鼠,夾尾無反應(yīng)后,曲屈大鼠膝關(guān)節(jié),于關(guān)節(jié)兩側(cè)進針。在1,4,7 d,分別將0.2 ml 4%木瓜蛋白酶水溶液注射到膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)(刺破關(guān)節(jié)腔時有突破感,注射藥物時無阻力)。隨后進行膝關(guān)節(jié)Lequesne MG評估級別,平均評分>40說明大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型建立成功。

1.3 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)及分組

脫頸法處死關(guān)節(jié)炎模型大鼠,75%乙醇內(nèi)浸泡消毒15 min,PBS清洗,分離大鼠四肢并放入D-Hanks液內(nèi),分離并剝離大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織,剪切組織小塊(1 mm3),轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)(15 ml),用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 ℃消化30 min,37 ℃條件下用2 mg/ml Ⅱ型膠原酶消化4 h,以1 000 r/min離心收集底層軟骨細(xì)胞,加入含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,37 ℃、5%CO2培養(yǎng),每2 d更換1次培養(yǎng)基,使用0.25%胰蛋白酶消化傳代。實驗分組如下:對照組(正常培養(yǎng)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞),30,60,90,120 μg/ml組(30,60,90,120 μg/ml盤龍七片處理24 h的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞),盤龍七片+PCAT-1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PCAT-1后60 μg/ml盤龍七片處理24 h的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞),盤龍七片+pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1后60 μg/ml盤龍七片處理24 h的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞)。

1.4 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡檢測

采用TUNEL法測定對照組、30 μg/ml組、60 μg/ml組、90 μg/ml組、120 μg/ml組的細(xì)胞凋亡。吸棄細(xì)胞的培養(yǎng)基,PBS洗滌3次,加入1 ml 4%的多聚甲醛,固定細(xì)胞20 min,用PBS清洗3次,按照說明書配制TUNEL檢測液,每個樣品中加入50 μl TUNEL檢測液,37 ℃孵育60 min,而后用PBS清洗2次,每次3 min。用熒光淬滅封片液封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞DNA含量檢測

對照組、30 μg/ml組、60 μg/ml組、90 μg/ml組、120 μg/ml組爬片處理后,PBS洗滌2次,加500 μl蛋白酶K溶液,置于56 ℃環(huán)境下6 h,加入1 μl Hoechst 33258,室溫下避光反應(yīng)30 min,在熒光酶標(biāo)儀上,檢測460 nm處上清液的吸光度值。以小牛胸腺DNA為標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算出各組樣本中DNA含量。

1.6 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖檢測

CCK-8法測定對照組、30 μg/ml組、60 μg/ml組、90 μg/ml組、120 μg/ml組、盤龍七片+PCAT-1組和盤龍七片+pcDNA3.1組細(xì)胞增殖。取培養(yǎng)后第3-5代軟骨細(xì)胞,以1×104/孔的密度接種于96孔板,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h,待其細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度盤龍七片或細(xì)胞轉(zhuǎn)染,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,PBS清洗,每孔加入10 μl CCK-8試劑繼續(xù)孵育2 h。酶標(biāo)儀測定各孔490 nm波長處吸光度值,每組3個復(fù)孔取平均值。

1.7 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥因子檢測

ELISA試劑盒檢測對照組、30 μg/ml組、60 μg/ml組、90 μg/ml組、120 μg/ml組、盤龍七片+PCAT-1組和盤龍七片+pcDNA3.1組IL-1β和TNF-α水平。收集各組細(xì)胞,以12 000 r/min 4 ℃離心20 min,取上清液,按照ELISA試劑盒說明書進行檢測,首先樣品加入反應(yīng)孔后37 ℃孵育45 min,洗滌液洗滌后加入生物素標(biāo)記的抗體37 ℃反應(yīng)30 min。然后加鏈霉親和素-HRP混勻37 ℃反應(yīng)30 min,再加入顯色劑避光顯色15 min。最后加終止液終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值,計算各因子含量。

1.8 RT-qPCR檢測骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中PCAT-1含量檢測

按照Trizol說明書提取對照組和60 μg/ml組細(xì)胞總RNA,采用SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis試劑盒合成cDNA。按照TaKaRa熒光定量試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系,以GAPDH為內(nèi)參進行PCR擴增,每個樣品重復(fù)3次,循環(huán)條件為95 ℃ 30 s,60 ℃30 s;72 ℃30 s,共40個循環(huán);60 ℃延長5 min。PCAT-1上游引物:5′-AAT GGC ATG AAC CTG GGA GGC G-3′,下游引物:5′-GGC TTT GGG AAG TGC TTT GGA G-3′;GAPDH上游引物:5′-ACT GGC GTC TTC ACC3′,下游引物:5′-CGA ACA TGG GGG CAT-3′。2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.9 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中蛋白含量檢測

