(葉 沁 盧文靜 諶 迪 張 岑 肖朝耿 孟祥河

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所1, 杭州 310021)

(浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2, 杭州 310014)

食用油在儲(chǔ)藏、熱加工過程中，受光照、高溫作用，同時(shí)可能曝露于氧氣、水分環(huán)境下，會(huì)發(fā)生水解、氧化、聚合、熱裂解等一系列反應(yīng)，并且油脂與其他食物成分的相互作用常常同時(shí)發(fā)生，造成食用油的質(zhì)量、營(yíng)養(yǎng)降低，甚至帶來健康隱患[1]。叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)，因其抗氧化效果好、成本低而被廣泛應(yīng)用于延緩油脂氧化[2]。然而由于食用油長(zhǎng)期暴露在高溫及有氧環(huán)境中，以及水分的存在會(huì)導(dǎo)致TBHQ自身發(fā)生氧化和降解。研究發(fā)現(xiàn)叔丁基對(duì)苯醌(TBBQ)是TBHQ氧化降解的主要產(chǎn)物[3]，且Li等[4]對(duì)比研究了大豆油在室溫下儲(chǔ)藏8 周以及120 ℃ 回流加熱24 h 后TBHQ 損失及TBBQ 的生成情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱處理過的食用油中TBBQ 的含量是非常小的(未給出具體數(shù)據(jù))，其含量遠(yuǎn)小于室溫下儲(chǔ)藏的食用油(約10 μg/mL)。前期研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)含有(204.89±1.63) mg/kg TBHQ的不同種類食用油在不同煎炸條件下油炸薯?xiàng)l時(shí)，在第1 批次到第5 批次煎炸后，煎炸油和油炸薯?xiàng)l中TBBQ殘留量均超過10 mg/kg[5]，表明不僅熱處理食用油中存在TBBQ，含油食品中同樣存在TBBQ風(fēng)險(xiǎn)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)TBBQ的毒性明顯高于TBHQ[6]，且可致多種模式細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象[7，8]。因此亟需對(duì)添加TBHQ的食用油及外加含TBHQ的食用油食品中的TBBQ含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析。然而目前食用油中TBBQ的分析仍借鑒TBHQ的分析方法[3，4]，存在前處理復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，尚沒有專用的檢測(cè)分析方法，難以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確快速、實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)。

紅外光譜定量技術(shù)近年來發(fā)展迅速。因其分析快速、操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)樣品無損在線分析的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用在食品品質(zhì)監(jiān)測(cè)領(lǐng)域[9,10]。此外，紅外光譜技術(shù)通常結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法(如偏最小二乘法，PLS)組合使用，目前基于FTIR結(jié)合PLS法已構(gòu)建了食用油中過氧化值[11]、碘價(jià)[12]、反式脂肪酸[13]、總極性化合物[14]和TBHQ[15]等快速檢測(cè)模型，所建模型的線性相關(guān)系數(shù)范圍為0.988 5～0.998 8，校正均方差為0.008 8～5.61，預(yù)測(cè)均方差為0.017～6.490。然而基于PLS法建模，需要大量的樣本量，樣品收集過程較為繁瑣。此外，基于特征吸收的朗伯比爾定律定量也是光譜中常用的定量方法，操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用廣泛。其前提是待分析組分有明顯的特征吸收峰，且能夠與其他吸收基線分離。近年來已有研究者利用紅外光譜與朗伯比爾定律結(jié)合對(duì)食用油中的酸價(jià)[16]、磷脂含量[17]、微量水分[18]進(jìn)行了快速測(cè)定，所建模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.37%～8.21%范圍內(nèi)。然而關(guān)于紅外光譜技術(shù)在測(cè)定食品中TBBQ含量的研究目前鮮有相關(guān)報(bào)道。

因此基于食用油及相關(guān)食品質(zhì)量安全保障的需求，建立一個(gè)高效、快速、準(zhǔn)確的TBBQ含量分析方法十分必要。本研究以大宗食用油代表精煉大豆油、菜籽油、葵花籽油和棕櫚油等為研究對(duì)象，對(duì)比研究FTIR結(jié)合朗伯比爾定律法和FTIR-PLS法快速定量分析TBBQ含量，以期對(duì)食用油及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量安全控制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及樣品

TBBQ(純度≥98%)；色譜級(jí)乙腈、色譜級(jí)正己烷。葵花籽油、大豆油、菜籽油、調(diào)和油：市售，棕櫚油杭州市糧油檢測(cè)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

配有透射附件的Bruker Tensor 27傅里葉中紅外光譜儀(OPUS光譜分析軟件)，7890氣相色譜儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 TBBQ的GC法分析

