金潔琪，光夢凱

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 口腔科，北京 100050；2.中日友好醫(yī)院 口腔醫(yī)學(xué)中心，北京 100029）

慢性牙周炎是牙齒周圍支持組織的常見病，且與各種系統(tǒng)性疾病如冠心病，糖尿病等密切相關(guān)甚至相互促進[1，2]，因此積極治療牙周病非常有必要。目前牙周病的治療主要在于菌斑控制[3]而對促進牙周再生上有所欠缺。低分子量透明質(zhì)酸（hyaluronan，HA）有抗炎，促進組織再生的作用，在臨床上應(yīng)用廣泛[4]，而其對慢性牙周炎的作用待研究。

1 材料和方法

1.1 材料

選擇牙周組織中廣泛存在的人間充質(zhì)干細胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）：購入原代細胞（Lonza 公司）后分離培養(yǎng)，傳代至第5、6代后用于本次實驗。成骨誘導(dǎo)（osteogenic stimulation，OS）液由地塞米松、β-甘油磷酸鹽、抗壞血酸等加入培養(yǎng)基配成，具體配方見表1。

表1 成骨誘導(dǎo)液配比

HA 來自HYALOSE 公司。選擇分子量3～6Da的Nano HA 及分子量150kDa 的HA 進行實驗，每次實驗用濃度為20ng/ml[5，6]。

1.2 實驗方法

共分為空白對照組、陽性對照組 （OS 組）、Nano HA（OS+Nano HA）組和150K HA（OS+150K HA）組。

hMSCs 細胞在37℃、5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)，每周換液2 次。每周同一時間顯微鏡拍照進行細胞形態(tài)學(xué)觀察。細胞增殖WST-1 檢測：將hMSCs 均勻種在4 盒48 孔培養(yǎng)皿中，等待48h，細胞完全附著生長后，標(biāo)記為起點，分別在第0d、7d、14d、21d進行細胞增殖。WST-1 試劑盒來自Roche 公司，加入培養(yǎng)皿30min 后，將細胞進行ELISA 測試。

rt-PCR： 將hMSCs 均勻種在6 孔培養(yǎng)皿中，等待48h，細胞完全附著生長后，標(biāo)記為起點，分別在第0d、7d、14d、21d 刮取細胞，提取RNA，轉(zhuǎn)化為cDNA 后，進行rt-PCR 試驗。管家基因選用GAPDH （search LC，Heidelberg 公司）。檢測標(biāo)記物為早期成骨標(biāo)記物堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP）及末期成骨標(biāo)記物骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）。

鈣沉積定量檢測： 將hMSCs 均勻種在T-25培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)21d 后分離刮取細胞，使用QuantiChromTM鈣沉積試劑盒，加入試劑后進行ELISA 測試。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用Prism8.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析。兩兩比較采用t 檢驗，組間比較采用one-way ANOVA。

2 結(jié)果

2.1 HA 成骨誘導(dǎo)及形態(tài)學(xué)觀察

由圖1 可見，空白對照組中hMSCs 呈梭形或多角形，集落狀生長，隨著培養(yǎng)時間的增加，集落逐漸融合，細胞均勻聚集分布（圖A1～A3）。B 組為成骨誘導(dǎo)的陽性對照組，第7d 起hMSCs 多呈圓形或橢圓形，第21d 可見類似骨樣圓形結(jié)構(gòu)形成（B3 中箭頭所指），并有少量黑色礦物質(zhì)沉積。C組為Nano HA 實驗組，細胞形態(tài)與B 組類似，第21d 時亦可觀察到有類似骨樣圓形結(jié)構(gòu)形成，并有比B 組更多的黑色礦物質(zhì)沉積 （C3 中箭頭所指）。D 組為150K HA 實驗組，hMSCs 與B 組類似，第14d 即有較C 組更明顯的骨樣組織形成（D2），第21d 時骨樣圓形結(jié)構(gòu)黑色礦物質(zhì)沉積與C 組類似（D3）。

