高愛武，鳳 英，李蘊(yùn)華，王志銘，岳林芳，成立新，于朝暉，寶 華

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

動(dòng)物微生態(tài)制劑又稱為微生物活菌劑，是指利用動(dòng)物腸道中分離得到的正常有益微生物，經(jīng)過干燥、包埋或冷凍干燥等特殊工藝制成的活菌劑［1］。微生態(tài)制劑具有改善動(dòng)物機(jī)體腸道菌群環(huán)境、產(chǎn)生酶類和促生長(zhǎng)因子、提高機(jī)體免疫力和促進(jìn)消化吸收等功能，因其安全、可直接飼喂受到眾多養(yǎng)殖企業(yè)和科研人員的關(guān)注［2-4］。國(guó)內(nèi)外動(dòng)物養(yǎng)殖中普遍使用的飼用微生態(tài)制劑主要包括乳酸菌類、酵母菌類、芽孢桿菌類和曲霉類，常見的制備方式有單一菌制劑或復(fù)合菌制劑等。

目前，國(guó)內(nèi)飼用微生態(tài)菌劑絕大部分是干粉制劑，便于運(yùn)輸和保存，也可有效保存活菌數(shù)。飼用微生態(tài)干粉制劑使用時(shí)可直接撒在飼料表面或混合于飼料中。由于微生態(tài)菌劑干粉的粒徑較小，在使用過程中極易出現(xiàn)如下問題：微生態(tài)制劑干粉直接撒在飼草料上，出現(xiàn)混合不均勻、粉塵漂移、通過粗飼料縫隙漏到食槽底部等現(xiàn)象，造成動(dòng)物單體飼喂量不精確，動(dòng)物實(shí)際采食微生態(tài)制劑少，導(dǎo)致微生態(tài)制劑的浪費(fèi)和損耗；部分使用者將微生態(tài)干粉制劑溶于水中使用，容易出現(xiàn)微生態(tài)菌劑沉淀或不易溶解等現(xiàn)象，因此，造成微生物在水中分散不均勻，嚴(yán)重影響微生態(tài)制劑的利用準(zhǔn)確度和效果。

生產(chǎn)實(shí)踐中常將微生態(tài)菌劑或其他功能物質(zhì)添加到合適的懸浮劑中，讓其均勻分散，形成穩(wěn)定的懸浮體系。懸浮劑是一種液體混合體系，能夠防止懸浮體系中的不溶物如微生態(tài)菌劑、固體粒子等發(fā)生沉降或聚集，從而提高懸浮體系的穩(wěn)定性［5］。這類制備方法在微生物農(nóng)藥菌劑生產(chǎn)［6］、化妝品乳液生產(chǎn)［7］以及食品功能性懸浮液［8］的生產(chǎn)方面得到了較廣泛的應(yīng)用。而飼用微生態(tài)菌劑懸浮劑的研制及應(yīng)用鮮有報(bào)道，研發(fā)一種適用于飼用微生態(tài)菌劑的懸浮劑有助于解決養(yǎng)殖生產(chǎn)中出現(xiàn)的上述問題，也可開發(fā)更多飼用微生態(tài)菌劑新產(chǎn)品。該研究以符合飼料添加劑安全標(biāo)準(zhǔn)的黃原膠和羧甲基纖維素鈉為主要穩(wěn)定劑成分，研制飼用微生態(tài)菌劑懸浮劑，并對(duì)其穩(wěn)定性加以評(píng)價(jià)，以期為飼用微生態(tài)制劑的推廣利用提供更為有效和便捷的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