食用油中TBBQ的測(cè)定方法參照美國(guó)分析化學(xué)協(xié)會(huì)TBHQ標(biāo)準(zhǔn)分析方法(AOAC Official method 983.15)。具體方法為：取2 g油至50 mL離心管中，加入10 mL乙腈飽和的正己烷溶液，反復(fù)搖勻后轉(zhuǎn)移至125 mL分液漏斗中，加入10 mL正己烷飽和的乙腈溶液中，劇烈振蕩，靜置至分層。收集下層至50 mL圓底燒瓶中。重復(fù)萃取2次，收集萃取液，旋蒸至近干，定容至10 mL，過0.45 μm膜，進(jìn)行氣相分析。

GC條件：色譜柱HP-5 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)，初始柱溫60 ℃，保持2 min，隨后以10 ℃/min升至250 ℃。氮?dú)饬魉?.5 mL/min，進(jìn)樣口溫度280 ℃，進(jìn)樣量1 μL，不分流。

1.3.2 紅外光譜(FTIR)法

1.3.2.1 樣品的準(zhǔn)備

標(biāo)準(zhǔn)集樣品制備：準(zhǔn)確稱取TBBQ(≥98%)標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g于100 mL容量瓶中，色譜級(jí)乙腈溶解并定容，配制成1 000 μg/mL TBBQ-乙腈標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液避光保存于4 ℃條件下。分別移取儲(chǔ)備液并稀釋至TBBQ的質(zhì)量濃度分別為2、5、10、25、50、75、100、200 μg/mL。精確配制成總體積為5 mL的混合溶液，搖勻，靜置后備用。

預(yù)測(cè)集樣品制備：將TBBQ標(biāo)準(zhǔn)品分別按比例隨機(jī)溶于精煉葵花籽油、大豆油、花生油和菜籽油中，配置方法和比例同上。取2 g油樣用正己烷飽和的乙腈溶液萃取后，精確定容至5 mL得到的TBBQ乙腈溶液。

實(shí)際煎炸油樣品制備：取1.5 kg添加200 mg/kg TBHQ的大豆精煉油、菜籽油或棕櫚油置于恒溫煎炸鍋中，185 ℃下煎炸60 g預(yù)解凍的薯?xiàng)l，每批次煎炸3 min，每隔1 h煎炸1批，連續(xù)煎炸24批，以獲得不同TBBQ含量的不同種類的煎炸油。每批次煎炸結(jié)束后，取10 mL煎炸油冷卻至室溫，裝入棕色玻璃樣品瓶中于-80 ℃儲(chǔ)存用于后續(xù)TBBQ含量測(cè)定。TBBQ萃取方法同前述。

1.3.2.2 紅外光譜的采集

透射樣品的采集，CaF2樣品池用色譜純正己烷潤(rùn)洗5遍后，用待測(cè)樣品潤(rùn)洗3 遍，對(duì)TBBQ乙腈萃取液或樣品油上樣，采集FTIR光譜，每樣重復(fù)采集3次，以平均光譜記錄。OPUS軟件記錄4 000～400 cm-1的吸收光譜，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次，測(cè)量環(huán)境的濕度需小于70%，溫度保持在25 ℃。

1.3.2.3 模型建立

朗伯比爾定律法：分別取光譜級(jí)乙腈溶劑，采用 1 055 μm CaF2樣品池，記錄溶劑波譜S0，同時(shí)分別取質(zhì)量濃度為2、5、10、25、50、75、100、200 μg/mL TBBQ乙腈溶液，記錄標(biāo)準(zhǔn)樣品的原始波譜S1系列。在模型優(yōu)化過程中，做波譜減法運(yùn)算即S1-S0，得到系列差譜S2。同時(shí)對(duì)波譜S1和差譜S2進(jìn)行二階求導(dǎo)，并放大1 000倍，分別得到標(biāo)準(zhǔn)波譜的二階導(dǎo)數(shù)圖譜S1-2nd和差譜的二階導(dǎo)數(shù)圖譜S2-2nd。分別測(cè)量原始波譜S1、差譜S2、原始二階波譜S1-2nd和差譜二階S2-2nd相應(yīng)特征峰吸收強(qiáng)度，將其與TBBQ濃度相關(guān)，得到乙腈中TBBQ濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

PLS法：采用TQ Analyst光譜分析軟件對(duì)所得紅外光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)，自動(dòng)平滑等預(yù)處理及分析，優(yōu)化模型。在光譜采集過程中，光譜噪聲會(huì)造成偏最小二乘法出現(xiàn)微小偏差，影響模型的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)采集的光譜自動(dòng)平滑以提高模型的穩(wěn)定性，然后采用PLS模塊建模分析。

