吳獻賢劉 星張 娜李雨涵杜星辰楊志偉*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所, 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心, 國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室, 北京 100021； 2.北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術(shù)研究中心, 北京 100021；3.寧夏醫(yī)科大學(xué),銀川 750004)

動脈瘤為主動脈的病理性擴張,擴張的主動脈直徑超過正常動脈直徑的50%即可被定義為動脈瘤。 根據(jù)動脈瘤出現(xiàn)的解剖位置不同,可分為胸主動脈瘤(thoracic aortic aneurysm, TAA)和腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm),其中腹主動脈瘤最為常見[1]。 AAA 的發(fā)生與衰老,性別,動脈粥樣硬化和吸煙有關(guān),但與遺傳關(guān)聯(lián)較弱。 動脈瘤破裂是動脈瘤最危險的并發(fā)癥,是引發(fā)致死的主要原因[2]。 當(dāng)前,開放手術(shù)修復(fù)和血管內(nèi)修復(fù)是唯一被廣泛使用的治療主動脈瘤的方法,尚無用于治療這種破壞性疾病的有效藥物[3-4]。 盡管對于AAA 的研究已長達數(shù)十年,但AAA 的發(fā)病機制并不十分清楚。 因此,闡明這種疾病的分子基礎(chǔ),找到新的治療靶點,開發(fā)有效抑制動脈瘤發(fā)生發(fā)展的有效藥物仍是動脈瘤研究的重點問題。

實驗動物模型是研究動脈瘤發(fā)病機制、開發(fā)有效治療藥物的重要工具。 通過遺傳操作或化學(xué)試劑誘導(dǎo)的多種主動脈瘤小鼠模型廣泛應(yīng)用于動脈瘤相關(guān)研究中。 這些動物模型和人類動脈瘤相比,都有其相應(yīng)的缺點,比如常用的血管緊張素II 誘導(dǎo)的小鼠動脈瘤模型就需要在ApoE 或者是LDLR 敲除的背景下實現(xiàn)[5]。 近年來有研究報道給予醋酸脫氧皮質(zhì)酮(DOCA)或醛固酮加高鹽處理三周能誘導(dǎo)10 月齡小鼠動脈瘤的形成,并且該方法誘導(dǎo)的動脈瘤和人類動脈瘤有很多相似之處[6]。 盡管該模型強調(diào)了鹽皮質(zhì)激素受體激動劑及高鹽在動脈瘤中的作用[7],但是關(guān)于其內(nèi)在機制有待探究,并且DOCA 加高鹽誘導(dǎo)動脈瘤的形成是否和誘導(dǎo)時間有關(guān)也許進一步驗證。

因此,本研究采用10 月齡C57BL/6J 小鼠,并通過DOCA 加高鹽分別處理一周,兩周,三周,觀察DOCA 加高鹽處理不同時間對動脈瘤形成的影響,并檢測不同時間點動脈病理結(jié)構(gòu)變化,炎癥細胞浸潤情況,炎癥因子的表達,并通過RNA 測序找到差異表達的基因及相關(guān)信號通路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠,120 只,10 月齡,體重(30±5)g,由北京維通利華實驗動物中心提供[SCXK(京)2016-0009]。 實驗動物在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所屏障環(huán)境動物設(shè)施中開展[SYXK(京)2015-0035]。 與實驗動物相關(guān)的操作已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準( ILASYZW2017007)。 實驗過程中嚴格遵循使用實驗動物的3R 原則,給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

DOCA 緩釋藥片(50 mg,21 d 釋放)購自美國Innovative Research of America；CD3 單克隆抗體(sc- 20047) 購 自 美 國 Santa Cruz 公 司； CD68(ab201340)單克隆抗體購自英國abcam,ly6B.2(MCA771GA)單克隆抗體購自美國BIO-RAD；熒光二抗Goat Anti-Mouse IgG H＆L (Alexa Fluor? 488)(ab150113)、 Goat Anti-Rat IgG H＆L (Alexa Fluor?488) (ab150157) and Goat Anti-Rabbit IgG H＆L(Alexa Fluor ? 568) (ab175471) 均 購 自 英 國abcam；Masson 染色試劑盒及彈力纖維試劑盒均購自中國北京索萊寶；兔超敏二步法試劑盒購自中國中杉金橋(PV9001)；DAB 顯色試劑盒購自中國中杉金橋(ZLI-9019)；PCR 引物及TRIzol 購自美國Invitrogen 公司；DEPC 水購自美國QIAGEN 公司；PCR 儀購自美國Bio-Rad 公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix (RR036A)購自日本TaKaRa 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