采用Western blot方法檢測對照組、30 μg/ml組、60 μg/ml組、90 μg/ml組、120 μg/ml組、盤龍七片+PCAT-1組和盤龍七片+pcDNA3.1組中蛋白含量。收集各組細(xì)胞,加入RIPA裂解液,在冰上裂解15 min,以12 000 r/min 4 ℃離心30 min,棄去上清液。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h,PBS洗去封閉液,加一抗:ACAN、COL2A1、MMP-13、Caspase-3或GAPDH兔多克隆抗體(均為1 ∶800),4 ℃孵育過夜。PBS清洗膜,加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗,室溫孵育1 h,加入ECL發(fā)光液避光顯影于凝膠成像儀曝光拍照。GAPDH為內(nèi)參對照蛋白。

1.10 pDNA3.1-PCAT-1轉(zhuǎn)染骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞

將骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞接種于96孔板,37 ℃,5%CO2條件下培養(yǎng)12 h,待細(xì)胞融合達到80%,按照轉(zhuǎn)染試劑Turbofect操作說明進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗。將0.3 μg pDNA3.1-PCAT-1或pDNA3.1分別與0.6 μl Turbofect混勻,而后轉(zhuǎn)染進入于96孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞,37 ℃,5% CO2孵育24 h用60 μg/ml盤龍七片處理24 h。采用RT-qPCR方法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 盤龍七片促進骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖

結(jié)果表明,與對照組比較,30 μg/ml盤龍七片對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖無明顯的作用,60,90,120 μg/ml盤龍七片均可顯著促進骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖(P<0.05,見圖1)。另外DNA含量檢測同樣顯示30 μg/ml組中DNA含量較對照組無明顯變化。60,90,120 μg/ml組DNA含量較對照組均有顯著上升(P<0.05,見圖1)。

2.2 盤龍七片抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡

TUNEL實驗顯示,與對照組比較,30 μg/ml盤龍七片對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡沒有明顯的作用。60,90,120 μg/ml盤龍七片均可顯著抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡(P<0.05,見圖2)。Caspase-3活性檢測中,與對照組比較,30 μg/ml盤龍七片對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞Caspase-3活性沒有明顯的作用。60,90,120 μg/ml組較對照組可顯著抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞Caspase-3活性(P<0.05,見圖2)。

2.3 盤龍七片對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)合成及降解的作用

與對照組比較,30 μg/ml盤龍七片對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞ACAN、COL2A1和MMP-13蛋白表達量均沒有明顯的作用。60,90,120 μg/ml組較對照組顯著抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞MMP-13蛋白表達量和促進ACAN和COL2A1蛋白表達量(P<0.05,見圖3)。

與對照組比較,*P<0.05圖1 盤龍七片對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖和DNA含量的影響Figure 1 Effect of Panlongqi tablets on proliferation and DNA content of osteoarthritis chondrocytes

與對照組比較,*P<0.05圖2 盤龍七片對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effect of Panlongqi tablets on the apoptosis of osteoarthritis chondrocytes

2.4 盤龍七片抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥相關(guān)因子

與對照組比較,30 μg/ml盤龍七片對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中IL-1β和TNF-α表達量均沒有明顯的作用,60,90,120 μg/ml組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞IL-1β和TNF-α表達量則顯著降低(P<0.05,見圖4)。綜上,本研究選用60 μg/ml盤龍七片進行后續(xù)試驗。

與對照組比較,*P<0.05圖3 盤龍七片對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞ACAN、COL2A1和MMP-13蛋白表達量的影響Figure 3 Effect of Panlongqi tablets on ACAN, COL2A1 and MMP-13 protein expression in osteoarthritis chondrocytes

與對照組比較,*P<0.05圖4 盤龍七片對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥因子含量的影響Figure 4 Effect of Panlongqi tablets on the content of inflammatory factors in osteoarthritis chondrocytes

2.5 盤龍七片抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中PCAT-1

結(jié)果顯示,與對照組比較,60 μg/ml盤龍七片可顯著抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中PCAT-1表達量(P<0.05,見圖5)。

2.6 盤龍七片可通過PCAT-1抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷

盤龍七片+PCAT-1組中PCAT-1表達量較盤龍七片+pcDNA3.1組顯著升高(P<0.05,見圖6),過表達實驗成功。與盤龍七片+pcDNA3.1組比較,盤龍七片+PCAT-1組中細(xì)胞增殖和ACAN蛋白表達量均顯著降低(P<0.05),Caspase-3活性、MMP-13、IL-1β和TNF-α水平均顯著升高(P<0.05,見圖6)。