飼用微生態(tài)菌劑干粉購(gòu)自北京好實(shí)沃生物技術(shù)有限公司，黃原膠、羧甲基纖維素鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，甘氨酸、吐溫80購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，瓊脂粉、蛋白胨、牛肉膏購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)，型號(hào)：30R，貝克曼公司產(chǎn)品；臺(tái)式離心機(jī)，型號(hào)：TGL-20B型，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；紫外—可見分光光度計(jì)，型號(hào)：U-2910，日本日立公司產(chǎn)品；高速分散器，型號(hào)：XHF-DY，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；數(shù)字式黏度計(jì)，型號(hào)：NDJ-5S，上海菁海儀器有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，型號(hào)：Heraguard ECO，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；高壓滅菌鍋，型號(hào)：SX-500，TOMY KOGYD產(chǎn)品；電子天平，型號(hào)：SQP，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1混懸用粉劑的制備準(zhǔn)確稱取微生態(tài)菌劑干粉20 g、甘氨酸15 g、吐溫80 2 g，之后置于大燒杯中，加入1 000 mL蒸餾水，制得混合菌液。準(zhǔn)確稱取一定量的黃原膠和羧甲基纖維素鈉，以4∶1（W∶W）的比例充分混合均勻，之后將混合好的穩(wěn)定劑分別按0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的比例（W∶V）加入制備好的混合菌液，用高速分散器混合均勻，得到添加不同比例穩(wěn)定劑的飼用微生態(tài)菌劑懸浮劑。以不添加穩(wěn)定劑的混合菌液作為空白對(duì)照。

1.3.2飼用微生態(tài)菌劑懸浮劑的穩(wěn)定性測(cè)定以上述制備的添加不同比例穩(wěn)定劑的飼用微生態(tài)菌劑懸浮劑為對(duì)象，進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，主要包括懸浮劑穩(wěn)定系數(shù)、黏度、存放穩(wěn)定性和活菌總數(shù)。

1.3.2.1懸浮劑穩(wěn)定系數(shù)測(cè)定參照郎秀杰等［9］報(bào)道的方法，做適當(dāng)改進(jìn)。將制備好的懸浮劑，用高速分散勻漿器以10 000 r/min混勻30 s，間隔20 s，重復(fù)操作3次。分別取30 mL勻漿后的懸浮劑，每個(gè)樣品稀釋10倍，3 500 r/min離心20 min。離心后取上清液，在600 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定懸浮劑稀釋樣液的吸光度A1，測(cè)定上清液的吸光度A2，懸浮劑的穩(wěn)定系數(shù)為R，按下列公式計(jì)算其穩(wěn)定系數(shù)，測(cè)定3次，取平均值。

1.3.2.2懸浮劑黏度測(cè)定參照郭宏雨等［10］報(bào)道的方法，稍加改動(dòng)。將制備好的懸浮劑，用高剪切分散勻漿器以10 000 r/min混勻30 s，間隔20 s，重復(fù)操作3次。用數(shù)字式黏度計(jì)于常溫下測(cè)定懸浮液的黏度，測(cè)定3次，取平均值。

1.3.2.3懸浮劑存放穩(wěn)定性測(cè)定參照楊旭［11］和陳祖滿［12］報(bào)道的方法，適當(dāng)加以改進(jìn)。懸浮劑的存放穩(wěn)定性通常用其存放期間的分層程度表示。將制備好的懸浮劑，用高速分散器以10 000 r/min混勻30 s，間隔20 s，重復(fù)操作3次。之后取50 mL勻漿后的混懸液，加入50 mL的具塞量筒，密封試管塞，記下懸浮劑的初始高度，標(biāo)記為H1，于常溫下靜置8 h后，再記下試管中上部清液層的高度H2，用公式（2）計(jì)算懸浮劑存放穩(wěn)定性。每個(gè)處理3個(gè)平行樣品，測(cè)定后計(jì)算平均值。

式（2）中：H0表示分層程度，單位：%；H1表示懸浮劑液面總高度，單位：cm；H2表示懸浮劑上層清液層的高度，單位：cm。H0可反映體系的穩(wěn)定性，數(shù)值越小，說明在試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，分層現(xiàn)象越不明顯，體系越穩(wěn)定。

