王雨晴陳志剛張斯佳王榮亮羅玉敏趙海蘋*

(1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院,腦血管病研究室,北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院,腦病一科,北京 100078)

神經(jīng)干細胞(neual stem cells, NSCs)是存在于神經(jīng)系統(tǒng)中,具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的潛能以及自我更新能力的細胞群。 上世紀60 年代科學家發(fā)現(xiàn)成體哺乳動物腦內(nèi)一些區(qū)域分布著神經(jīng)干細胞,即神經(jīng)再生區(qū)域。 目前成體大腦內(nèi)公認的神經(jīng)再生區(qū)域主要為側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subependymal ventricular zone,SVZ)以及海馬齒狀回顆粒下區(qū)(subgranular zone, SGZ)。 其中SVZ 區(qū)的神經(jīng)干細胞在增殖分化為不同的子代后可遷移至腦內(nèi)其他區(qū)域,在損傷后的神經(jīng)功能恢復中具有重要意義。 影響NSCs 增殖及分化的方式包括調(diào)節(jié)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子、改變神經(jīng)發(fā)生微環(huán)境以及激活胞外Eph/ephrin、Notch、Wnt/β-catenin、PI3K/Akt 多種信號通 路 等[1-4]。 研究表明, 促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)對腦缺血具有神經(jīng)保護作用,體內(nèi)體外實驗均證明EPO 具有促進神經(jīng)干細胞分化的作用, EPO 主要通過 EPOR( erythropoietin receptor ) 和βCR ( β-common receptor)組成同二聚體和異二聚體的受體發(fā)揮作用,但是具體介導神經(jīng)干細胞分化的受體類型還不清楚。 眾所周知,MAPK 級聯(lián)反應(yīng)幾乎控制著所有細胞功能,包括適應(yīng)、增殖、分化、存活、凋亡等。 PBK(PDZ-binding-kinase)是絲裂原活化蛋白激酶MAPKK 家族的新成員,有研究表明PBK對腦缺血具有一定的保護作用[5-6]。 然而PBK是否參與缺血性損傷后神經(jīng)再生即神經(jīng)干細胞的分化目前尚不清楚。 在本實驗中我們通過原代神經(jīng)干細胞氧糖剝奪模型(oxygen and glucose deprivation,OGD)初步分析了神經(jīng)干細胞向不同成熟神經(jīng)細胞方向分化的趨勢以及EPO 受體和PBK 與神經(jīng)細胞標志物表達的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6 孕鼠1 只,孕齡為12～14 d,體重23 g 左右,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京) 2016-0006],實驗于首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院腦血管病實驗室動物實驗屏障設(shè)施中進行[SYXK(京)2015-0016]。 動物實驗中涉及的動物所有操作程序已經(jīng)得到首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院實驗動物管理和使用委員會的批準(XWH20190603),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F12、Neurobasal 培養(yǎng)基,購于Invitrogen公司；TRIzol 試劑、無RNA 酶的水、無RNA 酶的糖原購于Invitrogen life technologies；三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、溴化乙錠(ethidium bromide,EB)購于華美生物工程公司；乙酸鈉、甲醛、氯仿、異丙醇、100%乙醇購于上?；瘜W試劑有限公司；甲醛上樣染液購于Ambion；瓊脂糖購于生工生物工程有限公司；RNA 酶抑制劑購于Epicentre；SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase、 5 × RT 緩沖液購于Invitrogen；2.5 mmol/L dNTP 混合液購于HyTest Ltd；2×PCR master mix 購于Arraystar。

潔凈工作臺(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；DK-8D 型電熱恒溫水槽(上海森信實驗儀器有限公 司)； Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems)；ViiA 7 Real-time PCR System (Applied Biosystems)。