1.3.2.4 模型穩(wěn)定性的驗(yàn)證

對(duì)于所建的TBBQ朗伯比爾定律模型，隨機(jī)抽取煎炸后含有TBBQ的煎炸油，對(duì)比FTIR法TBBQ預(yù)測(cè)值與GC法標(biāo)準(zhǔn)值，計(jì)算相對(duì)誤差。

對(duì)于所建的TBBQ-PLS模型，需要對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。將TBBQ隨機(jī)溶于大豆油、菜籽油和花生油，摻入比例隨機(jī)配制預(yù)測(cè)集樣品。計(jì)算相關(guān)系數(shù)(R2)，交叉驗(yàn)證誤差均方根(RMSECV)、驗(yàn)證均方差(RMSEC)、預(yù)測(cè)均方差(RMSEP)。

外部驗(yàn)證獨(dú)立樣品分別為煎炸薯?xiàng)l不同時(shí)間后所得的大豆油、葵花籽油、棕櫚油、花生油，以及隨機(jī)選取的市售各類食用油。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用TQ Analyst光譜分析軟件進(jìn)行定標(biāo)模型的建立，建立導(dǎo)入的預(yù)測(cè)樣品根據(jù)建立的模型進(jìn)行數(shù)學(xué)運(yùn)算從而得出預(yù)測(cè)樣品的TBBQ的濃度，同時(shí)利用Origin 8.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 FTIR結(jié)合朗伯比爾定律快速分析TBBQ含量

2.1.1 紅外光譜的分析

圖1 典型的TBBQ乙腈溶液紅外光譜圖

根據(jù)TBBQ的結(jié)構(gòu)式，分別基于3 009、2 945、1 656 cm-1處進(jìn)行朗伯比爾定律線性擬合，其所得的回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表1所示。結(jié)果顯示，基于1 656 cm-1處所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線效果最優(yōu)，線性相關(guān)系數(shù)為0.977 9，故后續(xù)朗伯比爾建模波數(shù)采用1 656 cm-1。

表1 基于不同波數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 基于不同波譜處理的TBBQ標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

由于樣品本身的物理性質(zhì)、環(huán)境因素、儀器噪聲等因素會(huì)影響紅外光譜的采集，引起基線漂移和光譜重現(xiàn)性較差等問題，因此需要通過對(duì)波譜進(jìn)行預(yù)處理來提高模型的準(zhǔn)確度[20]。有研究表明，二階導(dǎo)數(shù)可有效降低波譜在采集過程中出現(xiàn)的漂移[10]，而差譜則可扣除溶劑基質(zhì)吸收影響[18]。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)原始波譜分別進(jìn)行差譜和差譜二階導(dǎo)數(shù)處理，TBBQ-乙腈溶液、差譜及差譜二階導(dǎo)數(shù)的波譜在1 640～1 660 cm-1波段內(nèi)的局部放大圖如圖2所示，構(gòu)建的線性回歸方程相關(guān)結(jié)果列于表2。基于差譜所構(gòu)建的回歸方程的線性效果(R2=0.994 9)均明顯優(yōu)于原始波譜(R2=0.977 9)，這可能是因?yàn)橐译嬷形⒘克?吸收峰1 630 cm-1)存在對(duì)TBBQ的特征吸收峰造成了一定的干擾?；诙A導(dǎo)數(shù)圖譜的回歸方程的線性關(guān)系(R2=0.998 1)優(yōu)于差譜(R2=0.994 9)，這可能是因?yàn)槎A導(dǎo)數(shù)可使峰銳化，利于峰拆分，此外還可部分消除基質(zhì)吸收，因此表現(xiàn)出較高的分析精密度。二者均明顯優(yōu)于TBBQ乙腈溶液原始紅外波譜回歸方程。最佳標(biāo)準(zhǔn)曲線為TBBQ(μg/mL)=108 9.5Abs-11.35。

表2 基于不同波譜處理的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 TBBQ-乙腈溶液(0～200 μg/mL)原始FTIR波譜、差譜及差譜二階導(dǎo)數(shù)波譜局部放大圖(1 640～1 660 cm-1)

2.2 TBBQ-朗伯比爾定律模型穩(wěn)定性分析

基于不同波譜處理方法所得紅外光譜TBBQ特征峰的標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性分析結(jié)果如表3所示。不同波譜處理方法的所得TBBQ紅外預(yù)測(cè)值與化學(xué)值之間的相對(duì)誤差在1.22%～14.79%之間。從相對(duì)誤差的平均值看，基于差譜所構(gòu)建的模型穩(wěn)定性均略優(yōu)于原始波譜所構(gòu)建模型的穩(wěn)定性；且經(jīng)差譜-二階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理組模型穩(wěn)定性最佳，相對(duì)誤差范圍為1.22%～6.55%，相對(duì)誤差平均值僅為3.46%。楊志成等[18]采用溶劑萃取耦合FTIR技術(shù)結(jié)合朗伯比爾定律法分析了食用油中微量水分，同樣發(fā)現(xiàn)二階導(dǎo)數(shù)處理可以明顯改善模型的準(zhǔn)確度。模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度后面將采用獨(dú)立實(shí)際煎炸油樣品和實(shí)際食用油樣品進(jìn)行外部驗(yàn)證，并結(jié)合PLS模型一起討論。