1.3.2.4懸浮劑活菌總數(shù)測(cè)定將制備好的懸浮劑，用高速分散器以10 000 r/min混勻30 s，間隔20 s，重復(fù)操作3次。取勻漿后的懸浮劑進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，方法參照《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定》（GB/T 13093—2006）［13］。每個(gè)處理3個(gè)平行樣品，測(cè)定后計(jì)算平均值。

1.3.2.5冷貯存穩(wěn)定性測(cè)定參照謝蘭芬等［14］報(bào)道的方法，并加以改進(jìn)。將制備好的懸浮劑于4℃下靜置存放24 h，然后用高速分散器以10 000 r/min混勻30 s，間隔20 s，重復(fù)操作3次。取勻漿后的懸浮劑，測(cè)定黏度和活菌計(jì)數(shù)，測(cè)定活菌總數(shù)。每個(gè)處理3個(gè)平行樣品，測(cè)定后計(jì)算平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS22.0軟件，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），應(yīng)用多重比較Tukey和LSD檢測(cè)各試驗(yàn)組數(shù)據(jù)之間的差異性。圖中和表中數(shù)據(jù)標(biāo)注相同小寫字母，表示差異不顯著（P＞0.05）；標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生態(tài)菌劑懸浮劑穩(wěn)定系數(shù)的比較

微生態(tài)菌劑懸浮劑穩(wěn)定系數(shù)的變化結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著穩(wěn)定劑黃原膠和羧甲基纖維素鈉添加比例的增加，懸浮劑的穩(wěn)定系數(shù)逐漸增加。與不添加穩(wěn)定劑的空白對(duì)照組相比，添加0.05%和0.10%的穩(wěn)定劑后，體系的穩(wěn)定系數(shù)顯著（P＜0.05）升高，分別達(dá)到75.44%和77.30%，但兩者沒有顯著（P＞0.05）差異。當(dāng)穩(wěn)定劑添加量增大到0.20%時(shí)，體系的穩(wěn)定系數(shù)進(jìn)一步增大，達(dá)到了91.38%，且與0.25%添加量組（91.78%）無(wú)顯著（P＞0.05）差異。

圖1 穩(wěn)定劑添加量對(duì)懸浮劑穩(wěn)定系數(shù)的影響

2.2 微生態(tài)菌劑懸浮劑黏度的比較

圖2為飼用微生態(tài)菌劑懸浮劑的黏度隨穩(wěn)定劑添加比例變化的結(jié)果。由圖2可以看出，懸浮體系的黏度隨著穩(wěn)定劑添加量的增加呈現(xiàn)增大趨勢(shì)。當(dāng)體系不添加穩(wěn)定劑時(shí)，黏度值為223.07 mPa·s，穩(wěn)定劑的添加量達(dá)到0.20%和0.25%時(shí)，體系的黏度顯著增加（P＜0.05），分別達(dá)到744.43 mPa·s和853.57 mPa·s。