1.3 實驗方法

1.3.1 神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)和分組

參照文獻[7-10]選擇孕齡為12～14 d 的C57BL/6孕鼠,斷頸處死后取出胚胎置于清潔的PBS 中,分離胚胎腦的皮層神經(jīng)干細胞,用0.25%胰酶消化5 min 后離心除去胰酶,加入含DNase 的培養(yǎng)基輕柔吹打細胞團塊至單細胞狀態(tài),900 r/min 離心4 min后用完全培養(yǎng)基(DMEM/F12+Neurobasal+B27+PS+GlutaMax+EGF+FGF)重懸,后接種于低吸附六孔培養(yǎng)板。 2 ～3 d 后傳代,用Accutase 消化神經(jīng)球至單細胞,后離心除去Accutase,完全培養(yǎng)基重懸細胞并繼續(xù)置于低吸附六孔培養(yǎng)板。 連續(xù)傳代兩次后收集細胞,消化至單細胞后接種至PDL 包被過的細胞板,使細胞在單層貼壁狀態(tài)下生長。 將細胞分為6組,即對照(control)組,OGD/R 處理后1 h 組,2 h組,4 h 組,6 h 組以及8 h 組。 每組3 孔細胞。

1.3.2 神經(jīng)干細胞氧糖剝奪/復氧(OGD/R)模型

將單層貼壁原代神經(jīng)干細胞換至無糖培養(yǎng)基中并置于密閉缺氧盒中,向盒內(nèi)持續(xù)通入95%N2+5%CO2的混合氣體5 min,使盒內(nèi)的空氣被完全置換成不含氧氣的混合氣體。 將缺氧盒置于37℃培養(yǎng)箱,3 h 后將細胞板從缺氧盒中取出并將培養(yǎng)基置換成完全培養(yǎng)基(DMEM/F12+Neurobasal+B27+PS+GlutaMax+EGF+FGF),放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),后分別于不同時間點(OGD/R 后1 h、2 h、4 h、6 h、8 h)收集細胞。

1.3.3 RT-PCR 法檢測轉(zhuǎn)錄水平

分別于OGD 3 h 復氧后不同時間點收集神經(jīng)干細胞,采用TRIzol 法提取RNA,使用NanoDrop?ND-1000 測定RNA 濃度和純度。 根據(jù)SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase 試劑盒進行cDNA 合成。 使用Primer 5.0(英駿生物技術(shù)有限公司)設(shè)計引物,β-actin(Actb)做為內(nèi)參(見表1)。 使用2×PCR master mix 試劑盒及ViiA 7 Real-time PCR System 進行實時定量PCR 檢測2',3'-環(huán)核苷酸3'-磷酸二酯酶(Cnp)、髓鞘堿性蛋白(Mbp)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Gfap)、中樞神經(jīng)特異性蛋白(S100b)、神經(jīng)元核抗原(Rbfox3)、微管相關(guān)蛋白2(Map2)、微管蛋白(Tubb3)、促紅細胞生成素受體(Epor)、共β亞基異源受體(Csf2rb)以及PDZ 連接激酶(Pbk)的轉(zhuǎn)錄水平。 技術(shù)重復3 次。

表1 引物列表Table 1 List of primers

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 以及GraphPad Prism 8.0 軟件分析數(shù)據(jù)及作圖。 組間比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA),結(jié)果以平均數(shù)±標準誤差(ˉx±sˉx)表示。 相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)檢驗。 以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 OGD 處理促進神經(jīng)干細胞向少突膠質(zhì)細胞方向分化

神經(jīng)干細胞OGD 3 h,分別于復氧后1 h、2 h、4 h、6 h、8 h 收集細胞,用RT-PCR 檢測少突膠質(zhì)細胞標志物CNP 及MBP 的基因表達。 結(jié)果提示在OGD復氧后各時間點,Cnp及Mbp的表達水平較control組均有升高的趨勢,在OGD 復氧后4 h 時Cnp升高最為顯著,與control 組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(見圖1)。 綜上,缺氧缺糖損傷增加了神經(jīng)干細胞向少突膠質(zhì)細胞方向的分化。

2.2 OGD 促進神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞方向分化

神經(jīng)干細胞OGD 3 h,分別于復氧后1 h、2 h、4 h、6 h、8 h 收集細胞,用RT-PCR 檢測星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP 及S100B 的基因表達。 神經(jīng)干細胞OGD 復氧后2 h 和6 hGfap的表達水平顯著降低,8 h表達水平顯著升高,與control 組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；各時間點S100b的表達水平均有升高,2 h、4 h、6 h、8 h 與control 組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(見圖2)。

