胡圓圓，楊云忠，王 萍，李紹仙，李 艷，車 濤

（普洱市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南普洱 665000）

普洱茶是以地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)的云南大葉種曬青茶為原料，并在地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)采用特定的加工工藝制成，具有獨(dú)特品質(zhì)特征的茶葉[1]。它品性溫和，獨(dú)具陳香、醇厚、甘滑的韻味。由于普洱茶具有“越陳越香”的特點(diǎn)，有人稱為“可以喝的古董”[2]。普洱茶湯中獨(dú)特的口味和色澤越來(lái)越受現(xiàn)代人的青睞，它當(dāng)中的主要成分是“茶褐素”。

茶褐素是指茶葉中以兒茶素為主的多酚類化合物氧化聚合而成的大分子水溶性色素，是一類易溶于水，但不溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇及三氯甲烷等有機(jī)溶劑的高聚合物質(zhì)[3]。其化學(xué)組成主要由含多苯環(huán)的褐色色素、多糖殘基、蛋白殘基、咖啡堿以及脂類物質(zhì)組成，主要的功能性基團(tuán)為羧基、羥基、氨基以及甲基等基團(tuán)，具有酚類物質(zhì)特性。其主要形成途徑認(rèn)為是有多酚氧化形成的茶紅素、茶黃素與蛋白質(zhì)、多糖、咖啡堿及脂類物質(zhì)在微生物分泌酶的酶促作用、微生物“呼吸熱”以及濕熱作用下通過氧化聚合、偶聯(lián)聚合等方式形成，一部分可溶入茶湯，一部分則殘留于葉底。茶褐素具有減肥、調(diào)節(jié)血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗氧化等作用，是普洱茶的主要活性物質(zhì)[4-6]。

因此能準(zhǔn)確測(cè)定普洱茶中茶褐素的含量對(duì)推動(dòng)普洱茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展起推動(dòng)作用，但傳統(tǒng)的檢測(cè)方法對(duì)測(cè)定結(jié)果的不穩(wěn)定性。本文參考楊妍等[7]方法進(jìn)行了一系列相關(guān)的驗(yàn)證試驗(yàn)，均得到準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

普洱茶葉與茶粉由云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司提供；無(wú)水乙醇（天津市化學(xué)試劑三廠）；蒸餾水：符合《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)（TU-1810SPC，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-215，瑞士）；高速冷凍離心機(jī)（GL-12B，上海安亭科學(xué)儀器廠）；萬(wàn)分之一分析天平(ME614S，Sartorius)；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；抽濾泵（臺(tái)州市黃巖匯豐真空設(shè)備）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 茶褐素標(biāo)準(zhǔn)品的制備

精確選取優(yōu)質(zhì)茶樣30個(gè)，在電子天平上稱重，每個(gè)茶樣稱取100 g。將稱好的茶樣進(jìn)行充分混勻，按料液比為1∶10的比例加入沸水，保溫浸提兩次，每次30 min，得茶湯，用濾布過慮茶湯，得到澄清的湯液，對(duì)過濾后的茶湯進(jìn)行真空減壓濃縮，然后對(duì)濃縮液進(jìn)行離心。向離心后的茶湯濃縮液中加入無(wú)水乙醇至乙醇含量為總量的80%，靜置6 h，離心得沉淀。得到該沉淀即為茶褐素標(biāo)準(zhǔn)品，在60 ℃條件下烘干，為制作標(biāo)準(zhǔn)曲線做準(zhǔn)備。取50 g以上得到的茶褐素沉淀（即標(biāo)準(zhǔn)品），加入1 000 mL蒸餾水充分?jǐn)嚢瑁蛊淙咳芙?。?duì)溶解進(jìn)行分級(jí)，使用＞50 000 Da的濾膜，分級(jí)后依次得到物質(zhì)，并進(jìn)行冷凍干燥得到干物質(zhì)。然后以＞50 000 Da的茶褐素作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.2 供試品溶液的制備

