張必周，洪 博，張 濤，趙婉彤，于曉芳，高聚林，張 鑫，青格爾

（1.內蒙古農業(yè)大學農學院/內蒙古自治區(qū)作物栽培與遺傳改良重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010019；2.內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院，內蒙古 呼和浩特 010031）

北方春玉米種植區(qū)是我國的玉米主產(chǎn)區(qū)，約占全國玉米播種面積的50%[1]。隨著玉米種植面積的不斷擴大，產(chǎn)生大量廢棄的玉米秸稈，因秸稈利用方式單一、有效利用率較低而造成的資源浪費和環(huán)境污染也日益嚴重[2]。研究發(fā)現(xiàn)，秸稈還田具有降低土壤容重、改良土壤團粒結構、增加土壤孔隙度[3]、提升土壤有機質、增加農作物產(chǎn)量[4]等多重功效，因此成為目前主要的秸稈利用方式。我國北方地區(qū)冬季低溫、干旱，限制了當季還田秸稈的有效腐解，且由于秸稈木質纖維素的組成，自然狀態(tài)下難以被微生物分解[5]，導致秸稈不僅無法作為當季作物的肥源，還會影響播種質量，不利于下茬作物的生長[6]。秸稈微生物促腐還田可加速秸稈分解和腐熟，具有高效、便捷、生物安全等特點[7]，可實現(xiàn)秸稈的高效綠色降解和農業(yè)可持續(xù)發(fā)展。前人通過篩選或復配單菌獲得秸稈降解微生物，如崔宗均等[8]從4 種堆肥樣品中篩選優(yōu)化獲得纖維素分解能力強而穩(wěn)定的纖維素分解菌復合系；李靜等[9]從川西高原貢嘎山區(qū)杜鵑林下土壤中分離纖維素降解菌，并組配獲得由類芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.）、芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）以及鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）組成的復合菌C 和D，表現(xiàn)出較高的纖維素降解能力。大量研究表明，單一菌株存在酶穩(wěn)定性差、環(huán)境適應能力弱及降解效果差等問題[10]，而復合菌具有微生物協(xié)同作用，產(chǎn)酶多樣，有利于提高秸稈類物質的轉化率[11-12]，對秸稈的降解效果及穩(wěn)定性顯著優(yōu)于單一菌株[13-14]，但復合菌系組成復雜多樣且無法滿足發(fā)酵工藝要求，致使菌劑的制備及開發(fā)較為困難。

本試驗在玉米秸稈低溫高效降解復合菌系GF-20經(jīng)分離純化并組合獲得復配菌A3+A4（Achromobacter deleyi strain LMG 3458+Pseudomonas plecoglossicida strain NBRC）的基礎上添加功能真菌，組配了菌種組成簡單的玉米秸稈低溫降解復配菌，并對其復配效應和降解效果進行研究，以期為今后玉米秸稈原位促腐還田提供微生物資源，為制備復合菌劑奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

玉米秸稈低溫高效降解復合菌系GF-20 是內蒙古農業(yè)大學玉米科技創(chuàng)新團隊篩選獲得的菌系[15]，采用稀釋梯度法分離純化獲得細菌A3（Achromobacter deleyistrainLMG3458）、A4（Pseudomonasplecoglossicida strain NBRC），并復配獲得復配菌A3+A4[16]；供試功能真菌為A（Aspergillus terreus）和P（Phanerochaete chrysosporium），由中國農業(yè)微生物菌種保藏中心提供；玉米秸稈取自內蒙古農業(yè)大學玉米中心試驗田收獲的秸稈，纖維素、半纖維素和木質素含量分別為0.576、0.324 和0.164 g/g，洗凈烘干后剪成2～3 cm 碎條。

1.2 試驗設計

活化的菌株A3、A4、A、P 分別以同等比例組配構建A3+A4、A3+A4+A、A3+A4+P、A3+A4+A+P 復配菌，接種于玉米秸稈培養(yǎng)基中，置于低溫15 ℃、黑暗條件下的恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)3、7、12、15、20、30 d 取樣測定玉米秸稈降解率，濾紙酶、木聚糖酶、漆酶活性，纖維素、半纖維素、木質素降解率和單菌微生物相對含量。