2.3 OGD 處理減少了神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向的分化

神經(jīng)干細胞OGD 3 h,分別于復氧后1 h、2 h、4 h、6 h、8 h 收集細胞,用RT-PCR 檢測神經(jīng)元標志物RBFOX3、MAP2 以及TUBB3 的基因表達。 OGD 復氧后2～8 h 三者的mRNA 表達水平均有降低,其中Rbfox3 及Tubb3 在2 h、4 h、6 h 時降低最為顯著且與control 組相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(見圖3)。 綜上,OGD 損傷減少了神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化從而損傷神經(jīng)元再生。

2.4 Epor 及Pbk 的轉(zhuǎn)錄水平與少突膠質(zhì)細胞分化呈正相關(guān)

神經(jīng)干細胞OGD 3 h,分別于復氧后1 h、2 h、4 h、6 h、8 h 收集細胞,用RT-PCR 檢測信號分子EPOR、CSF2RB(βCR)以及PBK 的基因表達情況。與control 組相比,Epor和Csf2rb在神經(jīng)干細胞OGD復氧后1 h 有降低趨勢,4 h、6 h、8 h 時有升高趨勢；Pbk在神經(jīng)干細胞OGD 復氧后各時間點表達均降低,其中1 h 及8 h 較為顯著,與control 組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(見圖4)。

通過分析比較三類神經(jīng)細胞分化標志物與三種信號分子的轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)性,我們發(fā)現(xiàn)EPOR 與少突膠質(zhì)細胞標志物CNP 的基因表達呈正相關(guān)(r＝0.52,P＜0.05)；蛋白激酶PBK 與少突膠質(zhì)細胞標志物CNP、MBP 的基因表達也呈正相關(guān)(r＝0.51 和r＝0.5,P＜0.05)。 三種信號分子的基因表達與星形膠質(zhì)細胞標志物、神經(jīng)元標志物均無明顯的相關(guān)性(圖5、圖6)。 以上結(jié)果表明EPOR 及PBK 可能參與神經(jīng)干細胞向少突膠質(zhì)細胞分化的過程。

3 討論

本實驗結(jié)果顯示缺氧缺糖損傷促進神經(jīng)干細胞向少突膠質(zhì)細胞以及星形膠質(zhì)細胞方向的分化,同時抑制其向神經(jīng)元方向的分化。 另外,本研究發(fā)現(xiàn)Epor以及Pbk的表達與少突膠質(zhì)細胞的分化呈正相關(guān),提示EPOR 與PBK 可能參與少突膠質(zhì)細胞新生。

少突膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要膠質(zhì)細胞之一,其主要功能是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中包繞軸突、形成絕緣的髓鞘結(jié)構(gòu)、協(xié)助生物電信號的跳躍式高效傳遞并維持和保護神經(jīng)元的正常功能。 少突膠質(zhì)細胞對氧化損傷、興奮性毒性和其他類型的缺血誘導損傷具有獨特的敏感性。 已有研究證實在缺血性中風急性期和亞急性期軸突均會發(fā)生快速和顯著的損傷[11-13]。 而卒中也會在一定程度上誘導軸突再生[14]。 在本實驗中少突膠質(zhì)細胞分子標志物CNP 的mRNA 水平在OGD/R 處理后4 h 明顯上升,證實了卒中后的軸突再生作用可能是由少突膠質(zhì)細胞新生的增強所引發(fā)。 軸突再生是損傷后神經(jīng)功能恢復的重要基礎(chǔ),因此促進軸突再生被視為缺血性卒中的治療策略之一。