圖1 hMSCs 培養(yǎng)7d、14d、21d 時鏡下片（×4）

2.2 HA 刺激hMSCs 增殖

圖2 示，實驗初期各組細胞生長速度接近，第14d 時，各組細胞生長速度開始略有不同，但各組內(nèi)并無統(tǒng)計學(xué)差異。第21d 時，Nano HA 組較空白對照組細胞增殖顯著增快（P<0.01），較OS 組亦較快（P<0.01）。150K HA 組較空白對照組增速較快（P<0.01）。2 種分子量HA 對細胞增殖無統(tǒng)計學(xué)差異，OS 組與空白對照組間亦無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖2 hMSCs WST-1 細胞增殖實驗

2.3 rt-PCR 中ALP、OCN 的表達

圖3 示，ALP 在hMSCs 中的表達在 前7d 隨著時間增加而增加，21d 時均有所下降。在實驗的第3d、7d Nano HA 組比OS 組表達更多的ALP（均P<0.05）。第21d，Nano 和150k HA 組都比陽性對照組有更高的表達 （P<0.05，P<0.01）；150k比Nano HA 組顯著增高（P<0.01）?？瞻讓φ战M在每個時間點均比同期的其他實驗組的ALP 表達要低。各組內(nèi)第3d、7d 和21d 時ALP 的表達均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P<0.01）。

圖3 hMSCs rt-PCR 中ALP 的表達

圖4 中OCN 表達可見與ALP 的表達類似，前7d 隨著時間增加而增加，到21d 時均有所下降。第3d、7d Nano HA 組的OCN 表達顯著高于OS 組（均P<0.01）。150k HA 組表達與陽性對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。第3d、7d 和21d 時組內(nèi)OCN 的表達均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P<0.01）。

圖4 hMSCs rt-PCR 中OCN 的表達

2.4 鈣沉積實驗結(jié)果

圖5 示，21d 時HA 對hMSCs 成骨分化有促進作用，尤以Nano HA 為甚。

圖5 hMSCs 鈣沉積定量實驗

HA 實驗組鈣沉積量均顯著高于空白對照組（均P<0.01），提示HA 可刺激hMSCs 成骨的分化。2 種分子量的HA 均有顯著的刺激成骨的作用，Nano HA 及150K HA 組的鈣沉積量均顯著高于陽性對照組（均P<0.01）。此外，Nano HA 對細胞成骨的刺激顯著高于150K HA 組 （P<0.05）。鈣沉積量按多少排序為：Nano 組＞150k 組＞OS組＞空白對照組。

3 討論

HA 由于其低細胞毒性、低抗原性、低致敏性，臨床上在美容、關(guān)節(jié)軟骨、關(guān)節(jié)炎治療等方面已經(jīng)廣泛臨床應(yīng)用[7，8]。高分子量HA 對大部分細胞有抑制增殖的作用[9]。而低分子量HA 則相反，其刺激細胞增殖，本實驗結(jié)果亦驗證了這一結(jié)果。在d21 時Nano HA 及150K HA 促 進hMSCs 增殖。ALP 是成骨分化早期的標(biāo)志物，細胞內(nèi)ALP表達增高表明成骨的增加[10]。本實驗中2 種HA都能提高hMSCs 的ALP 的表達，150kDa HA 比Nano HA 要更強。唾液中的OCN 含量與牙周炎的嚴重程度不相關(guān)[11]，但卻是成骨晚期的標(biāo)記物[12]。本實驗中150kDa HA 對OCN 似乎沒有影響，而Nano HA 可以提高hMSCs 的OCN 表達。鈣沉積實驗中，成骨誘導(dǎo)及低分子量HA 的加入較空白對照組均能顯著增加鈣沉積物，尤其是Nano HA可以顯著增加細胞中鈣的含量?？傊?，低分子量HA 的加入可以刺激hMSCs 成骨方向的分化。

HA 可誘導(dǎo)受損組織中成纖維細胞和角質(zhì)細胞分化以修復(fù)受損傷的組織[13]，還可以在炎癥狀態(tài)下激活組織免疫反應(yīng)[14]，對于牙周炎這種慢性炎癥應(yīng)用前景廣泛。此外HA 還可以誘導(dǎo)軟骨及韌帶的修復(fù)[15]。后期對于牙周再生起重要作用的hMSCs 成軟骨及成纖維分化將進一步研究。