圖2 穩(wěn)定劑添加量對(duì)懸浮劑黏度的影響

2.3 微生態(tài)菌劑懸浮劑存放穩(wěn)定性的比較

表1為穩(wěn)定劑添加量對(duì)飼用微生態(tài)菌劑懸浮劑存放穩(wěn)定性的影響結(jié)果。

表1 穩(wěn)定劑添加量對(duì)懸浮劑存放穩(wěn)定性的影響 單位：%

由表1可知，隨著穩(wěn)定劑添加量的增加，飼用微生態(tài)菌劑的分層現(xiàn)象得到極大緩解。當(dāng)不添加穩(wěn)定劑時(shí)，經(jīng)過8 h的靜置存放，菌劑溶液的分層程度達(dá)到97.11%，顯著（P＜0.05）高于添加穩(wěn)定劑的各個(gè)處理組；而添加0.05%的穩(wěn)定劑后，分層程度明顯（P＜0.05）小于對(duì)照組，下降為34.81%，當(dāng)穩(wěn)定劑的添加比例增大到0.20%時(shí)，在8 h的靜置期間，已測(cè)量不到體系的分層現(xiàn)象，可以認(rèn)為，0.20%的穩(wěn)定劑添加量可以完全實(shí)現(xiàn)飼用微生態(tài)菌劑懸浮劑的穩(wěn)定存放，確保不出現(xiàn)分層，保證體系的穩(wěn)定性。該研究選擇靜置存放時(shí)間8 h作為評(píng)定懸浮體系存放穩(wěn)定性的時(shí)間間隔，這是因?yàn)樵谑褂眠^程中推薦的使用方法為現(xiàn)用現(xiàn)配，這樣既有利于維持微生態(tài)菌劑中的活菌數(shù)，又可以減少存放需要的冷藏條件，達(dá)到使用便利的效果。

2.4 微生態(tài)菌劑懸浮劑活菌總數(shù)的比較

穩(wěn)定劑添加量對(duì)飼用微生態(tài)菌劑懸浮劑活菌總數(shù)的影響結(jié)果見表2。

由表2可知，在所有測(cè)定條件下，體系中的活菌數(shù)均維持在109CFU/mL以上，說明該研究制備的飼用微生態(tài)菌劑懸浮劑可以保證較高的活菌數(shù)。在不經(jīng)過冷藏時(shí)，微生態(tài)菌劑水溶液中加入穩(wěn)定劑后，體系中的活菌總數(shù)整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)穩(wěn)定劑添加量達(dá)到0.10%時(shí)，體系中的細(xì)菌總數(shù)出現(xiàn)顯著（P＜0.05）下降，之后細(xì)菌總數(shù)的變化變得相對(duì)穩(wěn)定，隨著穩(wěn)定劑添加量繼續(xù)增加，各組細(xì)菌總數(shù)沒有表現(xiàn)出顯著差異。

表2 穩(wěn)定劑添加量對(duì)懸浮劑活菌總數(shù)的影響 單位：109 CFU/mL

2.5 微生態(tài)菌劑懸浮劑冷貯存后穩(wěn)定性的變化

飼用微生態(tài)菌劑懸浮劑經(jīng)過冷貯存的穩(wěn)定性變化通過懸浮劑的黏度和活菌總數(shù)表示，黏度的變化結(jié)果見圖3，活菌總數(shù)的結(jié)果見表3。

圖3 穩(wěn)定劑添加量對(duì)冷貯存懸浮劑黏度的影響

24 h的冷貯存后懸浮劑的黏度變化呈現(xiàn)與常溫條件下相似的變化規(guī)律，隨著穩(wěn)定劑添加量的增加，體系的黏度呈現(xiàn)逐漸增大趨勢(shì)，體系的黏度由300.73 mPa·s（穩(wěn)定劑添加量為0）增加到1 206.90 mPa·s（穩(wěn)定劑添加量為0.25%），穩(wěn)定劑添加比例每增加0.05%，體系的黏度均出現(xiàn)顯著增加（P＜0.05）。

由表3可知，將制得的微生態(tài)菌劑懸浮劑置于4℃條件下，經(jīng)過24 h的低溫保存，在所有穩(wěn)定劑濃度情況下，懸浮體系中的活菌總數(shù)出現(xiàn)不同程度的下降，說明長(zhǎng)時(shí)間低溫保存對(duì)微生態(tài)菌劑中的細(xì)菌活性造成一定不利影響。與空白對(duì)照組相比，穩(wěn)定劑的添加量達(dá)到0.10%時(shí)，冷貯存后懸浮體系的活菌數(shù)出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05），這一變化趨勢(shì)與不經(jīng)冷貯存的懸浮劑的變化一致，說明穩(wěn)定劑的加入抑制了體系中微生物的活性。

