于士軍，程 銘，周怡倩，王 偉，徐志香，徐馨怡，劉金月

1.滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽滁州,239000；2.宣城市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管局，安徽宣城,242000

中國是藥用植物資源最豐富的國家之一，對藥用植物的發(fā)現(xiàn)、使用和栽培，有悠久的歷史。世界衛(wèi)生組織報(bào)告顯示，世界上將近80%的人口在其主要醫(yī)療保健中依靠非常規(guī)藥物治療，尤其是食用功能性草藥[1]。艾草(ArtemisiaargyiLévl.et Van.)，又名艾葉、香艾、艾蒿，為菊科多年生草本植物艾的葉。主要分布于北溫帶地區(qū)，特別是亞洲、歐洲和北美洲[2]，中國大部分地區(qū)均產(chǎn)。《本草綱目》記載：艾草具有驅(qū)邪、凈化之功效；驅(qū)寒止痛、美容養(yǎng)顏、延緩衰老之功能[3]。目前對艾草的研究多集中于可食用植物化學(xué)物質(zhì)，如精油[4]、類黃酮、有機(jī)酸[5]、萜烯[6]、多糖[7]和香豆素[6]等，現(xiàn)代研究證明這些特征成分對健康有積極影響，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌消炎[8]、抗骨質(zhì)疏松[9]、保護(hù)神經(jīng)[10]和免疫調(diào)節(jié)[7]等作用，但不同干燥方式對艾草品質(zhì)的影響方面的研究鮮見報(bào)道。

中藥指紋圖譜基于對中藥物質(zhì)群整體作用的認(rèn)識，借助光譜和色譜等手段獲得藥物特征圖譜，可用于鑒別中藥真?zhèn)渭霸u價(jià)其質(zhì)量一致性，同時(shí)反映中藥中多種成分的含量情況，對全面控制其質(zhì)量尤為重要[11]。本文主要以艾草主要有效物質(zhì)酚類化合物含量為指標(biāo)，建立高效液相色譜指紋圖譜，并比較不同干燥方式對艾草總黃酮含量及抗氧化活性的影響，綜合考察較為常見的熱風(fēng)干燥、曬干和陰干3種干燥方式對艾草的影響，并進(jìn)行主成分分析和聚類分析，以期為艾草干燥方式的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀 器

Agilent 1260II高效液相色譜儀，美國安捷倫公司，配備自動進(jìn)樣器、四元泵、DAD檢測器、在線脫氣裝置、ChemStation工作站；BPG-9070A鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；KQ3200DA數(shù)控超聲波清洗器，深圳潔盟清洗設(shè)備公司；SpectraMax Plus384全波長酶標(biāo)儀，Molecular Devices公司；JP-400B高速多功能粉碎機(jī)，永康市久品公司；MINI-10K+微型離心機(jī)，杭州米歐公司；HX-01N真空泵，順信科技公司；FA2204B分析天平，上海越平公司；SFY-20紅外線快速水分測定儀，深圳市冠亞電子科技有限公司。

1.2 試劑與樣品

磷酸(分析純)，深圳市科天化玻儀器有限公司；甲醇(分析純)，甲醇(色譜純)，天津科密歐公司。去離子水、超純水為實(shí)驗(yàn)室自制，其他試劑均為分析純。

對照品木犀草苷(批號：MUST-15012204，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.77%)，綠原酸(批號：MUST-15041814，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.39%)，均購自成都曼思特生物科技有限公司；異綠原酸A(產(chǎn)品編號：I117946，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.00%)，蘆丁(產(chǎn)品編號：R189033，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.00%)，表兒茶素(產(chǎn)品編號：E107318，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.00%)，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；艾草樣品采集自安徽省明光市澗溪鎮(zhèn)祝崗村(N 118°16′1.65″，E 32°48′15.49″)。

1.3 方 法

1.3.1 樣品干燥與制備

曬干干燥(SD)：艾草平鋪在紗網(wǎng)上，置于陽光直射下，溫度25～30 ℃之間，光照強(qiáng)度6×104～105lx；陰干干燥(SHD)：艾草平鋪在紗網(wǎng)上，放在陰涼干燥通風(fēng)的室內(nèi)，平均溫度為20～25 ℃；熱風(fēng)干燥(HAD)：設(shè)定干燥溫度60 ℃，風(fēng)速2.5 m/s。以上干燥后樣品控制含水分量在5%～10%左右。

用粉碎機(jī)對3種干燥方式處理的艾草樣品進(jìn)行粉碎，每次時(shí)間1 min，每次間隔10 min，粉碎5次，過80目篩。將3種方式干燥的粉狀樣品1式4份裝入密封袋，存放于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 對照品溶液配制