將10 月齡C57BL/6J 小鼠隨機分為兩組：高鹽組(HS),DOCA 加高鹽組(DOCA+HS)。 DOCA 給藥方式為背部皮下植入DOCA 緩釋藥片(50 mg,21 d 釋放),高鹽給予方式為鹽水喂養(yǎng)(含0.9% NaCl和0.2% KCl 的水)。 各組在經(jīng)過不同處理1 周,2周,3 周時分別取20 只小鼠采用異氟烷麻醉后進行小動物超聲并取材。

1.3.2 小動物超聲

給藥結(jié)束后,小鼠采用2%異氟烷吸入麻醉,使用脫毛膏將小鼠腹部毛發(fā)去除。 將小鼠仰臥位固定,在其腹部涂抹超聲透射凝膠。 將探頭置于腹部,輕微調(diào)整探頭以找到腹主動脈腎上節(jié)段,獲取相同節(jié)段M 型動脈超聲圖像,使用“門三聯(lián)征”(肝動脈,肝靜脈和膽管)作為解剖標記,以評估每只小鼠相同位置的橫斷面圖像。 測定并統(tǒng)計各組小鼠腎上腹主動脈處血管內(nèi)徑。

1.3.3 HE 染色

染色前,將組織切片用二甲苯徹底脫蠟,經(jīng)過梯度乙醇(無水乙醇,95%,80%)水洗后,再用水洗。然后用蘇木精染液染3 ～5 min,自來水洗1 min 后,用75%鹽酸乙醇液分化數(shù)秒鐘,后使用藍化液返藍,然后用0.5%伊紅水溶液染色1 min,經(jīng)乙醇脫水,二甲苯透明后,中性樹膠封片。

1.3.4 Masson 染色

染色前,將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。 采用改良Masson 三色染色液試劑盒對動脈組織中的膠原纖維進行染色,染色后膠原纖維呈藍色,肌纖維和細胞質(zhì)呈紅色。

1.3.5 EVG 染色

染色前,將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。 采用Weigert 彈力纖維染色液試劑盒對主動脈壁的彈力纖維進行染色,觀察各組彈力纖維的斷裂情況。

1.3.6 免疫組織化學(xué)法

將小鼠腹主動脈組織用10%福爾馬林固定,固定后用石蠟包埋。 包埋后的組織塊進行切片(4 μm),之后將組織切片用二甲苯脫蠟后在不同濃度梯度乙醇溶液中由高向低浸泡浸水,并使用0.3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。 然后用0.5%triton 敷育15 min 進行破膜,0.01 mol/L 的檸檬酸緩沖液(pH 6.0)修復(fù)抗原。 用羊血清封閉非特異性結(jié)合位點,然后用目標單克隆抗體(α-SMA)雜交,4℃溫育過夜。 用超敏二步法試劑盒孵育后DAB 顯色試劑盒鏡下顯色,蘇木素染色,鏡下觀察。對于檢測炎癥細胞浸潤的免疫熒光實驗,無需采用H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,并且和相應(yīng)的目標抗體雜交之后,采用熒光二抗進行敷育,DAPI 染核后封片,鏡檢。

1.3.7 RT-PCR

取少量動脈組織放入1.5 mL EP 管中,加入100 μL TRIzol, 用電動研磨棒研磨均勻后加入900 μL TRIzol 混勻,之后加入200 μL 氯仿,充分上下顛倒混勻后,冰上靜止3～5 min,13500 r/min,4℃離心15 min,取上清。 加入500 μL 異丙醇混勻后,冰上靜置10 min,13500 r/min離心10 min 棄上清。 加入1 mL DEPC 水稀釋的75%的乙醇,4℃, 12 000 r/min, 離心5 min, 棄上清,得RNA 沉淀。 將RNA 沉淀充分晾干后,加入適量的DEPC 水稀釋。 使用RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并用One-stop PCR 儀檢測相應(yīng)基因的mRNA 表達水平。采用2-△△CT方法檢測各個基因的相對表達水平。 本研究所用引物見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.8 轉(zhuǎn)錄組測序