表3 穩(wěn)定劑添加量對(duì)懸浮劑冷貯存后活菌總數(shù)的影響 單位：109 CFU/mL

3 討論

對(duì)于一個(gè)分散體系來(lái)說，黏度是衡量其在一定的剪切作用下體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。添加黃原膠的飼用微生態(tài)菌劑懸浮液是一種典型的假塑性流體，當(dāng)攪拌產(chǎn)生的剪切速率增加時(shí)，體系的黏度會(huì)出現(xiàn)下降，即懸浮液發(fā)生剪切變稀行為［15］。因此，在較低的剪切速率下，包含黃原膠的懸浮液具有相對(duì)較高的黏度；逐步增加攪拌速率，即提高剪切速率能造成體系黏度下降；當(dāng)剪切作用停止后，黃原膠懸浮液的黏度會(huì)迅速恢復(fù)正常［16-18］。因此，制備飼用微生態(tài)菌劑懸浮劑時(shí)，添加黃原膠作為穩(wěn)定劑，為了實(shí)現(xiàn)菌劑在體系中的均勻分布，需要考慮勻漿時(shí)轉(zhuǎn)速對(duì)體系穩(wěn)定性的影響。

黏度表示的是液體流動(dòng)過程中內(nèi)部分子間產(chǎn)生的內(nèi)摩擦力，能夠反映懸浮劑體系內(nèi)大分子之間、大分子與溶劑分子的相互作用力，這種作用力受溫度影響［19］。當(dāng)溫度升高時(shí)，溶液中的溶質(zhì)分子獲得更高的內(nèi)能，熱運(yùn)動(dòng)加劇，分子間的相互作用力減小，內(nèi)摩擦力降低，溶液黏度下降［20］。該試驗(yàn)結(jié)果表明，冷貯存后體系的黏度與相同穩(wěn)定劑添加比例的常溫組別相比，均出現(xiàn)一定程度的增加，反映了溫度對(duì)微生態(tài)菌劑懸浮劑黏度的影響。這是因?yàn)殡S著溫度的降低，懸浮劑體系內(nèi)的各種大分子鏈的活動(dòng)能力減弱，溶液的流動(dòng)性變差，從而導(dǎo)致微生態(tài)菌劑懸浮劑溶液的黏度增大。

對(duì)于飼用微生態(tài)菌劑懸浮劑的使用，理想的情況是體系的黏度控制在一定的范圍內(nèi)，既不能太小，也不能太大。黏度太小不利于微生態(tài)菌劑在體系中穩(wěn)定懸浮，容易造成菌體沉降，體系出現(xiàn)分層。而過高的黏度不利于微生態(tài)菌劑的順利噴灑。該研究的目的是制備能夠進(jìn)行方便快捷噴灑的飼用微生態(tài)菌劑懸浮劑，使飼用微生態(tài)菌劑均勻懸浮于溶液中。在使用時(shí)通過壓力噴壺或其他噴灑裝置，可將微生態(tài)菌劑均勻噴灑出去，并黏附于飼料顆粒。過高的黏度將增加微生態(tài)菌劑噴灑時(shí)的阻力，并容易造成噴頭堵塞等問題，因此，在進(jìn)行飼用微生態(tài)菌劑懸浮劑制備時(shí)，需控制在適當(dāng)?shù)酿ざ确秶鷥?nèi)。

4 結(jié)論

隨著穩(wěn)定劑添加量增大，制成的懸浮劑穩(wěn)定系數(shù)、黏度都呈遞增的趨勢(shì)，當(dāng)穩(wěn)定劑添加量≥0.15%，懸浮劑體系逐漸趨于穩(wěn)定，當(dāng)穩(wěn)定劑添加量達(dá)到0.20%時(shí)，無(wú)分層現(xiàn)象出現(xiàn)。無(wú)論在常溫還是冷貯存24 h后，制成的懸浮劑中活菌的存活率均保持在109CFU/mL以上，能夠保證飼用微生態(tài)菌劑的有效活菌數(shù)。