分別精密稱取對照品綠原酸、異綠原酸A、木犀草苷、蘆丁和表兒茶素對照品適量，置于25 mL，用75%甲醇配置成含綠原酸102.00 g/mL、異綠原酸A 61.20 g/mL、木犀草苷52.00 g/mL、蘆丁415.00 g/mL和表兒茶素78.80 g/mL。用0.22 m微孔濾膜過濾，得混合對照品溶液，備用。

1.3.3 供試品溶液配制

分別精確稱取3種不同干燥方式獲得的艾草樣品粉末0.20 g，置20 mL離心管中，加入75%甲醇5 mL，每種樣品做4個(gè)重復(fù)。在300 W、30 ℃條件下超聲30 min(過程中每隔10 min須搖晃混勻)，用離心機(jī)在8 000 r/m條件下離心5 min，然后用一次性注射器吸取上清液1 mL，通過有機(jī)系濾頭(0.22 μm)過濾裝入樣品瓶中，得到供試品溶液。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 m)；流動相：0.5%磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：320 nm；進(jìn)樣量：10 L。采用梯度洗脫：0～5 min，35% A；20 min，42% A；22 min，50% A；25 min，70% A；30min，70% A；33 min，35% A；37 min，35% A。

1.3.5 指紋圖譜方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)取陰干干燥艾草制成的供試品溶液，在“1.3.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，以峰面積穩(wěn)定、峰形良好、保留時(shí)間適宜的14號色譜峰為參照峰，計(jì)算其余色譜峰相對保留時(shí)間RSD為0.02%～0.18%，相對峰面積RSD為0.02%～3.57%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)取熱風(fēng)干燥艾草制成的供試品溶液，于0、2、4、6、8、24 h在“1.3.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得共有峰相對保留時(shí)間RSD為0.25%～2.47%，相對峰面積RSD為0.23%～3.56%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)取曬干干燥艾草6份，每份0.20 g，按“1.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.3.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得共有峰相對保留時(shí)間RSD為0.04%～0.28%，相對峰面積RSD為1.82%～5.06%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.3.6 總黃酮含量的測定

移取各干燥方法的艾草總黃酮提取液1 mL，置10 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為5% NaNO20.4 mL，搖勻，放置10 min，再加入體積分?jǐn)?shù)為10%的Al(NO3)3溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min，最后加入體積分?jǐn)?shù)為4% NaOH溶液4 mL，搖勻，用70%乙醇溶液定容至刻度線，靜置15 min，于510 nm波長處測定吸光度A。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)對照，按上述方法，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。

1.3.7 抗氧化性的測定

參考文獻(xiàn)[13-15]方法進(jìn)行微調(diào)測定DPPH清除率，DPPH用無水乙醇配制成0.2 mmol/L溶液。依次在10 mL離心管中加入1 mL樣品提取液和4 mL DPPH溶液，充分混勻，室溫環(huán)境避光放置30min，在517 nm波長處測定吸光度值，平行測試3次，計(jì)算清除率。DPPH清除率=[A0-(A1-A2)]/A0，其中A1：1 mL樣品提取液+4 mL DPPH溶液的吸光度；A2：1 mL樣品提取液+4 mL無水乙醇的吸光度；A0：1 mL 75%甲醇+4 mL DPPH溶液的吸光度。

參考文獻(xiàn)[16-17]并略做修改，采用鐵氰化鉀還原法測定不同方式干燥艾草的總還原力。吸取樣品提取液1 mL于20 mL離心管中，依次加入0.2 mol/L磷酸緩沖溶液2.50 mL、1%鐵氰化鉀溶液2.50 mL，于50 ℃保溫20 min，快速冷卻，再加入10%三氯乙酸溶液2.50 mL，以3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入無水乙醇2.50 mL、0.1%三氯化鐵溶液0.50 mL，混勻，以0.20 mg/mL維生素C溶液做陽性對照，使用酶標(biāo)儀于700 nm處測定吸光度。

參照文獻(xiàn)[18-20]的方法測定不同方式干燥艾草清除羥基自由基能力。取樣品提取液1 mL于20 mL離心管中，分別加入6 mmol/mL硫酸亞鐵溶液1 mL、6 mmol/mL水楊酸-乙醇溶液1 mL、6 mmol/mL過氧化氫溶液1 mL、混合均勻，37 ℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)1 h，使用酶標(biāo)儀于510 nm處測定體系吸光度(Ai)；以蒸餾水取代過氧化氫溶液，測定吸光度(Aj)；以蒸餾水取代待樣品提取液，測定空白吸光度(A0)，計(jì)算清除力。清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用中藥色譜指紋圖相似度評價(jià)系統(tǒng)、SIMCA、SPSS 23.0和Excel 2017等軟件進(jìn)行處理，通過單因素方差分析以及LSD多重比較法對不同方式干燥艾草中指標(biāo)含量的差異顯著性進(jìn)行分析討論，顯著性水平P<0.05；然后從主成分分析、聚類分析以及相似度分析等方面探究不同干燥方式對艾草主要成分含量的影響和變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜的生成

