朱利芹，宗明珠，杜楠#

1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院靜安分院呼吸科，上海 200040

2淮安市第一人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇 淮安 223300

結(jié)直腸癌為消化系統(tǒng)中一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于胃癌，居消化系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位。目前結(jié)直腸癌主要采用手術(shù)治療，但結(jié)直腸癌早期多無典型表現(xiàn)，癥狀易與其他腸道、肛周疾病混淆，因此多數(shù)患者確診時(shí)病情已經(jīng)進(jìn)展至中晚期而失去了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。另有部分患者因腫瘤體積較大、粘連程度較嚴(yán)重或腫瘤處于低位接近肛周，而使手術(shù)治療保肛難度加大。即使成功開展手術(shù)治療，結(jié)直腸癌術(shù)后仍具有較高的復(fù)發(fā)率。因此于圍手術(shù)期給予輔助化療已經(jīng)成為結(jié)直腸癌手術(shù)治療的重要組成部分。輔助化療能夠增加手術(shù)治療機(jī)會(huì)，提高保肛率，輔助殺滅術(shù)后殘余微小腫瘤病灶，預(yù)防復(fù)發(fā)，延長患者生存時(shí)間。鉑類藥物為目前結(jié)直腸癌化療的常用藥物，當(dāng)患者對(duì)鉑類藥物耐藥時(shí)可直接影響化療療效，對(duì)患者的手術(shù)治療、預(yù)后均構(gòu)成嚴(yán)重不良影響。因此預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌對(duì)于鉑類藥物是否耐藥，可為化療藥物的選擇提供重要參考。膜聯(lián)蛋白A3、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）可通過多種途徑提高結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)于鉑類藥物的耐藥性。本研究客觀評(píng)估膜聯(lián)蛋白A3與HIF-1α在結(jié)直腸癌對(duì)鉑類藥物耐藥性預(yù)測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年1月至2020年6月淮安市第一人民醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌鉑類藥物化療患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)手術(shù)病理或活檢確診為結(jié)直腸癌；②美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)（第7版）分期為Ⅱ～Ⅲ期；③相關(guān)資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②化療前接受過分子靶向治療和（或）免疫治療；③有免疫功能異常史；④有血液系統(tǒng)疾病史。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入102例結(jié)直腸癌鉑類藥物化療患者，按首個(gè)化療周期對(duì)鉑類藥物的敏感情況劃分為有效組（63例）與耐藥組（39例）。有效組患者中，男39例，女24例；年齡46～81歲，平均（64.07±8.96）歲；TNM分期：Ⅱ期37例，Ⅲ期26例。耐藥組患者中，男24例，女15例；年齡48～79歲，平均（63.84±8.71）歲；TNM分期：Ⅱ期22例，Ⅲ期17例。兩組患者年齡、性別、TNM分期比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 全部患者均接受鉑類藥物化療，于1個(gè)化療周期結(jié)束后評(píng)估耐藥情況。以化療后與化療前相比腫瘤病灶未見縮小，達(dá)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的無效標(biāo)準(zhǔn)；化療結(jié)束后達(dá)完全緩解，隨后于6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)；符合任意一種情況為耐藥，無上述表現(xiàn)為敏感。以此結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，并據(jù)此分組。

1.2.2 外周血檢測(cè) 于入院后治療前采集全部患者清晨空腹肘前靜脈血5 ml，滴加抗凝劑后于無菌室內(nèi)22～26℃靜置20 min，置入離心機(jī)，離心半徑設(shè)置為12.5 cm，轉(zhuǎn)速設(shè)置為3000 r/min，處理10 min取得血清。按化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)膜聯(lián)蛋白A3水平，按酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)HIF-1α水平，操作步驟按試劑盒說明書執(zhí)行。

