李慕白，張明明，馬紅麗，侯麗輝

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，由于該腫瘤惡性程度高、組織類型復(fù)雜，且尚未找到有效的早期篩查方法，使3/4患者出現(xiàn)癥狀就醫(yī)時(shí)已至晚期[1-3]?；熾m是中晚期卵巢癌主要的治療手段，但耐藥現(xiàn)象致使卵巢癌患者生存期延長(zhǎng)并不明顯。因此開發(fā)出具有抗腫瘤活性、毒副作用小、無交叉耐藥性的新型抗腫瘤藥物，從而提高卵巢癌患者的生存率和生活質(zhì)量，有著現(xiàn)實(shí)的研究意義[4]。中藥作為一種低毒有效的抗腫瘤藥物已經(jīng)越來越被世人所關(guān)注。隨著對(duì)疾病及植物藥結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)的不斷深入，老藥新用已成為一種趨勢(shì)。核桃楸作為一種抗癌的民間中藥，具有清熱解毒、消腫止痛的功效，其樹葉、樹皮、外果皮及果實(shí)均有很大藥用價(jià)值[5]。有學(xué)者對(duì)核桃楸葉、外果皮有效成分的提取及抗腫瘤作用進(jìn)行了研究[6-9]，但對(duì)核桃楸皮的提取鑒定及體外抑瘤的實(shí)驗(yàn)研究尚少有報(bào)道。據(jù)此，本試驗(yàn)對(duì)核桃楸皮有效成分的提取及抗癌作用進(jìn)行了研究，旨在為今后深入的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1細(xì)胞株 人卵巢癌細(xì)胞株H0-8910PM由中國(guó)科學(xué)院上海生物研究所細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2主要試劑及藥物 核桃楸樹皮，2018年7月采于黑龍江省葦河林場(chǎng)；DMEM高糖培養(yǎng)液購(gòu)于Hyclone公司；小牛血清購(gòu)于杭州四季青公司；PBS液、0.25%胰酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)于AMRESCO公司；二甲基亞堿(DMSO)購(gòu)于上海華舜公司；臺(tái)盼藍(lán)由重慶醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室提供。

1.3主要儀器及設(shè)備 核磁共振儀、熔點(diǎn)儀購(gòu)于北京泰克儀器有限公司；紫外分析儀購(gòu)于上海寶山顧村電光儀器廠；層析柱、層析用硅膠購(gòu)于青島海洋化工廠；薄層層析板購(gòu)于煙臺(tái)匯友硅膠開發(fā)有限公司；Hareus超凈工作臺(tái)(HFSafe1200型)和Hareus二氧化碳孵箱(BB5060型)均購(gòu)于力新公司；OLYMPUS倒置相差顯微鏡(1*5058F2型)和Bio-RAO Model 550型自動(dòng)酶聯(lián)檢測(cè)儀，日本制造；TDL-40B-C型臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)于上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.4核桃楸的有效成分提取 取2.0 kg核桃楸干樹皮粉碎，用33 L無水乙醇浸泡4次，每次3 d。合并浸泡液過濾濃縮至500 mL左右，用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，制得相應(yīng)的提取物。取乙酸乙酯提取物21.2 g，通過柱層析分離(柱徑為6.0 cm，流動(dòng)相：石油醚/乙酸乙酯=8/22 000 mL，5/51 500 mL，乙酸乙酯2 000 mL，乙酸乙酯/乙醇=8/22 000 mL，甲醇2 000 mL)得到6個(gè)部分(F1～F6)，將F1(34 g)經(jīng)柱層析分離(柱徑為4.5 cm，流動(dòng)相:石油醚/乙酸乙酯=8/21 500 mL,5/51 500 mL，乙酸乙酯2 000 mL)得到化合物1和3。F4(2.7 g)經(jīng)柱層析分離(柱徑為3.0 cm，流動(dòng)相:石油醚/乙酸乙酯=5/51 500 mL,乙酸乙酯2 000 mL)得到化合物6。F5(6.5 g)經(jīng)柱層析分離(柱徑為5.0 cm，流動(dòng)相:氯仿/甲醇=8/23 000 mL，5/51 500 mL，甲醇2 000 mL)得化合物11，14和15。化合物1,3,6,11,14,15即核桃楸的有效成分Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將卵巢癌細(xì)胞株HO-8910PM接種于含100 IU/mL青霉素、100 IU/mL鏈霉素、15%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中,置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為104個(gè)/mL，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、Y1組、Y2組、Y3組、Y4組、Y5組、Y6組，接種于96孔培養(yǎng)板中，200 μL/孔,37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.6細(xì)胞形態(tài)學(xué)及MTT比色法觀察 空白對(duì)照組不加藥物，作為各藥物各濃度水平的共同對(duì)照。Y1組：取核桃楸提取物，按10-8mg/mL、10-7mg/mL、10-6mg/mL、10-5mg/mL的濃度梯度稀釋，每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)孔。加入細(xì)胞孔后，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，取出培養(yǎng)板,于顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化后，每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL)37 ℃繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入20 μL DMSO,振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光吸收值,記錄結(jié)果,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,然后計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)]×100%。其余5組觀察方法同Y1組。