將HPLC檢測得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012A版)》進(jìn)行分析，選中間樣品HAD1的指紋圖譜為參照圖譜，采用多樣本平均數(shù)矢量綜合作為共有模式矢量，時(shí)間寬度設(shè)定為0.50，對色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正和全峰匹配，得到指紋圖譜。每種干燥方式的艾草平行實(shí)驗(yàn)4次一共12個(gè)指紋圖譜，從下向上依次是熱風(fēng)、曬干和陰干干燥的艾草，共計(jì)27個(gè)色譜峰。3種方式干燥艾草的HPLC指紋譜圖分別有27、25、27個(gè)峰。計(jì)算得到各色譜峰相對峰面積，如表1所示。

表1 高效液相色譜(HPLC)特征峰的相對峰面積

經(jīng)與對照品溶液色譜圖比對后，指認(rèn)了樣品圖譜中6、15、16、17、22號峰色譜峰分別為綠原酸、異綠原酸A、木犀草苷、蘆丁和表兒茶素，對照品色譜圖(見圖1)。

圖1 不同方式干燥艾草HPLC指紋圖譜

2.2 主成分分析

HPLC指紋圖譜27個(gè)峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 13.0軟件，然后對其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，將處理后的峰面積進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖2，相關(guān)矩陣的特征值及其方差見表2。提取得到5個(gè)主成分，其累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到95.4%。其中前4個(gè)主成分的特征值大于1，他們的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為91.5%。故前4個(gè)主成分能代表3種干燥方式下艾草樣品中化合物組分含量91.5%的信息。

表2 主成分的特征值和貢獻(xiàn)率

圖2 主成分分析得分圖和載荷圖

PCA分析的得分圖如圖2(A)所示，可直觀看到3種不同干燥方式艾草樣品分布在不同區(qū)域，曬干艾草和陰干艾草樣品分別聚為兩簇，熱風(fēng)干燥4號樣品距離其余3個(gè)熱風(fēng)干燥艾草距離稍遠(yuǎn)。主成分載荷圖如圖2(B)所示。艾草化學(xué)成分眾多，多成分相互作用才是影響不同干燥方式間差異的重要原因。主成分的載荷圖中指標(biāo)與原點(diǎn)距離的遠(yuǎn)近可以直觀地反映出各指標(biāo)與各成分之間的關(guān)聯(lián)度。從第一主成分看色譜峰4、6、13、14、16、17正向距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)，第一主成分有較好的正相關(guān)性；色譜峰12和19負(fù)向距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)，第一主成分有較好的負(fù)相關(guān)性。從第二主成分方向看，色譜峰3、5、10、15、24和26正向距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)，表明他們與第二主成分有好的正相關(guān)性；色譜峰7、9、11和12負(fù)向距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)，表明他們與第二主成分有好的負(fù)相關(guān)性。

2.3 聚類分析

以3種不同干燥方式樣品的各峰的相對峰面積作為原始數(shù)據(jù)，獲得一個(gè)矩陣，每列代表不同的樣本，每行代表各峰的相對含量。為了保證結(jié)果的可靠性，利于綜合測評分析，對原始指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行Z值標(biāo)準(zhǔn)化處理，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后用歐式距離法和Ward連接法運(yùn)用NCSS進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析[21]，結(jié)果見圖3:將3種不同干燥方式的艾草樣品直觀分類，并按照不同重復(fù)試驗(yàn)聚為一簇(熱風(fēng)干燥和陰干干燥樣品聚為一類，曬干樣品自成一類)。綜上所述,曬干干燥的艾草樣品與熱風(fēng)、陰干兩種方式干燥的艾草樣品組成分差異較大，熱風(fēng)干燥和陰干干燥的艾草組成分較為接近。