（1）普洱茶葉溶液的制備。準(zhǔn)確稱取3.00 g茶樣，加入沸水（蒸餾水）150 mL，搖勻后在沸水浴中浸提10 min，收集茶湯（浸提中搖瓶1次），取出搖勻，趁熱用濾紙過濾于三角瓶中，冷卻至室溫。將濾液倒入燒杯，加入無(wú)水乙醇至乙醇含量為80%，靜置5 h后進(jìn)行離心（4 500 r/min，10 min）后得沉淀。向沉淀中加入100 mL蒸餾水，溶解，吸取溶液1 L放入100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100 mL。此溶液作為供試品溶液。

（2）普洱茶粉溶液的制備。直接稱取茶粉樣品（約0.500 0 g）溶解于100 mL蒸餾水中，吸取1 mL濾液放入100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100 mL。此溶液作為供試品溶液（＞50 000 Da）。

1.3.3 茶褐素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.025 0 g（＞50 000 Da）的標(biāo)準(zhǔn)品，加蒸餾水溶解，定容至250 mL（c=0.1 mg/mL）。分別取0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL、8.0 mL、9.0 mL和10.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品于11支試管，分別加蒸餾水補(bǔ)至10 mL，靜置。分別在270 nm波長(zhǎng)下比色（0 mL試管作空白），以濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程：y=9.489 3x-0.003 8。

1.3.4 普洱茶及茶粉樣品的測(cè)定

將供試品溶液，用紫外分光光度計(jì)在270 nm波長(zhǎng)下，用1 cm厚的石英比色皿，蒸餾水為空白，測(cè)定溶液的吸光度。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，每次做3個(gè)平行。普洱茶及茶粉中茶褐素含量的測(cè)定按下列公式計(jì)算：

式中：A為270 nm下測(cè)定的吸光值；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

精密稱取0.025 0 g＞50 000 Da茶褐素標(biāo)準(zhǔn)品，加蒸餾水溶解，定容至250 mL。標(biāo)準(zhǔn)品濃度為（c=0.1 mg/mL）。分別取0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL、8.0 mL、9.0 mL及10.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品于11支試管，分別加蒸餾水補(bǔ)至10 mL，靜置。分別在270 nm波長(zhǎng)下比色（0 mL試管作空白），以濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程：A=10.024 1C+0.000 1，見圖1。

圖1 茶褐素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一批號(hào)的樣品約0.5 g，按照供試品溶液的制備方法操作，按供試品溶液的測(cè)定方法，于270 nm處連續(xù)測(cè)定吸光度6次。普洱茶RSD值為0.50%，茶粉RSD值為0.42%，結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批號(hào)的樣品，共計(jì)6份，按照供試品溶液制備方法操作，按供試品溶液的測(cè)定方法，于270 nm處連續(xù)測(cè)定吸光度。茶粉標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.51%，普洱茶（熟茶）RSD為0.54%結(jié)果穩(wěn)定，見表2和表3。

表2 茶粉的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表3 普洱茶（熟茶）的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的樣品，稱樣量5.005 g，按照供試品溶液制備方法操作，按供試品溶液的測(cè)定方法，在0 h、2 h、4 h、 6h、8 h、10 h及12 h于270 nm處測(cè)定起吸光度。當(dāng)時(shí)間放置在6 h以上時(shí)，吸光值趨于穩(wěn)定，見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品，共計(jì)6份，按照供試品溶液制備方法操作，加入茶褐素標(biāo)品，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按供試品溶液的測(cè)定方法，于270 nm處連續(xù)測(cè)定吸光度，計(jì)算茶褐素含量，結(jié)果見下表5和表6。通過表5和表6，茶粉的回收率在96.0%～98.0%，普洱茶（熟茶）回收率在96.0%～98.0%?；厥章蕦?shí)驗(yàn)效果好，有利于對(duì)樣品的測(cè)定。

表5 茶粉回收率試驗(yàn)結(jié)果

表6 普洱茶（熟茶）回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

通過對(duì)該方法一系列的驗(yàn)證，可以得出該檢測(cè)方法具有較好的線性范圍、較高的精密度、良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性及較高的回收率。本方法通過根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)測(cè)定茶褐素，方法簡(jiǎn)單、易行，操作簡(jiǎn)便，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定更接近真實(shí)值，準(zhǔn)確可信，適用于茶葉及茶制品中茶褐素的測(cè)定。