本研究通過檢測OGD/R 后不同時間點各種細胞分化標志物與Epor、Csf2r(βCR)以及Pbk的轉(zhuǎn)錄水平并分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),少突膠質(zhì)細胞的標志物之一Cnp與受體Epor以及蛋白激酶Pbk的轉(zhuǎn)錄水平均呈正相關(guān),另一標志物Mbp與蛋白激酶Pbk的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)。 PBK 被證實在多個系統(tǒng)的惡性腫瘤組織中高表達,通過激活下游MAPK(p38、ERK、JNK)信號通路,對惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、治療預(yù)后起到重要作用[15-16]。 在腦缺血相關(guān)的研究中也同樣發(fā)現(xiàn)MAPK 及上游MAP2K、MAP3K 具有新的潛在藥物靶點[17]。 研究證明大鼠缺血24 h 腦組織芯片中,PBK 的mRNA 水平變化較其上游MAP3Ks、其他MAP2Ks、下游MAPK 家族成員更為顯著[18]。在腦缺血-再灌注早期,TOPK(PBK)在大鼠腦缺血皮層神經(jīng)元中活化,可以起到抗氧化及神經(jīng)保護作用[5]。 以上研究證實PBK 能夠減輕缺血性神經(jīng)損傷。 EPOR 是一種廣泛表達的細胞表面受體,既往其形成的異源二聚體被認為主要參與介導EPO 促進紅系祖細胞生成成熟紅細胞,最近的研究表明EPO 除了具有造血活性外, 還具有廣泛的組織保護活性。 它可作用于機體除造血細胞外的多種組織和細胞, 包括神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、腎等, 通過減少細胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)、促進血管生長、促進功能恢復等發(fā)揮其保護作用[19-20]。 CSF2RB 通過與EPOR 相關(guān)聯(lián)形成EPO 敏感的組織保護性異質(zhì)二聚體受體進行信號傳導,起到神經(jīng)保護作用[21-22]。 我們的實驗結(jié)果進一步提示PBK、EPOR 可能參與缺血性損傷后神經(jīng)干細胞向少突膠質(zhì)細胞方向的分化,即少突膠質(zhì)細胞新生的過程,從而促進了卒中后軸突再生以及神經(jīng)功能恢復。 兩個分子之間是否存在作用關(guān)系尚需進一步的研究探討。

圖1 Cnp、Mbp 在神經(jīng)干細胞OGD/R 后不同時間點的表達水平Note.A, The gene expressions of oligodendrocyte marker CNP in neural stem cells at different time points after OGD 3 h/reoxygenation were compared.B, The gene expressions of oligodendrocyte marker MBP in neural stem cells at different time points after OGD 3 h/reoxygenation were compared. Cnp, 2', 3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase gene. Mbp, Monobutyl phthalate gene.Compared with the control group, *P＜0.05.Figure 1 Expression levels of Cnp and Mbp at different time points after OGD/R in neural stem cells

圖2 Gfap、S100b 在神經(jīng)干細胞OGD/R 后不同時間點的表達水平Note.A, The gene expressions of astrocyte marker GFAP in neural stem cells at different time points after OGD 3 h/reoxygenation were compared.B,The gene expressions of astrocyte marker S100B in neural stem cells at different time points after OGD 3 h/reoxygenation were compared. Gfap, Glial fibrillary acidic protein gene. S100b,S100 beta protein gene.Compared with the control group, *P＜0.05.Compared with the control group, **P＜0.01.Figure 2 Expression levels of Gfap and S100b at different time points after OGD/R in neural stem cells

圖3 Rbfox3、Map2 以及Tubb3 在神經(jīng)干細胞OGD/R 后不同時間點的表達水平Note.A, The gene expressions of neuron marker RBFOX3 in neural stem cells at different time points after OGD 3 h/reoxygenation were compared.B, The gene expressions of neuron marker MAP2 in neural stem cells at different time points after OGD 3 h/reoxygenation were compared.C, The gene expressions of neuron marker TUBB3 in neural stem cells at different time points after OGD 3 h/reoxygenation were compared. Rbfox3, Neuronal nuclear protein gene. Map2, Microtubule-associated protein-2 gene. Tubb3, Beta III-tubulin gene.Compared with the control group, *P＜0.05.Figure 3 Expression levels of Rbfox3, Map2 and Tubb3 at different time points after OGD/R in neural stem cells

圖4 Epor、Csf2rb 以及Pbk 在神經(jīng)干細胞OGD/R 后不同時間點的表達水平Note.A,The gene expressions of the signal molecule EPOR in neural stem cells at different time points after OGD 3 h/reoxygenation were compared.B, The gene expressions of the signal molecule CSF2RB in neural stem cells at different time points after OGD 3 h/reoxygenation were compared.C,The gene expressions of the signal molecule PBK in neural stem cells at different time points after OGD 3 h/reoxygenation were compared. Epor,Erythropoietin receptor gene. Csf2rb,Common beta-subunit heteroreceptor gene. Pbk, PDZ-binding-kinase gene.Compared with the control group,*P＜0.05.Figure 4 Expression levels of Epor、Csf2rb and Pbk at different time points after OGD/R in neural stem cells

