程 林,可 紅

(1山東省立第三醫(yī)院急診科,濟(jì)南 250000;2山東第一醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科;*通訊作者,E-mail:1508030056@qq.com)

近年來(lái),神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生率和死亡率越來(lái)越高。研究表明,炎癥反應(yīng)在許多神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[1]。神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí),機(jī)體主要通過(guò)神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞的介導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)[2]。研究顯示,抑制炎癥反應(yīng)可改善神經(jīng)疾病動(dòng)物模型的預(yù)后[3,4]。然而,神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的具體機(jī)制仍不明確。

樹(shù)突狀細(xì)胞相關(guān)C型凝集素1(Dectin-1)是免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)偶聯(lián)的C型凝集素受體(CLR)。它可識(shí)別各種與危險(xiǎn)因素相關(guān)的病原體,并通過(guò)招募其下游分子脾酪氨酸激酶(Syk)觸發(fā)炎癥信號(hào)[5]。據(jù)研究報(bào)道,引發(fā)炎癥反應(yīng)的免疫受體在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6,7]。然而,尚未有研究證實(shí)腦損傷后免疫受體Dectin-1在神經(jīng)炎癥反應(yīng)中的作用。

Syk參與多種細(xì)胞類型的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),是機(jī)體炎癥細(xì)胞中免疫受體信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)[8]。Syk抑制劑PIC可以緩解缺血再灌注后的組織損傷[9]。Dectin-1通過(guò)活化的ITAM招募Syk并使其激活發(fā)生磷酸化,隨后調(diào)控下游炎癥因子的產(chǎn)生。研究表明,巨噬細(xì)胞中Dectin-1和Syk參與了先天免疫反應(yīng)的過(guò)程[10]。然而,Dectin-1/Syk信號(hào)通路是否參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的神經(jīng)炎癥反應(yīng),目前尚未有研究報(bào)道。本研究探討揭示Dectin-1/Syk信號(hào)通路在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)炎癥反應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與LPS炎癥模型建立

BV2細(xì)胞培養(yǎng)于完全DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基),按照106/ml的細(xì)胞密度接種到10 cm培養(yǎng)皿中,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度為5×105/cm2時(shí),更換培養(yǎng)基,同時(shí)加入LPS,使其最終工作濃度為1 μg/ml[11]。將細(xì)胞在正常條件下培養(yǎng)3,6,12,24 h,然后提取細(xì)胞蛋白質(zhì)。

1.2 體外給藥

將Dectin-1受體拮抗劑LAM(Sigma-Aldrich,Merck)用生理鹽水稀釋至10 mg/ml,Syk抑制劑PIC(Selleck Chemicals,Houston,TX,USA)用DMSO稀釋至50 mmol/L。根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分組(每組3個(gè)重復(fù),n=3):空白對(duì)照組(對(duì)照組)、LAM預(yù)處理對(duì)照組(對(duì)照+LAM組)、脂多糖(LPS)組、LAM預(yù)處理LPS組(LPS+LAM組)、PIC預(yù)處理對(duì)照組(對(duì)照+PIC組)和PIC預(yù)處理LPS組(LPS+PIC組)。在LPS誘導(dǎo)前,培養(yǎng)基中加入300 μg/ml LAM或25 μmol/L PIC預(yù)處理1 h。然后培養(yǎng)基中加入工作濃度為1 μg/ml的LPS孵育24 h,提取細(xì)胞蛋白。

1.3 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

按蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞蛋白樣品,BCA法測(cè)定蛋白濃度。我們使用的一抗是Dectin-1抗體(1∶1 000,英國(guó)Abcam公司),Syk抗體(1∶1 000,美國(guó)CST公司),p-Syk抗體(1∶1 000,美國(guó)CST公司),TNF-α抗體(1∶1 000,美國(guó)CST公司)和iNOS抗體(1∶1 000,美國(guó)CST公司),GAPDH抗體(1∶1 000,美國(guó)CST公司)。根據(jù)一抗來(lái)源選擇合適的二抗(1∶3 000,美國(guó)CST公司)。等量蛋白樣品經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后,采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上。用5%(50 g/L)脫脂奶粉封閉后,一抗孵育4 ℃過(guò)夜,二抗孵育2 h。使用辣根過(guò)氧化物酶顯色法(ECL)將膜曝光顯色。采用Image J軟件測(cè)量條帶的灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量(每組至少重復(fù)3次,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)后BV2細(xì)胞中Dectin-1、Syk和p-Syk的蛋白表達(dá)增加

