歐陽勝祥，姚文華，唐熙麟，李 青，朱慶妮，黃 睿，陳彥斌，金 威，龍 飛

(常德市林業(yè)科學(xué)研究所，湖南常德 415000)

白花龍(StyraxfaberiPerk.)為安息香科安息香屬植物，主要分布于我國長江流域以南各省區(qū)，生長在海拔100～600 m的低山區(qū)和丘陵灌叢中[1]。

湖南郴州、岳陽等地人們常用白花龍葉當(dāng)茶飲，飲用歷史達(dá)百年之久。已有的研究表明，安息香屬植物的花、葉、果均可入藥，具有清熱解毒、開竅行氣、活血止痛的作用，可治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、胃痛等[2]，并對預(yù)防皮膚衰老和治療皮膚癌等有重要作用[3]，其葉對鎘的去除也有明顯效果[4]。目前白花龍多為野生，對于白花龍葉中所含有的具體化學(xué)成分尚未見系統(tǒng)的文獻(xiàn)報道[5]，也一直未被深度開發(fā)利用。對白花龍葉片中的化學(xué)成分進(jìn)行研究，有利于充分開發(fā)這一植物資源在飲用和藥用方面的價值。本研究采用液相色譜-三重四級桿/飛行時間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對白花龍葉片的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，旨在為白花龍葉的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

野生白花龍樹葉，經(jīng)殺青、曬干制得。

1.2 儀器與試劑

AB 5600+三重四級桿飛行時間質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)；島津LC-30A液相色譜儀；高速低溫離心機(jī)(Sigma公司)；NC1500-T非接觸式超聲波處理器(上海歐河機(jī)械設(shè)備有限公司)。甲酸、乙腈為HPLC級，其他試劑為分析純，具體制備方法參照王軍[6]、李嘉蓉[7]等人的文獻(xiàn)。

1.3 色譜條件

色譜柱為C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫為35 ℃；流速為0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量為5 μL；流動相采用乙腈-0.2%甲酸水溶液的梯度洗脫程序(見表1)。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.4 質(zhì)譜條件

離子化模式為電噴霧正離子模式，離子源電壓 5 500 V，離子源溫度600 ℃，去簇電壓(DP)100 V，碰撞能量(CE)35 eV，碰撞能量擴(kuò)展(CES)為15 eV。霧化氣體為氮氣，輔助氣1為60 PSI，輔助氣2為50 PSI，氣簾氣為40 PSI。一級質(zhì)譜母離子掃描范圍為50～1 000，在IDA設(shè)置響應(yīng)值超過100 cps的6個最高峰進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍為50～1 000，開啟動態(tài)背景扣除(DBS)。

離子化模式為電噴霧負(fù)離子模式，離子源電壓 -4 500 V，離子源溫度500 ℃，去簇電壓(DP)100 V，碰撞能量(CE)-35 eV，碰撞能量擴(kuò)展(CES)為15 eV。霧化氣體為氮氣，輔助氣1為60 PSI，輔助氣2為50 PSI，氣簾氣為40 PSI。一級質(zhì)譜母離子掃描范圍為50～1 000，在IDA設(shè)置響應(yīng)值超過100 cps的6個最高峰進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍為50～1 000，開啟動態(tài)背景扣除(DBS)。

1.5 供試品制備方法

取白花龍干燥葉片粉碎得粉末，取粉末0.5 g于10 mL玻璃試管內(nèi)，加入5 mL 50%甲醇-水溶液浸泡4 h，然后40 ℃超聲40 min；取此中藥提取液2 mL于2 mL離心管內(nèi)，以2 000 r·min-1低溫(4 ℃)離心10 min，過0.22 μm微孔濾膜后裝入1.5 mL自動進(jìn)樣瓶，得到中藥提取物樣品。同樣條件得到空白對照樣品。將樣品放入4 ℃冰箱保存，在分析前取出(保存時間不能超過24 h)。

1.6 數(shù)據(jù)分析方法

通過文獻(xiàn)調(diào)研，查找了文獻(xiàn)報道的安息香科植物常見化學(xué)成分及植物常見萜類、酚酸類、黃酮類、蒽醌類、脂肪酸類、生物堿類、木脂素、香豆素類、苷類、維生素及氨基酸等化學(xué)成分，采用液相色譜-三重四級桿-飛行時間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，將所獲得的化合物精確分子質(zhì)量、碎片離子峰、色譜保留時間與數(shù)據(jù)庫中的化學(xué)成分進(jìn)行匹配，并結(jié)合METLIN數(shù)據(jù)庫和HMDB數(shù)據(jù)庫，定性分析白花龍葉的化學(xué)成分。

2 結(jié)果與分析

擬定分析條件下，白花龍葉甲醇超聲提取液中化學(xué)成分正負(fù)離子模式下總離子流圖見圖1。

圖1 C19050093-01提取物與空白正離子(A)、負(fù)離子(B)全掃描總離子流圖

對總離子流圖中的一級質(zhì)譜信號較強(qiáng)的譜峰進(jìn)行二級質(zhì)譜分析得到特征碎片，進(jìn)一步獲得化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。通過質(zhì)譜提供的準(zhǔn)確分子質(zhì)量推導(dǎo)出化合物的分子式，再依據(jù)特征碎片二級質(zhì)譜圖信息，與相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對，并結(jié)合METLIN數(shù)據(jù)庫和HMDB數(shù)據(jù)庫，共推測出54種成分，結(jié)構(gòu)類型可分為 13類(見表2)。

表2 白花龍葉甲醇-水提物正負(fù)離子模式鑒定結(jié)果

(續(xù)表2)