采用TRIzol 法提取小鼠(HS 和DOCA+HS 處理3 周的小鼠)腹主動脈節(jié)段總RNA,利用Qubit 3.0進行RNA 定量,Agilent 2100 生物分析儀評估RNA提取質(zhì)量。 之后進行普通轉(zhuǎn)錄組建庫,文庫質(zhì)檢合格后,對文庫進行pooling,選擇Novaseq6000 上機測序。 測序?qū)嶒灱俺醪椒治鲇杀本┗萍加邢薰具M行。 以｜logFC ｜≥2 和Padj＜0.005 為閾值篩選差異表達的基因,并對差異表達的基因進行功能注釋。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad Prism 7.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標準誤差()。 兩組間比較采用Student'st檢驗,兩個因素的多重比較采用雙因素方差分析。 每組小鼠的存活率和成瘤率采用卡方檢驗。P＜0.05 認為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 DOCA 加高鹽處理不同時間對動脈瘤的誘導(dǎo)作用

小鼠腹主動脈超聲結(jié)果顯示,DOCA 加高鹽處理一周并未引起腹主動脈內(nèi)徑的擴張,處理兩周時可見腹主動脈擴張,處理三周時腹主動脈擴張更為明顯(圖1A),對主動脈進行拍照,并測量其外徑,統(tǒng)計動脈瘤發(fā)生率,發(fā)現(xiàn)DOCA 加高鹽處理一周未引起小鼠動脈主動脈外徑的擴張和瘤的形成,而處理兩周時主動脈明顯擴張,此時動脈瘤成瘤率為44%；處理三周后主動脈外徑增加更為明顯,此時動脈瘤成瘤率為65%(圖1B～1D)。

2.2 DOCA 加高鹽處理不同時間對膠原沉積、彈力纖維斷裂和平滑肌細胞降解的影響

本研究進一步對小鼠主動脈病理表型進行分析,HE 染色結(jié)果顯示DOCA 加高鹽處理兩周的小鼠出現(xiàn)了明顯的夾層動脈瘤,并且動脈外壁可見少量炎癥細胞,處理三周后夾層動脈瘤進一步擴大,動脈外壁見大量炎癥細胞(圖2A)。 Masson 染色結(jié)果顯示DOCA 加高鹽處理一周和兩周并沒有影響動脈外壁膠原沉積量,而處理三周后膠原沉積量有少量增多趨勢(圖2B)。 彈力纖維染色結(jié)果顯示,DOCA 加高鹽處理一周和兩周時均未引起彈力纖維的斷裂,而處理三周時可見彈力纖維斷裂現(xiàn)象(圖2C)。 免疫組化結(jié)果顯示,DOCA 加高鹽處理一周時,平滑肌細胞結(jié)構(gòu)完整,而處理兩周后α-SMA 出現(xiàn)大量降解, 三周后降解丟失現(xiàn)象更為明顯(圖2D)。

2.3 DOCA 加高鹽處理不同時間促進動脈組織炎癥細胞浸潤和炎癥因子的表達

之后檢測了動脈組織中浸潤的炎癥細胞類型,圖3A～C顯示DOCA 加高鹽處理一周時動脈組織中未見CD3+T 細胞,CD68+巨噬細胞和LY6B.2+中性粒細胞的浸潤,處理兩周時可見這三種類型細胞的浸潤,處理三種時浸潤的細胞進一步增多,其以CD3+T 細胞核CD68+的巨噬細胞為主,LY6B.2+中性粒細胞的浸潤較少。 進一步檢測動脈組織中炎癥因子的表達發(fā)現(xiàn),DOCA 加高鹽處理能促進炎癥因子(TNF-α,IL-1β,IL-6 和CCL-2)的表達,而抑制抗炎性因子(IL-10 和IL-13)的表達,且這種促進或抑制作用與處理時間高度相關(guān)(圖3D)。