2 結(jié) 果

2.1核桃楸提取物的結(jié)構(gòu)鑒定 Y1為棕色粉末，其譜圖數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]對(duì)照一致，故確定該化合物為a-羥基-四氫萘醌。Y2為黃色針狀晶體，其譜圖數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]中胡桃醌數(shù)據(jù)完全一致，故鑒定為胡桃醌。Y3譜圖數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]對(duì)照一致，故確定該化合物的結(jié)構(gòu)為4，8-二羥基萘酚-1-0-β-D-[6′-0-(3″，5″-二甲氧基-4″-羥基苯甲?；?]葡萄糖苷。Y4為棕黃色粉，根據(jù)其圖譜數(shù)據(jù)可確定該化合物為4，8-二羥基萘酚-β-D-(6′-乙酰氧基葡萄糖苷)。Y5為紅棕色固體,數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]一致，確定為4，8-二羥基萘酚-β-D-葡萄糖苷。Y6的碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致，確定該化合物為4，5，8-二羥基-a-四氫萘醌-5-0-β-D-[6′-0-(4″-羥基-3″，5″-二甲氧基苯甲?；?]葡萄糖苷。

2.2核桃楸提取物對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM的抑制作用 Y1、Y3、Y6組HO-8910PM細(xì)胞增殖抑制率有梯度變化，其他藥物組細(xì)胞增殖抑制率無梯度變化。見表1。

表1 核桃楸6種提取物組卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM的增殖抑制率 %

2.3核桃楸提取物對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM的時(shí)效與量效關(guān)系 Y1、Y3、Y6各4個(gè)濃度梯度分別作用于卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM 24 h、48 h、72 h后，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，且抑制率隨藥物濃度的增高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，即呈劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系。見圖1。

圖1 核桃楸提取物Y1、Y3、Y6培養(yǎng)卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞24 h、48 h、72 h后濃度-效應(yīng)曲線

2.4核桃楸提取物對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM形態(tài)學(xué)影響 將HO-8910PM細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后與空白對(duì)照組相比，低倍鏡下藥物組的HO-8910PM細(xì)胞數(shù)量逐漸減少；高倍鏡下藥物組的HO-8910PM細(xì)胞貼壁能力下降，呈懸浮狀態(tài)，細(xì)胞變小、變圓，胞漿濃縮，胞核深染，出現(xiàn)空泡變性，尤其是在作用72 h后，細(xì)胞出現(xiàn)大片脫落死亡。抑制作用最顯著的10-5mg/mL核桃楸提取物Y6培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后人卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM形態(tài)見圖2。

圖2 10-5mg/mL核桃楸提取物Y6培養(yǎng)卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞24 h、48 h、72 h后形態(tài)