與對(duì)照組相比,LPS組中LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞3,6,12,24 h時(shí),Dectin-1、Syk和p-Syk的表達(dá)水平顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖1),其中Dectin-1,Syk和p-Syk的表達(dá)水平在誘導(dǎo)24 h時(shí)升高最為明顯,故選擇LPS誘導(dǎo)24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05

2.2 阻斷Dectin-1可以抑制Dectin-1/Syk信號(hào)通路

與對(duì)照組相比,LPS組中Dectin-1和p-Syk的蛋白表達(dá)顯著增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);然而,與LPS組相比,LPS+LAM組Dectin-1和p-Syk蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。與對(duì)照組相比,LPS組中TNF-α和iNOS表達(dá)量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與LPS組相比,LPS+LAM組中TNF-α和iNOS的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05,見(jiàn)圖2)。這些結(jié)果表明Dectin-1在神經(jīng)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與LPS組比較,#P<0.05

2.3 PIC通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥中Dectin-1/Syk信號(hào)通路而減少TNF-α和iNOS的產(chǎn)生

與LPS組相比,LPS+PIC組BV2細(xì)胞中p-Syk蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05),而且LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中TNF-α和iNOS的表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但LPS組和LPS+PIC組的Dectin-1表達(dá)水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)圖3)。這些結(jié)果表明,Dectin-1/Syk信號(hào)通路在神經(jīng)炎癥反應(yīng)中具有重要作用。

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與LPS組比較,#P<0.05

3 討論

Dectin-1是一種Ⅱ型跨膜受體,屬于CLR家族,其胞外存在一個(gè)C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(CTLD),可以識(shí)別真菌細(xì)胞壁中具有的β-1,3葡聚糖碳水化合物[11]。有研究報(bào)道,Dectin-1在黏膜皮膚真菌感染或真菌誘導(dǎo)的腸道炎癥中發(fā)揮重要作用[12],Dectin-1可以激活NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體,從而促進(jìn)促炎因子IL-1β的產(chǎn)生[13]。此外,先前研究顯示Dectin-1在正常腦組織中處于低表達(dá)水平或沒(méi)有表達(dá),但暴露于各種刺激(例如缺血和損傷)后其表達(dá)顯著增加[7]。Dectin-1的活化還可引起巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的脫髓鞘和軸突損傷,而阻斷Dectin-1可減少脊髓損傷后巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)損傷[14]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)后BV2細(xì)胞中Dectin-1的蛋白表達(dá)顯著增加,LAM預(yù)處理后Dectin-1的蛋白表達(dá)降低。這些數(shù)據(jù)表明,Dectin-1過(guò)表達(dá)可能對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生有害影響,并增強(qiáng)TNF-α和iNOS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

壞死細(xì)胞釋放的危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(DAMPs)與Dectin-1結(jié)合,導(dǎo)致Syk的募集和活化[15]?；罨腟yk(p-Syk)調(diào)控下游信號(hào)分子(如p85、pkb、pdk1和NF-κB)的表達(dá)與激活,導(dǎo)致促炎因子的表達(dá),包括TNF-α、COX-2和iNOS[16]。Syk抑制劑PIC能降低視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后的神經(jīng)元損傷。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)后BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中的Syk和p-Syk蛋白表達(dá)均增加。Syk抑制劑PIC預(yù)處理可減少LPS炎癥模型中Syk、p-Syk、TNF-α和iNOS的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明,Syk表達(dá)的增多可能對(duì)腦組織產(chǎn)生有害影響,并增強(qiáng)腦內(nèi)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

神經(jīng)炎癥在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的腦損傷和修復(fù)中發(fā)揮重要作用。在神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)炎癥反應(yīng)期間,由于細(xì)胞缺氧和缺血導(dǎo)致細(xì)胞死亡,并引發(fā)危險(xiǎn)相關(guān)分子模式的產(chǎn)生,隨后激活駐留的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。激活的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放一系列細(xì)胞因子和趨化因子,過(guò)多表達(dá)的促炎因子會(huì)加重細(xì)胞損傷[17]。本研究表明,LPS誘導(dǎo)后,可激活BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中的Dectin-1和Syk,使其蛋白表達(dá)量增加。Dectin-1通過(guò)激活Syk引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子TNF-α和iNOS的表達(dá)增多;Dectin-1和Syk抑制劑預(yù)處理,均可以降低p-Syk的表達(dá),抑制LPS誘導(dǎo)后BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中的促炎因子TNF-α和iNOS的釋放。總之,Dectin-1/Syk信號(hào)通路在LPS刺激的神經(jīng)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,進(jìn)一步研究Dectin-1/Syk信號(hào)通路在神經(jīng)炎癥反應(yīng)中的病理生理機(jī)制,可能為神經(jīng)炎癥相關(guān)臨床疾病的治療提供新的靶點(diǎn)。