表3 基于不同波譜處理方法測(cè)定的TBBQ標(biāo)準(zhǔn)值與紅外預(yù)測(cè)值比較

2.3 基于FTIR結(jié)合PLS快速分析TBBQ含量

表4 基于中紅外透射光譜結(jié)合PLS在不同預(yù)處理方式及不同建模區(qū)間對(duì)TBBQ模型穩(wěn)定性的影響

10組不同TBBQ濃度的精煉葵花籽油、大豆油、花生油、菜籽油樣品，采用原波譜最佳模型的預(yù)測(cè)結(jié)果與真實(shí)值的線性相關(guān)方程為Y=0.973 7X+0.005，相關(guān)系數(shù)R2=0.987 2，數(shù)據(jù)顯示FTIR-PLS模型TBBQ預(yù)測(cè)結(jié)果均與實(shí)際值高度符合，說明所構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型對(duì)TBBQ含量預(yù)測(cè)值和添加值一致性較好。Ammawath 等[15]基于TR-FTIR技術(shù)結(jié)合PLS法，在3 600～2 800 cm-1區(qū)間上構(gòu)建了精煉棕櫚油中TBHQ含量的快速檢測(cè)模型。結(jié)果顯示其模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.996 1，模型校正均方差為5.06，預(yù)測(cè)均方差為6.49。然而該模型并不適用于油脂中TBBQ的含量檢測(cè)。Li等[21]采用液相色譜技術(shù)構(gòu)建了食用油中TBBQ含量的檢測(cè)方法，所建方法的回收率為96.28%～100.58%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為0.30%～1.71%，該方法準(zhǔn)確度較高。然而傳統(tǒng)化學(xué)法分析時(shí)間較長(zhǎng)，難以實(shí)現(xiàn)快速、實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)。

2.4 準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選取15組不同溫度下煎炸薯?xiàng)l1～24 h后的實(shí)際煎炸油樣品，分別采用標(biāo)準(zhǔn)GC法、朗伯比爾定律模型和PLS模型進(jìn)行TBBQ含量測(cè)定，不同模型預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)列于表5。其中朗伯比爾定律模型預(yù)測(cè)組的平均相對(duì)誤差4.89%；PLS預(yù)測(cè)組為8.53%。對(duì)比發(fā)現(xiàn)本研究所采用的FTIR結(jié)合朗伯比爾定律和FTIR結(jié)合PLS法所構(gòu)建的TBBQ快速檢測(cè)模型均可用于煎炸油中TBBQ含量的快速測(cè)定，并且FTIR結(jié)合朗伯比爾定律法的準(zhǔn)確性優(yōu)于PLS法。

表5 準(zhǔn)確性驗(yàn)證結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)收集了市售的10種不同品牌不同類型的食用油作為外部驗(yàn)證的樣品，分別用標(biāo)準(zhǔn)GC法、朗伯比爾定律模型和PLS模型進(jìn)行TBBQ含量測(cè)定，不同模型預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)列于表6。市售的10種食用油中TBBQ含量朗伯比爾定律模型和PLS模型預(yù)測(cè)組的平均相對(duì)誤差分別為6.80%和8.40%，表明本研究所構(gòu)建的TBBQ快速檢測(cè)模型具有良好的預(yù)測(cè)能力，模型穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度較好。因此本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的FTIR快速分析煎炸油中TBBQ的方法可有望實(shí)現(xiàn)替代傳統(tǒng)化學(xué)分析法。

表6 基于不同模型預(yù)測(cè)10種市售食用油TBBQ含量

3 結(jié)論

建立了基于FTIR技術(shù)的食用油TBBQ快速測(cè)定方法，分析時(shí)間從傳統(tǒng)GC方法的2～3 h縮短到30 min。經(jīng)分析比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TIR結(jié)合朗伯比爾定律法和FTIR結(jié)合PLS法均可用于食用油中TBBQ含量的快速測(cè)定。其中，F(xiàn)TIR結(jié)合朗伯比爾定律法所構(gòu)建的模型穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度明顯更好，該方法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，適合于食用油品質(zhì)的快速分析，這為逐步構(gòu)建食用油在煎炸過程中的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考，同時(shí)對(duì)改善煎炸油及煎炸食品質(zhì)量安全，保證消費(fèi)者身體健康具有積極意義。