3 討 論

中醫(yī)古籍中并無“卵巢癌”的病名記載，但根據(jù)其發(fā)病特點(diǎn)和臨床癥狀，可歸納為“腸蕈”“癥瘕”“積聚”等范疇[14]?！鞍Y瘕”最早記載于《素問·骨空論》，“任脈為病……女子帶下癥聚”，并且認(rèn)為其病位在奇經(jīng)任脈[15]?！鹅`樞·水脹篇》以“石瘕”“腸覃”“壤肉”分別記述。中醫(yī)認(rèn)為:癥者，由寒溫失節(jié)致臟腑元?dú)馓撊?，而食欲不消，聚結(jié)在內(nèi)所致，或寒氣客于腸外與衛(wèi)氣相搏而不去，始生腸蕈。根據(jù)中國(guó)歷代醫(yī)家對(duì)“癥瘕”的描述及中醫(yī)學(xué)理論分析，外感邪毒、內(nèi)傷飲食及情感抑郁為其致病因素，而臟腑陰陽(yáng)氣血失調(diào)，正氣虛損則是致病基礎(chǔ)，二者?；橐蚬?，最終使痰、濕、氣、血瘀滯于沖任、胞脈，久之則導(dǎo)致卵巢疾病的發(fā)生。因此，在臨床上治療以扶正固本、祛邪攻毒為主。

核桃楸為胡桃科胡桃屬落葉喬木，別名胡桃楸、山核桃，主要分布于我國(guó)東北、華北等地區(qū)。其皮、葉、根、果實(shí)均可入藥，具有清熱解毒、止痢明目等功效[16]。近年來,諸多學(xué)者對(duì)核桃楸用藥部位、有效成分進(jìn)行了相關(guān)研究。曹治家等[17]的研究結(jié)果表明，從核桃楸皮中分離得到的木犀草素具有較明顯的抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。Gao等[18]的實(shí)驗(yàn)表明，一種從核桃楸中提取的新型多不飽和脂肪酸JA限制了肝癌細(xì)胞的存活，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。姜秀梅等[19]的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)山核桃楸的乙醇浸出物對(duì)子宮頸癌HeLa細(xì)胞有一定的抑制作用。上述研究表明核桃楸提取物能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，而對(duì)于人卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制作用目前鮮有報(bào)道，因而為了探討核桃楸提取物對(duì)卵巢癌的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)觀察了核桃楸提取物對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO-8910PM分別作用24 h、48 h、72 h的抑瘤作用。結(jié)果表明，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)和藥物濃度提高，核桃楸提取物Y1、Y3、Y6對(duì)HO-8910PM細(xì)胞的增殖抑制率顯著提高，說明核桃楸提取物對(duì)卵巢癌HO-8910PM細(xì)胞的增殖具有抑制作用；其中短時(shí)間低濃度應(yīng)用Y1、Y3對(duì)卵巢癌細(xì)胞抑制作用不明顯，高濃度對(duì)細(xì)胞抑制作用較明顯，提示Y1、Y3的濃度依賴性明顯；而低劑量短時(shí)間應(yīng)用Y6對(duì)卵巢癌細(xì)胞抑制作用明顯，提示Y6的時(shí)間依賴性明顯。

綜上所述，核桃楸3種有效成分提取物α-羥基-四氫萘醌、4，8-二羥基萘酚-1-0-β-D-[6′-0-(3″，5″-二甲氧基-4″-羥基苯甲酰基)]葡萄糖苷和4，5，8-二羥基-ɑ-四氫萘醌-5-0-β-D-[6′-0-(4″-羥基-3″，5″-二甲氧基苯甲?；?]葡萄糖苷可以通過促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞增殖、增生以達(dá)到抗癌作用，為臨床治療卵巢癌提供了全新的思路和充分的理論依據(jù)。今后應(yīng)進(jìn)一步深入研究核桃楸促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制以及信號(hào)通路，為核桃楸治療卵巢癌的臨床應(yīng)用及推廣奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。