2.1 黃酮類化合物

從白花龍葉中鑒定出9種化合物：忍冬苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素、蘆丁、柚皮素、鼠李素、白前苷B、黃腐酚。其保留時間分別為6.238、8.447、8.243、8.182、3.527、12.552、7.589、9.392、14.473 min，相對分子量分別為594.5、302.2、286.2、270.2、610.5、272.3、316.3、448.4、354.4。忍冬苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素、蘆丁、柚皮素、鼠李素、白前苷B、黃腐酚在二級質(zhì)譜圖中對應(yīng)出現(xiàn)的碎片峰分別為m/z255、285、284，m/z303、257，m/z153、213、287，m/z115、141、197，m/z283、285、255，m/z119、117，m/z217、245、302，m/z447、448、449，m/z137、151、203、307。根據(jù)結(jié)果分析，參考文獻(xiàn)[8]得出皆為黃酮類化合物。

2.2 氨基酸類化合物

氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，同時也是重要的活性物質(zhì)，在反相色譜中保留弱。本研究通過待測物的精確分子質(zhì)量、分子式和一級二級質(zhì)譜圖等信息，結(jié)合文獻(xiàn)[8-9]的研究，共鑒定出苯丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、纈氨酸、脯氨酸這7種氨基酸。

2.3 酚類物質(zhì)

酚類物質(zhì)一般極性較大，在反相色譜中保留較弱，由于存在苯環(huán)等大共軛體系，一般具有較強(qiáng)的紫外吸收。本實驗經(jīng)HPLC二級管陣列檢測器的全波長掃描，結(jié)合文獻(xiàn)[8-10]的報道，對質(zhì)譜鑒定結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。共鑒定出沒食子兒茶素、去甲氧基姜黃素和去氫二異丁香酚3種酚類物質(zhì)。

2.4 香豆素類物質(zhì)

香豆素類化合物具有抗HIV、抗癌、降壓、抗心律失常、抗骨質(zhì)疏松、鎮(zhèn)痛、平喘及抗菌等多方面生物學(xué)活性，本實驗以圖譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，參照文獻(xiàn)[11-13]，共鑒定出6種香豆素類物質(zhì)：二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、8-甲氧基異歐前胡內(nèi)酯、東莨菪苷、歐前胡素、紫花前胡素、羥甲香豆素。

2.5 有機(jī)酸類物質(zhì)

根據(jù)文獻(xiàn)[8,10,14]，結(jié)合本實驗的波譜數(shù)據(jù)，共鑒定出9種有機(jī)酸物質(zhì)：5-(9H-fluoren-9-yl-methoxy)-5-oxop-entanoic acid、肉桂酸、苯甲酸、香草酸、亞麻酸、亞油酸、膽酸、軟脂酸、D-葡萄糖醛酸。

2.6 木脂素類物質(zhì)

木脂素類物質(zhì)是安息香屬植物中文獻(xiàn)報道最多的一類化合物，從根、莖、種子中都曾分離得到過，但未見到從葉中分離得出的報道。在本實驗基礎(chǔ)上，結(jié)合[9,15-16]等文獻(xiàn)，鑒定出6種木脂素類物質(zhì)：桉葉素、襄五脂素、木蘭脂素、異紫杉脂素、松脂素、落葉松樹脂醇。

2.7 其他類型化合物

利用LC-ESI-TOF-MS/MS所顯示的紫外吸收光譜、保留時間、分子式和質(zhì)譜碎片信息，結(jié)合文獻(xiàn)[9,15,17]，鑒定了4種酯類物質(zhì)：肉桂酸苯丙酯、水楊酸甲酯、桂酸桂酯、苯甲酸乙酯；結(jié)合文獻(xiàn)[18]，鑒定了5種糖類：蔗糖、葡萄糖、鼠李糖、龍膽二糖、水蘇糖四水合物；參照文獻(xiàn)[8-9]，鑒定了安息香屬植物報道較多的醛類物質(zhì)香草醛；依照文獻(xiàn)[15]，鑒定出曾在安息香樹枝和根莖中鑒定到的萜類物齊墩果酸；參照文獻(xiàn)[19-20]，鑒定出苯丙酸類阿魏酸；結(jié)合文獻(xiàn)[25]，獲得苷類物質(zhì)苔黑酚龍膽二糖苷；參考文獻(xiàn)[21-23]，鑒定出維生素PP(煙酸)。

3 討論

高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)具有樣品處理簡單、用量少，快速高效、靈敏度高等特點，依據(jù)高分辨率和精準(zhǔn)分子質(zhì)量及一、二級質(zhì)譜峰提供的碎片信息，使定性分析的準(zhǔn)確度得到大幅提高，是植物化學(xué)成分分析的重要手段。但該技術(shù)還存在一定的局限性，比如在同分異構(gòu)體的辨別和質(zhì)譜碎片的裂解途徑等方面不能獲得精準(zhǔn)的結(jié)果，還需要結(jié)合其他技術(shù)手段或資料，才能得到最終的確認(rèn)。

白花龍葉泡茶飲用，具有似薄荷般清涼的口感，并能快速祛痰、平喘，在民間已有上百年的飲用歷史。但對白花龍的研究非常少，近年來才有人對其栽培繁育[24-26]、園林綠化[27]方面進(jìn)行研究探索，而對于白花龍葉中所含有的具體化學(xué)成分還未見系統(tǒng)的研究報道。本研究對白花龍葉中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，證實了其中含有許多對人體有保健作用的成分，從而也解釋了湖南民間有人長期用其泡茶的緣由。針對這些特殊化學(xué)成分的含量和保健功效，有待于做進(jìn)一步的定量研究和活性分析。