1.3 培養(yǎng)基

基礎培養(yǎng)基：（NH4）2SO42 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、CaCO32 g/L、NaCl 0.2 g/L，蒸餾水1 L；玉米秸稈培養(yǎng)基：40 mL 基礎培養(yǎng)基，2 g玉米秸稈。以上培養(yǎng)基使用前于121 ℃、0.1 MPa 條件下進行30 min 滅菌處理。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 玉米秸稈及纖維素、半纖維素、木質素降解率的測定 各復配菌以10%（V/V）的接種量接種至玉米秸稈培養(yǎng)基中，培養(yǎng)第30 天收集培養(yǎng)基中的玉米秸稈，用蒸餾水沖洗干凈，放入80 ℃烘箱烘至恒重，稱量記錄，采用失重法計算玉米秸稈降解率，之后粉碎過150 μm 篩，采用纖維素分析儀（ANKOM A200i）測定纖維素、半纖維素、木質素含量，并計算纖維素、半纖維素和木質素降解率，3 次重復。

1.4.2 酶活性的測定 于接種后3、7、12、15、20、30 d取培養(yǎng)液，參照國際理論與應用化學聯(lián)合會（IUPAC）推薦的分光光度法[17]測定濾紙酶活性，參照國家標準GB/T 23874—2009[18]中的方法測定木聚糖酶活性，采用ABTS 法[19]測定漆酶活性，3 次重復。

1.4.3 微生物相對含量的測定 于接種后30 d 在無菌條件下吸取培養(yǎng)液5 mL，采用微生物DNA 提取試劑盒（中國，天根生化科技有限公司）進行DNA提取。設計4 株單菌引物，對目的基因進行PCR 擴增。RT-qPCR 反應體系（20 μL）：ChamQ SYBR COLOR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，DNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。反應條件為：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃20 s，40 個循環(huán)；95 ℃30 s，60 ℃1 min；95 ℃30 s。每個樣品3 次重復，通過96 孔板進行檢測。細菌采用16S rRNA 基因作為參照，真菌采用ITS 基因作為參照，引物信息見表1。

表1 引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS v18.0 統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析（ANOVA），采用SigmaPlot v12.5 軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定與降解特性

首先采用梯度稀釋法從復合菌系GF-20 中分離純化獲得2 株功能單菌A3 和A4，經(jīng)濾紙培養(yǎng)基篩選，菌株A3 和A4 可使濾紙條斷裂，且分泌木質纖維素降解酶，經(jīng)分子生物學鑒定A3 為Achromobacter deleyi strain LMG 3458，A4 為Pseudomonas plecoglossicida strain NBRC（圖1），并復配獲得復配菌A3+A4。然后對復配菌A3+A4 及菌株A3、A4、A、P 的玉米秸稈降解率及相關酶活性進行分析，結果表明（表2），A3 和A4 相互組合后，玉米秸稈降解率顯著高于單菌株（P＜0.05），較A3、A4分別增加11.96、12.87 個百分點；濾紙酶活性分別較A3、A4 顯著增加10.58、10.76 U/mL（P＜0.05），木聚糖酶活性分別較A3、A4 顯著增加0.62、0.64 U/mL（P＜0.05），漆酶活性分別較A3、A4 顯著增加10.42、10.85 U/L（P＜0.05）。

圖1 菌株A3、A4 系統(tǒng)進化樹

表2 不同處理玉米秸稈降解率及相關酶活性

2.2 不同復配菌組合酶活性動態(tài)變化

由圖2 可知，隨著培養(yǎng)天數(shù)的推進，所有處理的濾紙酶活性均提高，而所有處理木聚糖酶和漆酶活性均呈先增加后降低的趨勢。不同復配菌的濾紙酶、木聚糖酶和漆酶活性分別在培養(yǎng)第30 天、第15 天和第20 天達到最高值，其中A3+A4+A+P 組合顯著高于其他組合（P＜0.05），酶活性分別為15.49 U/mL、7.39 U/mL、81.67 U/L，且分別較A3+A4 提高了4.44 U/mL、4.00 U/mL、60.04 U/L。不同組合復配菌總體表現(xiàn)為A3+A4+A+P>A3+A4+A/A3+A4+P>A3+A4，表明在組合A3+A4 的基礎上添加功能真菌A 和P 可顯著提高酶活性，具有良好的正向效應。