圖5 各類細胞標志蛋白與信號分子EPOR 的相關(guān)性分析Note.A, Expression levels of Epor at different time points after OGD/R in neural stem cells.B, Correlation between Epor and Cnp. C,Correlation between Epor and Mbp. D, Correlation between Epor and Gfap. E, Correlation between Epor and S100b. F, Correlation between Epor and Rbfox3. G, Correlation between the Epor and Map2. H, Correlation between the Epor and Tubb3.Figure 5 Correlation analysis of cell marker proteins with signal molecule EPOR

星形膠質(zhì)細胞起支持和分隔神經(jīng)細胞的作用。GFAP 是一種Ⅲ型中間絲狀蛋白,參與細胞骨架的構(gòu)成并維持其張力強度,是星形膠質(zhì)細胞活化的標志物[23]。 S100B 蛋白主要在星形膠質(zhì)細胞中表達,其過量釋放可促進腦損傷后神經(jīng)炎癥反應(yīng)的激活和進展[24]。 本實驗結(jié)果提示神經(jīng)干細胞缺氧缺糖后2 h 和6 hGfap的表達減少,8 h 時表達升高；S100b的表達水平則于神經(jīng)干細胞損傷后逐漸增加,6 h 時達到最高,8 h 時較前稍有下降。 既往學者研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞損傷后S100B的總體表達呈單峰變化趨勢,損傷后6 h 達到高峰,具有時序性變化的規(guī)律[25]。 大鼠腦缺血再灌注后S100B 和GFAP 的表達時間變化關(guān)系研究也有說明,缺血再灌注早期S100B 可因星形膠質(zhì)細胞受損而滲漏到外周微環(huán)境,進而刺激其合成水平上升,表達增加且呈雙峰趨勢；而GFAP 則于S100B 達高峰后,反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞開始參與損傷后修復和膠質(zhì)瘢痕形成時表達增加[26]。 結(jié)合本研究實驗結(jié)果考慮缺血性損傷后神經(jīng)干細胞可向星形膠質(zhì)細胞分化,參與炎癥反應(yīng),繼而發(fā)生凋亡、壞死。 8 h后更多的星形膠質(zhì)細胞生成、激活,成為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞參與到膠質(zhì)瘢痕的形成。 后續(xù)我們可以進一步探究神經(jīng)干細胞氧糖剝奪/復氧8 h 以后的星形膠質(zhì)細胞標志物變化情況。

圖6 各類細胞標志蛋白與信號分子PBK 的相關(guān)性分析Note.A, Expression levels of Pbk at different time points after OGD/R in neural stem cells.B, Correlation between Pbk and Cnp. C,Correlation between Pbk and Mbp. D,Correlation between Pbk and Gfap. E, Correlation between Pbk and S100b. F,Correlation between Pbk and Rbfox3. G, Correlation between Pbk and Map2. H, Correlation between Pbk and Tubb3.Figure 6 Correlation analysis of cell marker proteins with signal molecule Pbk

大量研究結(jié)果已表明缺血性腦損傷后成體神經(jīng)再生作用增強,對神經(jīng)功能的恢復具有促進作用[27-28]。 然而其機制目前尚不清楚。 在本實驗中,利用體外神經(jīng)干細胞氧糖剝奪模型模擬缺血性腦損傷后神經(jīng)干細胞的變化。 結(jié)果顯示OGD/R 后2～6 h 神經(jīng)元的再生被抑制,表明腦缺血會直接抑制成體神經(jīng)再生,即缺血后成體神經(jīng)再生的增強并不是由缺血刺激直接引發(fā)的,可能是由周圍微環(huán)境的變化引起。 具體的作用機制還需要進一步探究。

綜上所述,本實驗結(jié)果提示缺氧缺糖損傷顯著促進了少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞新生,同時抑制了神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向的分化。 轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果提示EPOR 以及PBK 可能參與神經(jīng)干細胞向少突膠質(zhì)細胞方向的分化,為進一步研究缺血后神經(jīng)再生機制提供了基礎(chǔ)。 未來的研究應(yīng)繼續(xù)探討EPOR 以及PBK 參與缺血后少突膠質(zhì)細胞再生的機制以及其他的調(diào)節(jié)通路,為臨床轉(zhuǎn)化提供更多可干預(yù)的分子靶點。