圖1 DOCA 加鹽處理不同時間對動脈瘤形成的影響Note.HS,high salt.DOCA, Deoxycorticosterone acetate.A, Representative ultrasound images of abdominal aorta.B, Representative photographs of aortas.C,Quantification of the external diameter of abdominal aorta.Compared with HS group at the same time point,two-way ANOVA, *P＜0.05.D, The aortic aneurysm incidence, chi-square test, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 1 Effect of DOCA plus salt on the induction of aortic aneurysm in aged mice at different time points

圖2 DOCA 加高鹽處理不同時間對主動脈病理結(jié)構(gòu)的影響Note.α-SMA, α-smooth muscle actin.A, HE staining representative image.B, Masson staining representative image.C, Elastin staining representative image.D, α-SMA immunohistochemical representative image.Figure 2 Effect of DOCA plus salt on the vascular pathology of aged mice at different time points

2.4 RNA 測序分析DOCA 加高鹽處理三周小鼠動脈組織中差異表達基因的變化

為了進一步探究DOCA 加高鹽誘導(dǎo)小鼠動脈瘤發(fā)生的分子機制,我們對DOCA 加高鹽處理三周小鼠的腹主動脈組織RNA 進行測序分析,并和HS組進行比較。 圖4A 為差異表達基因的熱圖結(jié)果,圖4B 為差異表達基因的通路富集結(jié)果,可見上調(diào)基因主要富集在免疫、代謝、止血和中性粒細胞降解等途徑中,而下調(diào)基因則主要富集在信號傳導(dǎo)、脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)代謝和免疫系統(tǒng)。 圖4C 為止血、免疫、細胞外基質(zhì)重構(gòu)通路中的一些差異表達基因的熱圖。 從中我們發(fā)現(xiàn)和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的,介導(dǎo)白細胞與內(nèi)皮粘附的關(guān)鍵分子P-選擇素糖蛋白配體-1(PSGL-1)的表達明顯升高。

3 討論

主動脈瘤根據(jù)發(fā)病位置可分為胸主動脈瘤(TAA)和腹主動脈瘤(AAA)。 TAA 發(fā)生在所有年齡段的人,男女發(fā)病率相似,并且與遺傳因素高度相關(guān)。 相反,AAA 的發(fā)生與衰老,男性,動脈粥樣硬化和吸煙有關(guān),但與遺傳關(guān)聯(lián)較弱[8]。 小鼠腹主動脈瘤動物模型是研究腹主動脈瘤的重要工具,對闡釋腹主動脈瘤的病理生理學(xué)機制,研發(fā)和評價主動脈瘤的治療藥物都具有重要意義[9]。 本研究采用DOCA 加高鹽誘導(dǎo)腹主動脈瘤,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOCA 加高鹽處理不同時間對動脈瘤的形成有不同的效果,DOCA 加高鹽處理一周并不能誘導(dǎo)動脈瘤的生成,處理兩周時有小鼠開始形成動脈瘤,并且形成的動脈瘤不止局限于腹主動脈節(jié)段,胸主動脈也可見明顯的動脈瘤夾層。 DOCA 加高鹽處理三周時動脈瘤的發(fā)病率進一步升高,但是我們并沒有進一步延長處理時間觀察更長時間處理對動脈瘤發(fā)病率的影響。 因為三周時,開始有小鼠因為動脈瘤破裂死亡,死亡率高達35%。 進一步延長處理時間在增加小鼠成瘤率的同時,也必然加劇動脈瘤破裂的風(fēng)險。