圖2 不同復配菌組合酶活性動態(tài)變化

2.3 不同復配菌組合對纖維素、半纖維素及木質素降解率動態(tài)變化的影響

隨著培養(yǎng)天數(shù)的推進，各復配菌組合低溫15 ℃條件下纖維素、半纖維素及木質素降解率呈上升趨勢（表3），培養(yǎng)30 d 時纖維素降解率表現(xiàn)為A3+A4+A和A3+A4+A+P 顯著高于其他處理（P＜0.05），降解率分別為36.70%和36.51%；其次為A3+A4+P，降解率為30.28%。半纖維素和木質素降解率均表現(xiàn)為A3+A4+A+P 顯著高于其他處理（P＜0.05），降解率分別為33.62%和31.24%；其次為A3+A4+A 和A3+A4+P。復配菌A3+A4、A3+A4+A、A3+A4+P、A3+A4+A+P 的纖維素、半纖維素和木質素降解率最大值均出現(xiàn)在第30 天，不同組合復配菌總體表現(xiàn)為A3+A4+A+P>A3+A4+A/A3+A4+P>A3+A4，且A3+A4+A+P 的纖維素、半纖維素、木質素降解率分別較A3+A4 提高了10.77、4.15 和21.10 個百分點。由降解率可知，在A3+A4 的基礎上添加功能真菌A可顯著提高30 d 時的纖維素降解率和半纖維素降解率（P＜0.05），添加功能真菌P 可顯著提高30 d 時木質素降解率（P＜0.05）。

表3 不同復配菌組合纖維素、半纖維素、木質素降解率

2.4 不同復配菌組合對玉米秸稈降解率的影響

由圖3 可知，A3+A4+A+P 的玉米秸稈降解率為38.79%，顯著高于其他組合（P＜0.05），較A3+A4 提高了13.04 個百分點。A3+A4+A 和A3+A4+P 的玉米秸稈降解率分別為29.24%和29.16%，較A3+A4分別提高了3.49 和3.41 個百分點。由此可知，添加功能真菌A 或P 的提升效果低于同時添加A 和P。

圖3 不同復配菌組合玉米秸稈降解率

2.5 不同復配菌組合對單菌微生物相對含量的影響

由表4 可知，在15 ℃條件下單菌微生物相對含量隨著復配菌豐度的增加而增加。A3+A4+A+P 中，4 株單菌的微生物相對含量均顯著高于其他組合（P＜0.05），分別為1.53%、1.47%、1.42%和2.04%，說明添加功能真菌A 和P 可有效促進復合菌中單菌株的微生物相對含量，從而提升玉米秸稈降解效率。

表4 復配菌中A3、A4、A、P 微生物相對含量 單位：%

3 討論與結論

復合菌系GF-20 具有秸稈低溫高效降解能力，尤其在纖維素和半纖維素降解方面具有良好的潛力[16]，但因其組成復雜，不利于工業(yè)開發(fā)。經(jīng)梯度稀釋和分離純化獲得的菌株A3（Achromobacter deleyi strain LMG 3458）和A4（Pseudomonas plecoglossicida strain NBRC）表現(xiàn)出降解功能，復配構建復配菌A3+A4 后，其降解效率顯著低于原有菌系GF-20。為了提升降解效率，本試驗通過添加功能真菌A（Aspergillusterreus）和P（Phanerochaetechrysosporium）增加菌株組成豐度，并探究各復配菌處理的酶活性、玉米秸稈降解率及單菌微生物相對含量。