與對照組作比較,*P<0.05圖5 盤龍七片對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中PCAT-1表達量的影響Figure 5 Effect of Panlongqi tablets on the expression of PCAT-1 in osteoarthritis chondrocytes

與60 μg/ml組作比較,*P<0.05圖6 盤龍七片可通過PCAT-1抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷Figure 6 Panlongqi tablets inhibits osteoarthritis chondrocyte damage through PCAT-1

3 討論

關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)楹诵?累及骨質(zhì),并包括滑膜、關(guān)節(jié)囊及關(guān)節(jié)囊外其他結(jié)構(gòu)的不同程度的炎性病變[10,11],其重要特征是軟骨細(xì)胞死亡及軟骨基質(zhì)代謝失衡,軟骨細(xì)胞炎癥因子的表達和異常凋亡對關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要[12,13]。近年來,醫(yī)藥工作者利用中醫(yī)藥手段治療骨性關(guān)節(jié)炎等相關(guān)疾病,取得了大量研究成果[14]。盤龍七片以盤龍七、竹根七、羊角七、青蛙七、川烏、草烏、當(dāng)歸、杜仲、紅花、過山龍、丹參等為主要成分,具有活血、通絡(luò)、抗炎和祛風(fēng)濕等藥理作用[15]。臨床應(yīng)用表明,盤龍七片對包括骨關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的不同類型的骨科疾病均具有明顯的臨床療效,既往關(guān)于盤龍七片治療骨關(guān)節(jié)炎的研究主要針對其臨床療效,對其調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的具體機制的研究極為有限[16-18]。因而,探究盤龍七片對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥和骨基質(zhì)代謝的作用及機制具有重要意義。ACAN和COL2A1是構(gòu)成軟骨基質(zhì)的主要成分[19]。IL-1β和TNF-α是重要的炎癥因子,可刺激基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的合成,而MMPs具有促進軟骨基質(zhì)降解的作用[20,21]。本研究通過建立大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型并分離培養(yǎng)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞,探究盤龍七片對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥和骨基質(zhì)代謝的作用。結(jié)果表明,30 μg/ml盤龍七片對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、凋亡、DNA含量、炎癥因子水平(IL-1β和TNF-α)、ACAN、COL2A1、MMP-13和Caspase-3蛋白表達量均無明顯作用,我們推測是因為盤龍七片濃度太低,無法發(fā)揮作用。與對照組相比,60,90,120 μg/ml組均顯著促進骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、DNA含量、ACAN和COL2A1蛋白表達,同時顯著降低骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡、炎癥因子水平(IL-1β和TNF-α)、MMP-13和Caspase-3蛋白表達量;同時,60,90,120 μg/ml三組之間無顯著差異。因此,本研究首次揭示盤龍七片(60,90,120 μg/ml)可顯著促進體外培養(yǎng)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖,抑制其凋亡、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞基質(zhì)降解。

近年來研究發(fā)現(xiàn),lncRNA在關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、凋亡過程中和維持軟骨細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要作用[22-24]。研究人員發(fā)現(xiàn)敲除lncRNA MFI2-AS1可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷和軟骨基質(zhì)降解,從而減緩關(guān)節(jié)炎的疾病進展[25]。Li等[26]干擾LPS誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的lncRNA MALAT1后發(fā)現(xiàn),細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)降低,同時細(xì)胞凋亡和炎癥因子水平顯著升高。最近,Zhou等[9]發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的PCAT-1表達量上升,干擾PCAT-1可顯著抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡,過表達PCAT-1顯著促進凋亡。然而還沒有文獻報道表明盤龍七片是否可以通過PCAT-1調(diào)控關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷。本研究表明盤龍七片(60 μg/ml)顯著抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞PCAT-1的表達量,且過表達PCAT-1可明顯抵消盤龍七片(60 μg/ml)對關(guān)節(jié)炎軟細(xì)胞增殖和ACAN蛋白表達量的促進作用,及對IL-1β和TNF-α水平、Caspase-3和MMP-13蛋白表達量的抑制作用。本研究中過表達PCAT-1對細(xì)胞凋亡的作用與Zhou等[9]報道的PCAT-1對關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的作用一致。本研究提示,在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中,盤龍七片可能通過下調(diào)PCAT-1的表達量,進一步促進骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖,抑制凋亡、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞基質(zhì)降解。

綜上所述,盤龍七片可能通過調(diào)控PCAT-1對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖和軟骨基質(zhì)形成具有促進作用,且抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥因子生成,進而抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷,為解析盤龍七片治療骨關(guān)節(jié)炎的藥理機制提供依據(jù)。