在病理學(xué)上,AAA 的特征是動脈壁各層擴張,這可歸因于彈性蛋白的斷裂,平滑肌細胞凋亡,膠原蛋白的代償性沉積,炎癥細胞的浸潤,氧化應(yīng)激等[10-11]。 我們的研究發(fā)現(xiàn),DOCA 加高鹽處理兩周時雖然有小鼠開始形成動脈瘤,但此時膠原纖維沉積并沒有變多,彈性纖維也未出現(xiàn)斷裂,直到處理三周時才可見大量平滑肌細胞降解,膠原纖維沉積和彈性纖維斷裂現(xiàn)象,此結(jié)果提示彈力纖維斷裂和動脈瘤形成可能并不是因果關(guān)系,有可能是動脈瘤形成后才出現(xiàn)彈力纖維的斷裂,從而促進動脈管壁的進一步擴張。 而膠原纖維的沉積也是一種代償性沉積,當(dāng)DOCA 處理兩周時雖然已經(jīng)有膠原纖維的產(chǎn)生,但此時機體產(chǎn)生的蛋白水解酶可以降解這些膠原纖維,所以并未見大量膠原纖維沉積現(xiàn)象。而處理三周時,機體產(chǎn)生的蛋白水解酶不足以降解產(chǎn)生的膠原纖維,導(dǎo)致膠原纖維沉積增多。

以往研究表明炎癥在動脈瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義,慢性主動脈炎癥所導(dǎo)致的一系列蛋白水解酶(例如基質(zhì)金屬蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶)的釋放,以及氧化性自由基,炎癥因子的生成是引起主動脈中膜破壞以及血管平滑肌細胞凋亡和功能障礙的原因[12-13]。 炎癥反應(yīng)的發(fā)生離不開炎癥細胞的浸潤,浸潤的炎癥細胞包括T 細胞,B 細胞,巨噬細胞,粒細胞[14-15]。 我們的HE 染色結(jié)果初步顯示DOCA 加高鹽處理三周后動脈外壁有大量炎癥細胞浸潤。 進一步的研究發(fā)現(xiàn)浸潤的炎癥細胞以T 細胞和巨噬細胞為主,也有少量的粒細胞。DOCA 加高鹽處理一周、兩周和三周均能夠增加動脈組織炎癥因子表達水平,降低抗炎因子表達水平,但是只有在處理三周時這種變化才有顯著意義。 值得注意的是,雖然DOCA 加高鹽處理一周并沒有誘導(dǎo)動脈瘤的形成,但此時動脈組織中炎癥因子的表達已出現(xiàn)增加趨勢,抗炎因子的表達出現(xiàn)降低趨勢,提示DOCA 加高鹽誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在其誘導(dǎo)的動脈瘤發(fā)生中起著重要的作用。

本研究進一步的RNA 測序分析結(jié)果表明DOCA 加高鹽處理三周組和高鹽處理三周組相比,其差異表達的基因主要富集在免疫系統(tǒng)、信號傳導(dǎo)、代謝、止血等信號通路中,其中我們發(fā)現(xiàn)止血通路中的一個基因P-選擇素糖蛋白配體-1(PSGL-1)在DOCA 加高鹽處理三周后表達明顯增加,PSGL-1和炎癥的發(fā)生密切相關(guān),在各種白細胞表面廣泛表達,是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的起始步驟[16-18],我們以往的研究發(fā)現(xiàn)PSGL-1 和鹽敏感性高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19-20],但是關(guān)于PSGL-1 在動脈瘤中的作用還未見報道,探究PSGL-1 和動脈瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系是我們今后研究的方向。

圖3 DOCA 加鹽處理不同時間對炎癥細胞浸潤和炎癥因子表達的影響Note.A, CD3+T cells infiltration in arterial tissue.B, CD68+ macrophage infiltration in arterial tissue.C, LY6B.2+ granulocyte infiltration in arterial tissue.D, The mRNA expression levels of inflammatory factors and anti-inflammatory factors.Compared with HS group at the same time point, two-way ANOVA, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 3 Effect of DOCA plus salt on inflammatory cells infiltration, and on the expression of inflammatory cytokines of mice at different time points

圖4 RNA 測序分析結(jié)果Note.A, Heat map.B, GO enrichment analysis.｜logFC ｜≥2 and Padj＜0.005.C, Heatmap displaying some key differentially expressed genes enriched in hemostasis, immune system and extracellular matrix organization pathways.Figure 4 RNA sequence analysis result