本試驗中菌株A3 能降解復雜化合物[20]，菌株A4 具有高效的胞外氧化系統(tǒng)[21-22]。功能真菌A 屬于降解纖維素真菌[23]，具有較高的CMC 酶活性[24]；P 具有細胞外氧化系統(tǒng)，可編碼木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和乙二醛氧化酶，能有效降解秸稈中的木質素[25-26]，但其分泌的纖維素酶和半纖維素酶種類不全[27]，對纖維素和半纖維素降解能力弱。對復雜有機化合物降解及生防菌利用的相關研究發(fā)現(xiàn)，將不同功能的單菌相互組配，可顯著提升相關功能的作用[28-29]。本試驗以具備不同降解活性的4 株單菌為基礎進行菌株復配，復配后微生物相對含量顯著增加，酶活性及玉米秸稈的降解率顯著提升。但并不是菌株組成數(shù)量越多越好，江高飛等[30]研究發(fā)現(xiàn)，不含菌株Aspergillus fumigatus F7-5 的組合F1 表現(xiàn)出更好的秸稈降解效果。本試驗表明，添加功能真菌A可顯著提升復配菌的纖維素降解率，同時發(fā)現(xiàn)隨著功能真菌P 的加入，復配菌漆酶活性顯著提升，且A3+A4+P 顯著高于A3+A4+A+P，說明功能真菌A對漆酶的提升無顯著貢獻；添加功能真菌A 可顯著提升木聚糖酶活性，A3+A4+P 的酶活性顯著低于A3+A4+A 和A3+A4+A+P。自然界中真菌與細菌存在共生關系，F(xiàn)ERNáNDEZ-LUQUE?O 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在對石油烴的降解過程中，細菌和真菌混合降解石油烴的效率是細菌純培養(yǎng)降解的3 倍。秸稈降解需細菌、真菌等多種微生物及其分泌的纖維素酶相互協(xié)同發(fā)揮作用，而單一菌株往往難以完成如此復雜的生化過程，真菌與細菌的秸稈降解機理不同，真菌菌絲對木質纖維素結構的破壞可幫助細菌的定殖，細菌對木質纖維素改性更利于真菌纖維素酶對木質纖維素的有效降解[32-33]。研究表明，不同微生物菌株的組合比單一菌株的降解效果好[34]。夏強[35]研究發(fā)現(xiàn)，以地衣芽孢桿菌、黑曲霉和綠色木霉組成的細菌-真菌復合菌系產(chǎn)纖維素酶的活力優(yōu)于單一菌株，顯著提高了復合菌系降解水稻、玉米和小麥秸稈的能力。梅新蘭等[36]以細菌雷氏普羅威登斯菌JB7、球形賴氨酸芽孢桿菌BB18 和真菌草酸青霉ZA、包圍漆斑菌ZL 構建的細菌-真菌復合菌系對水稻秸稈的降解率及纖維素酶、木聚糖酶和濾紙酶活性顯著提升。本試驗在A3+A4 細菌組合的基礎上，添加真菌A 和P，構建含有纖維素降解細菌及真菌，同時含有對木質素降解效果較好的微生物，較A3+A4 玉米秸稈降解率提高了13.04 個百分點，濾紙酶、木聚糖酶、漆酶活性分別提高了4.44 U/mL、4.00 U/mL、60.04 U/L，纖維素、半纖維素和木質素降解率分別提高了10.77、4.15 和21.10 個百分點。加入真菌A. terreus（A）和P. chrysosporium（P）后復配菌中A3和A4 的微生物相對含量較A3+A4 顯著增加，這可能與細菌可附著于真菌菌絲生長有關[37]，使其在培養(yǎng)初期免受有害物質的影響，利于細菌生物量的積累。本試驗以具備不同降解活性的4 株單菌株為基礎進行菌株組合，以濾紙酶、木聚糖酶、漆酶活性及玉米秸稈降解率為指標，確定玉米秸稈低溫降解最佳組合為A3+A4+A+P，該組合在低溫15 ℃條件下玉米秸稈降解率最高，為38.79%；纖維素、半纖維素和木質素的降解率在培養(yǎng)30 d 時達到最高值，分別為36.51%、33.62%和31.24%；濾紙酶、木聚糖酶、漆酶活性分別在培養(yǎng)30、15、20 d時達到最高值，其值為15.49 U/mL、7.39 U/mL、81.67 U/L，玉米秸稈降解率及濾紙酶、木聚糖酶、漆酶活性均顯著提升。