1.2.3 腫瘤組織免疫組化檢測(cè) 于術(shù)前活檢時(shí)采集全部患者的腫瘤組織。采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腫瘤組織中膜聯(lián)蛋白A3、HIF-1α水平，行二甲苯脫蠟，梯度酒精洗脫，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗 3次后，滴加0.01 mol/L的枸櫞酸緩沖液，煮沸后修復(fù)抗原，加入3%的HO孵育3 min，清除內(nèi)源性過氧化酶。加3%的山羊血清封閉液體，于37℃條件下孵育10 min，棄去封閉液；分別滴加1∶500鼠抗人膜聯(lián)蛋白A3單克隆抗體、鼠抗人HIF-1α抗體，于4℃條件下孵育過夜。以PBS沖洗3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗，37℃下孵育30 min，以PBS沖洗3次；隨后加入新配置的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液，以自來水沖洗、復(fù)染、封片。結(jié)果判定：由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片，于顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，依據(jù)腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞占比評(píng)定。染色強(qiáng)度：染色與陰性對(duì)照一致計(jì)0分，淡黃色染色計(jì)1分，棕黃色染色計(jì)2分，褐色染色計(jì)3分。陽性細(xì)胞占比：0%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，﹥75%計(jì)4分。兩項(xiàng)評(píng)分之和作為評(píng)價(jià)結(jié)果，合計(jì)計(jì)分﹤4分為陰性，≥4分為陽性。

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)比有效組與耐藥組患者外周血與腫瘤組織中膜聯(lián)蛋白A3、HIF-1α表達(dá)水平，分析外周血及腫瘤組織中膜聯(lián)蛋白A3、HIF-1α表達(dá)水平及二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)結(jié)直腸癌鉑類耐藥的預(yù)測(cè)價(jià)值。外周血與腫瘤組織中膜聯(lián)蛋白A3、HIF-1α聯(lián)合應(yīng)用采用Logistic擬合。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 外周血中膜聯(lián)蛋白 A 3、HIF-1 α表達(dá)水平的比較

耐藥組患者外周血中膜聯(lián)蛋白A3、HIF-1α表達(dá)水平均明顯高于有效組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 兩組患者外周血中膜聯(lián)蛋白 A 3、HIF-1 α表達(dá)水平的比較（±s）

2.2 腫瘤組織中膜聯(lián)蛋白 A 3、HIF-1 α對(duì)鉑類耐藥預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC分析

腫瘤組織中膜聯(lián)蛋白A3、HIF-1α及二者聯(lián)合對(duì)結(jié)直腸癌鉑類耐藥均具有中等預(yù)測(cè)價(jià)值。（表2、圖1）

表2 腫瘤組織中膜聯(lián)蛋白 A 3、HIF-1 α對(duì)鉑類耐藥預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC分析

圖1 腫瘤組織中膜聯(lián)蛋白A 3、HIF-1 α單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)鉑類耐藥預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC曲線

2.3 外周血中膜聯(lián)蛋白 A 3、HIF-1 α對(duì)鉑類耐藥預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC分析

外周血中膜聯(lián)蛋白A3與HIF-1α聯(lián)合應(yīng)用對(duì)結(jié)直腸癌鉑類耐藥具有較高預(yù)測(cè)價(jià)值，膜聯(lián)蛋白A3最佳截?cái)嘀禐?.970 mg/L，靈敏度為76.92%，特異度為100%；HIF-1α具有中等預(yù)測(cè)價(jià)值，最佳截?cái)嘀禐?83.750 pg/ml，靈敏度為76.92%，特異度為68.25%。（圖2、表3）

表3 外周血中膜聯(lián)蛋白 A 3、HIF-1 α對(duì)鉑類耐藥預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC分析

圖2 外周血中膜聯(lián)蛋白A 3、HIF-1 α單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)鉑類耐藥預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC曲線