圖3 不同方式干燥艾草的聚類分析圖

2.4 綠原酸、異綠原酸A、木犀草苷、蘆丁、表兒茶素和總黃酮含量的測定

以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程。結(jié)果分別為綠原酸y=10.39x-62.41，R2=0.999 3，線性范圍5.10～102.00 μg/mL；異綠原酸Ay=23.71x-154.96，R2=0.999 4，線性范圍6.12～61.20 μg/mL；木犀草苷y=47.35x-3.96，R2=0.999 7，線性范圍5.20～52.00 μg/mL；蘆丁y=29.41x-4.14，R2=0.999 7，線性范圍8.30～415.00 μg/mL；表兒茶素y=12.89x-0.86，R2=0.999 8，線性范圍7.88～78.80 μg/mL。計(jì)算出不同方式干燥艾草的綠原酸、異綠原酸A、木犀草苷、蘆丁和表兒茶素的含量如表3所示。由表3可知，熱風(fēng)干燥的艾草中綠原酸、異綠原酸A、木犀草苷和蘆丁的含量均高于其他2種方式干燥艾草中的含量。曬干艾草中表兒茶素含量顯著高于熱風(fēng)和陰干干燥艾草中的含量，但是曬干艾草中未檢測出蘆丁。

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)對照，按上述方法，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=8.287 6x+0.003 9(R2=0.993 8)，結(jié)果表明蘆丁在0～0.05 mg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的含量，結(jié)果見表3。由表3可知，不同干燥方式之間艾草總黃酮含量存在顯著性差異(p<0.05)。在總黃酮含量對比中，從大到小依次為熱風(fēng)、陰干和曬干干燥艾草，熱風(fēng)干燥的艾草總黃酮含量最高為21.44 mg/g，曬干艾草中總黃酮含量最低為13.02 mg/g，陰干干燥總黃酮含量為14.95 mg/g?？傸S酮含量因曬干而明顯降低曾有報(bào)道[13-14]。陰干樣品的總黃酮含量高于曬干樣品，與蒲銳等[15]的試驗(yàn)結(jié)果一致。

表3 不同干燥方式艾草中綠原酸、異綠原酸A、木犀草苷、蘆丁、表兒茶素和總黃酮含量 mg/g

2.5 不同干燥方法對艾草抗氧化活性的影響

由表4可知,熱風(fēng)、曬干和陰干干燥艾草提取物的DPPH自由基清除率都大于85%，分別達(dá)到87.77%、86.02%和87.23%，且差異不顯著。總還原能力從大到小依次為曬干組、熱風(fēng)組、陰干組，其吸光度分別為0.86、0.74、0.63。曬干干燥與熱風(fēng)干燥之間的總還原力無顯著性差異(p>0.05)，與陰干干燥存在顯著性差異(p<0.05)。熱風(fēng)干燥的艾草羥基自由基清除率最高，達(dá)到77.38%；其次為曬干艾草的羥基自由基清除率為74.41%，與熱風(fēng)干燥艾草之間差異不顯著(p>0.05)；陰干干燥處理下羥基自由基清除率最低為64.88%。

表4 不同干燥方式對艾草抗氧化能力的影響

3 結(jié)論與討論

本文考察了提取方式和提取時(shí)間對提取效果的影響，比較了超聲波30、45、60 min和微波提取10、20、30 s時(shí)的提取效果。對流動相的選擇和檢測波長也進(jìn)行考察，檢測了320 nm和360 nm的艾草樣品出峰狀況，同時(shí)考察了乙腈-水、乙腈-0.5%磷酸溶液和甲醇-0.5%磷酸溶液3種流動相體系。通過比較色譜峰峰形、峰面積、出峰數(shù)及各峰的分離度，最終確定檢測波長為320 nm，甲醇-0.5%磷酸溶液為流動相，以75%甲醇超聲30 min作為供試品溶液的提取方法。實(shí)驗(yàn)中對流動相的比例及梯度洗脫進(jìn)行了探索，最終得到了本實(shí)驗(yàn)的流動相條件。

指紋圖譜結(jié)合聚類分析法將3種干燥方式艾草主要分為兩大類，熱風(fēng)干燥和陰干干燥艾草具有更高的相似性。利用主成分分析將不同干燥方式艾草圖譜中的27個(gè)特征變量降維至5個(gè)主成分，并得出主成分分析得分圖和載荷圖，與聚類分析結(jié)果基本一致。

3種干燥方式相比，熱風(fēng)干燥的艾草總黃酮含量最高，陰干艾草次之、曬干艾草最低。所測定的3種抗氧化性指標(biāo)中，熱風(fēng)干燥艾草的DPPH自由基和羥基自由基清除能力最強(qiáng)，曬干干燥的艾草總還原力最強(qiáng)，陰干干燥艾草最低。綜上所述，熱風(fēng)干燥的艾草可較好地保持有效成分和抗氧化活性，且干燥效率較高、技術(shù)成熟，可在新鮮艾草中廣泛推廣。