3 討論

結(jié)直腸癌為臨床上一種常見的惡性腫瘤，化療在結(jié)直腸癌的治療與手術(shù)綜合治療中均具有重要作用。鉑類藥物為結(jié)直腸癌化療的常用藥物，但患者對(duì)于鉑類藥物的敏感性具有較大的個(gè)體差異。結(jié)直腸癌患者對(duì)鉑類藥物的耐藥性可直接影響化療效果，對(duì)患者的術(shù)后復(fù)發(fā)與預(yù)后生活質(zhì)量造成嚴(yán)重不良影響。因此盡早預(yù)測(cè)患者對(duì)鉑類藥物的耐藥性，應(yīng)用更為敏感的化療藥物能夠提高結(jié)直腸癌的臨床療效，降低復(fù)發(fā)率，改善患者生活質(zhì)量。

HIF-1α是一種參與結(jié)直腸癌諸多信號(hào)通路，發(fā)揮調(diào)控腫瘤血管生成、控制腫瘤細(xì)胞增殖與能量代謝、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子。在化療過程中腫瘤病灶內(nèi)部形成許多乏氧細(xì)胞，HIF-1α可為這些乏氧細(xì)胞提供能量，從而提升了腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，影響化療療效。HIF-1α高表達(dá)時(shí)不僅能夠提高結(jié)直腸癌對(duì)化療的敏感性，同時(shí)還具有促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展與轉(zhuǎn)移的作用。膜聯(lián)蛋白A3是一種Ca依賴磷脂結(jié)合蛋白，與腫瘤細(xì)胞的諸多生物功能具有密切相關(guān)性。在膀胱癌、肺癌、卵巢上皮癌等惡性腫瘤組織中膜聯(lián)蛋白A3均可見異常高表達(dá)，提示膜聯(lián)蛋白A3與包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的諸多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均具有相關(guān)性。謝祥紅和劉芳研究認(rèn)為膜聯(lián)蛋白A3能夠降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)部鉑類藥物與DNA的結(jié)合水平，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類藥物耐藥。在順鉑作用后的腫瘤細(xì)胞中，膜聯(lián)蛋白A3高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞成瘤率明顯高于膜聯(lián)蛋白A3低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，但膜聯(lián)蛋白A3對(duì)紫杉醇、表柔比星等藥物作用后的細(xì)胞成瘤率并未見明顯差異。因此提示膜聯(lián)蛋白A3極大可能為鉑類特異性耐藥分子標(biāo)志蛋白。

本研究結(jié)果表明，耐藥組患者外周血中膜聯(lián)蛋白A3、HIF-1α表達(dá)水平均高于有效組，提示耐藥組患者外周血中膜聯(lián)蛋白A3、HIF-1α表達(dá)水平具有作為結(jié)直腸癌鉑類耐藥標(biāo)志物的理論可行性。經(jīng)ROC曲線分析，外周血中膜聯(lián)蛋白A3對(duì)結(jié)直腸癌鉑類耐藥具有較高預(yù)測(cè)價(jià)值，當(dāng)結(jié)直腸癌患者外周血中膜聯(lián)蛋白A3﹥1.970 mg/L時(shí)提示患者對(duì)鉑類藥物耐藥，此時(shí)的靈敏度為76.92%，特異度為100%；當(dāng)結(jié)直腸癌患者外周血中HIF-1α﹥183.750 pg/ml時(shí)提示患者對(duì)鉑類藥物耐藥，此時(shí)的靈敏度為76.92%，特異度為68.25%；提示外周血中膜聯(lián)蛋白A3水平對(duì)于鉑類耐藥的預(yù)測(cè)價(jià)值更高。在外周血與腫瘤組織中，膜聯(lián)蛋白A3與HIF-1α聯(lián)合應(yīng)用時(shí)均可提高預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，外周血與腫瘤組織中膜聯(lián)蛋白A3與HIF-1α水平對(duì)結(jié)直腸癌鉑類耐藥的預(yù)測(cè)價(jià)值具有一定差異，但均具有中等至較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，且二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可提高預(yù)測(cè)價(jià)值；其中外周血中膜聯(lián)蛋白A3與HIF-1α水平具有量化性，且取材便捷、重復(fù)性好。本研究中尚未涉及膜聯(lián)蛋白A3與HIF-1α的聯(lián)合應(yīng)用，且研究納入病例數(shù)較少，有待于進(jìn)一步研究明確。